第四章第四章 基因工程抗体基因工程抗体一、抗体的基因结构和重排二、基因工程抗体的构建和类型三、基因工程抗体的表达四、导向药物五、基因工程抗体的导向生物治疗一、抗体的基因结构和重排（一）重链V区基因人类VH（119）-D（30）-J（9）（二）轻链基因的结构和重排 如图19-2 链：V（100）、J（5）、C（1） 链： V （100）J（6） C（6）（三）重链C区基因 如图19-3 C-C-C3-C1-C2-C1-C2-C4-C-C2（四）人源性单抗的抗体组合（四）人源性单抗的抗体组合文库技术（文库技术（原理原理）1mRNA的提取 2RT-PCR制备cDNA 3抗体组合文库技术 4噬菌体表面呈现技术（phage display technology） 5阳性克隆的筛选二、基因工程抗体的构建和类型(一一)嵌合抗体嵌合抗体(ChimericAntibody) (二二)人源化抗体人源化抗体(Humanigedantibody) (三三)小分子抗体小分子抗体（四）（四）人源性单抗的抗体组合文库技术人源性单抗的抗体组合文库技术（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体鼠Ig的V区与人Ig的恒定区（C区）基因重组后，在原核细胞或真核细胞中表达，这种嵌合抗体含7580%人抗体，20%鼠抗体,注入人体后可减少人抗鼠抗体的反应。其优点是减少了鼠单抗的免疫原性，另外人抗体C区仍可有效地发挥补体激活和与FC受体结合的生物学活性，在构建时可以有目的地选择抗体类型，可有效地发挥抗体的生物效应，已有多种针对不同抗原的嵌合抗体的报道、但多为IgG1亚类。（二）人源化抗体（二）人源化抗体为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗体V区（H、L链）中的3个超变区基因插入人抗体的V区的框架（FR）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百分之百人源化了。目前针对不同抗原如肿瘤相应抗原、细胞表面受体、细胞因子等，已构建了许多种人源化基因工程抗体。 (三三)小分子抗体小分子抗体（1）单链抗体(Single Chain Fv ScFv) （2）重组Fab片断 （3）单域结构VH或VL （4）双特异性抗体 （5）免疫粘连素 （6）催化抗体 单链抗体单链抗体(Single Chain Fv ScFv);它是由抗体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。 重组Fab片断重组Fab片断是单价的VH-CH（Fd）和轻链的VL-CL两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的Fab与酶解Ig后所获得的Fab具有相同的功能。 单域结构VH或VL分别由单域VH或VL采用基因工程法构建的抗体组成，该类抗体构建简便，鉴于在抗原结合部位中，VH作用比VL大，大多数单独的VH保留了较好的抗原结合能力和专一性，单独VL抗体因只有一个功能区而没有抗原结合能力，无应用价值，因此单域VH抗体在制备和应上有其优点，然而由于暴露了原先与VL结合的疏水性，使其特异性降低，还需对VH片断做一些结构改造才能应用。 双特异性抗体双特异性抗体：将两个抗体的重链和轻链V区基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特异性抗体。如：将抗肿瘤细胞EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性抗体，有助于介导T细胞杀肿瘤（连接效-靶细胞）（如图19-4）。抗纤维蛋白的ScFv-tPA基因连接，有助于与血栓中的纤维蛋白结合，使tPA定位溶解血栓，此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤和心血管疾病。 免疫粘连素抗体恒定区（C区）N-端基因连接人细胞受体（CD4-FC）或粘附分子基因在真核细胞中表达正确折叠的抗体样融合蛋白（称免疫粘连素），N端为同一种分子称为同源二聚体结构。N端为两种不同的分子称异源二聚体结构。一方面可发挥抗体效应，另一方面N端CD4为T细胞亚类糖蛋白，又是HIV受体，CD4可与HIV结合由FC活性杀灭HIV，可阻断HIV感染T细胞。 催化抗体基因工程催化抗体是通过在轻链V区插入能与金属离子结合的氨基酸序列，再与重链V区重组，使重链V区识别抗原，并选择性地结合底物，轻链则可通过促进底物反应过渡态的形成而发挥催化作用。 三、基因工程抗体的表达(一一)在哺乳动物细胞（在哺乳动物细胞（CHO）中的表达）中的表达 (二二)在微生物在微生物(原核原核)细胞中的表达细胞中的表达 (三三)在植物中表达在植物中表达(四四)在酵母中表达在酵母中表达 四、导向药物导向药物是由单抗与放射性核素(诊断用)、毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定位点，发挥特意诊断和治疗作用。 五、基因工程抗体的导向生物治疗单克隆抗体作为诊断试剂，应用已相当普遍。但单抗作为生物导弹的治疗剂，鼠源性单抗常会因过敏反应而妖折，自基因工程抗体问世后，成为最有前景的发展领域。常用于溶栓、杀肿瘤、抗病毒感染、杀死耐药菌的生物治疗。甚至可用抗HIV的ScFv基因来阻止HIV复制等。随着噬菌体表面呈现技术的发展，抗体组合文库技术的成熟和推广应用，单抗的生物导弹功效将会有效发挥，其临床应用前景较为广阔，市场是巨大的，必将会产生巨大的社会和经济效益。 RT-PCR制备cDNA设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物进行RT-PCR抗体组合文库技术将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒或杆状噬菌体载体中建立文库噬菌体表面呈现技术（phage display technology） 将Fab或ScFv基因插入噬菌体外壳蛋白基因的g或g区先导序列下游，在噬菌体外壳表面呈现基因表达蛋白，如图19-5。阳性克隆的筛选当抗体Fab或ScFv在噬菌体外壳表面呈现后，可采用固相柱层吸附、洗脱、括增的富集性选择法从抗体库中筛选出阳性克隆（如图19-6），从中阳性克隆基因与表达载体重组进行表达。人源性单抗的抗体组合文库技人源性单抗的抗体组合文库技术的原理术的原理原理：模拟抗体多样性机制，把人B淋巴细胞谱中的L链基因和Fd基因以及VH-VL基因片段克隆并随机组合到粘粒或杆状噬菌体载体中建库(一一)在哺乳动物细胞（在哺乳动物细胞（CHO）中的表达中的表达将含Fd和L链基因的重组载体转染CHO细胞，分泌糖基化的rhAb（重组人抗体），可达50mg/L。(二二)在微生物在微生物(原核原核)细胞中的表达细胞中的表达1.分泌型：用pactac质粒重组后在E.coli 中用IPTG诱导下分泌到胞膜腔中2.包涵体型：用 pAM1控温质粒30增殖，42 诱导产生rhAb包含体(三三)在植物中表达在植物中表达1.用Ti质粒组装后转染的L链基因植株和Fd链基因植株有些杂交后的子代产生 rhAb2.用Ti质粒将L链、Fd链导入根瘤菌，再感染植物细胞，在植株体内含有rhAb