第十章第十章 化学发光免疫化学发光免疫 分析技术分析技术第十章第十章 化学发光免疫化学发光免疫 分析技术分析技术第一节第一节 慨慨 述述一、化学发光一、化学发光二、化学发光效率二、化学发光效率第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术一、化学发光剂一、化学发光剂二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用四、临床应用思考题思考题小结小结发光免疫分析发光免疫分析: :是将发光分析和免疫反是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。技术。第一节第一节 概概 述述放放射射免免疫疫技技术术酶酶免免疫疫技技术术发发光光免免疫疫技技术术三大经典标记技术三大经典标记技术 发光发光: :是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生物发光、光照发光、生物发光、化学发光化学发光等。等。 光照发光光照发光（photoluminescence）是指发是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。发射出较长波长的可见光（荧光）。 生物发光生物发光（bioluminescence）是指发生在生是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATPATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。态时多余的能量以光子的形式释放出来。 化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质反应过程所产生的光的发射现象。某些物质( (发光剂发光剂) )在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。光。一、化学发光一、化学发光一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A A十十B C*B C* C* C C* C hh其中其中为光子，为光子，C*C*表示表示C C处于单线激发态。处于单线激发态。 若激发能传递到另一个未参加化学反应若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子的分子D D上，使上，使D D分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，D D分子从激发态回到基态时发光，这种过分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A A十十B CB C* * C C* *十十D CD C十十D D* * D D* * D D十十hh 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率）和激发态分子的发射效率（EM）。）。化学发光反应的发光效率、光辐射的化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术 在化学发光反应中参与能量转移并最终在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。化学发光剂或发光底物。 一、化学发光剂一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件：能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；它的物理它的物理- -化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。标记抗原或抗体。1.1. 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化氧化时时, ,发出波长为发出波长为470nm470nm的光，具有很高的发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物光效率，其激发态产物N-N-甲基吖啶酮是甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。该发光反应体系的发光体。 2 2三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 酶促反应发光剂：酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。称为酶促反应发光剂。1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2AMPPD1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理 2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷1. 1. 碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法缩合法 二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体( (抗原抗原) )，与待测标本中相应的抗，与待测标本中相应的抗原原( (抗体抗体) )发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体- -待测抗原待测抗原- -吖吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析发光发光Y Y Y YY Y磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后冲洗后- - 夹心法夹心法（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁磁微粒微粒模式图模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点抗原和抗体结抗原和抗体结合与未合与未结结合部分合部分的的易易分离分离磁微粒磁微粒技术技术 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原体，在与待测标本中相应的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反应后，形成发生免疫反应后，形成固相包被抗体固相包被抗体- -待测抗原待测抗原- -酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物底物( (发光剂发光剂) )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标标记抗体记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标记抗体复合标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发和化学发光增强剂使产生化学发光。光增强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光发光剂，碱性磷酸酶使剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而脱去磷酸根基团而发光。发光。 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 分析步骤分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体抗体( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。反应，它包括电化学和化学发光两个过程。 三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体包被抗体( (抗原抗原) )，用三联吡啶钌标记抗体，用三联吡啶钌标记抗体( (抗原抗原) )，在，在反应体系内待测标本与相应的抗原反应体系内待测标本与相应的抗原 ( (抗体抗体) )发生免疫反发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体应后，形成磁性微粒包被抗体- -待测抗原待测抗原- -三联吡啶钌三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人时引人TPATPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和和标本标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和学发光反应，使三联吡啶钌和TPATPA在电极表面进行电子在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。成正比。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 1.1.甲状腺激素甲状腺激素 2 2生殖激素生殖激素 3 3垂体激素和皮质激素垂体激素和皮质激素 4 4贫血因子贫血因子 5 5肿瘤标志物肿瘤标志物 6 6感染性疾病感染性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、血清胰岛素、血清C-C-肽、血浆胰高糖素等。肽、血浆胰高糖素等。 8 8心脏标志物心脏标志物 9 9病毒标记物病毒标记物 1010过敏性疾病过敏性疾病 1111治疗药物监测治疗药物监测 四、临床应用四、临床应用1 1什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？2 2化学发光与荧光的区别？化学发光反应的条件？化学发光与荧光的区别？化学发光反应的条件？3 3什么叫化学发光剂？化学发光剂必须具备那些条件？什么叫化学发光剂？化学发光剂必须具备那些条件？4 4吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？5 5酶促反应的发光剂有哪些？其发光原理和特点是？酶促反应的发光剂有哪些？其发光原理和特点是？6 6三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？7 7三丙胺在电化学发光中起什么作用？三丙胺在电化学发光中起什么作用？8. 8. 发光剂的标记有那些方法？影响因素有那些？发光剂的标记有那些方法？影响因素有那些？9 9什么是直接化学发光免疫分析？其特点是什么？什么是直接化学发光免疫分析？其特点是什么？1010什么是化学发光酶免疫分析？其特点是什么？什么是化学发光酶免疫分析？其特点是什么？思考题思考题发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。分析和电化学发光免疫分析。小小 结结