第4章 蛋白质的共价结构一、蛋白质通论一、蛋白质通论二、肽二、肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽和蛋白质的人工合成五、肽和蛋白质的人工合成(Covalent structure of protein)一、蛋白质通论蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成碳碳50% 氢氢7%氧氧23% 氮氮16%硫硫03%其它（其它（P、Fe、Cu、I、Zn、 Mo、Mn、Ca等）等）定氮法测定蛋白质含量 氮氮为为蛋蛋白白质质的的特特征征元元素素，将将提提取取并并纯纯化化的的蛋蛋白白质质用用凯凯氏氏定定氮氮法法测测定定氮氮的的含含量量，然然后后通通过过下下列列公公式可以计算蛋白质的含量：式可以计算蛋白质的含量：蛋白质含量（蛋白质含量（mg/mlmg/ml）= = 蛋白氮（蛋白氮（mg/mlmg/ml）6.256.25 （或（或 = = 蛋白氮（蛋白氮（mg/mlmg/ml）16%16%）蛋白质的分类 仅仅由由氨氨基基酸酸缩缩合合而而成成，不不含含其其它它成成分分的的蛋蛋白白质质叫叫单单纯纯蛋蛋白白质质（simple protein）；还还含含有有其其它它成成 分分 的的 蛋蛋 白白 质质 叫叫 缀缀 合合 蛋蛋 白白 质质 （ conjugated protein），缀缀合合蛋蛋白白质质中中的的非非蛋蛋白白质质成成分分叫叫配配体体（ligand），有有些些配配体体与与蛋蛋白白质质通通过过共共价价键键结结合合，有些通过非共价键结合。有些通过非共价键结合。 蛋白质的分类蛋白质还可以：蛋白质还可以：按溶解性质分类（见按溶解性质分类（见P158表表4-1）按所含配体种类分类（见按所含配体种类分类（见P158表表4-2）按生物学功能分类（见按生物学功能分类（见P158表表4-3）蛋白质的形状纤维状蛋白质纤维状蛋白质 球状蛋白质球状蛋白质 膜结合蛋白质膜结合蛋白质Collagen Myoglobin Bacteriorhodopsin蛋白质的大小蛋白质蛋白质Mr残基数目残基数目/链链亚基组织方式亚基组织方式细胞色素细胞色素c（马）（马）125001041己糖激酶（酵母）己糖激酶（酵母）960002004胰岛素胰岛素573321（A）30（B）血红蛋白（人）血红蛋白（人）64500141（）146（）22糜蛋白酶（牛胰）糜蛋白酶（牛胰）2260013（）132（）97（）蛋白质的大小 蛋蛋白白质质的的分分子子量量很很大大，并并且且分分布布范范围围也也很很大大，一一般般在在大大约约6000110 6 道道尔尔顿顿。蛋蛋白白质质的的分分子子量量主主要要由由组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸残残基基的的数数目目决决定定，对对于于缀缀合合蛋蛋白白质质来来说说，有有些些配配体体也也在在蛋蛋白白质质的的分分子子量量中中占占有有很很大大的的比比重重。蛋蛋白白质质的的分分子子量量范范围围是是人人为为规规定定的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。 蛋白质氨基酸残基数的估计 对对于于简简单单蛋蛋白白质质，用用110除除它它的的相相对对分分子子量量即可约略估计出其氨基酸残基数目。即可约略估计出其氨基酸残基数目。 20种常见氨基酸的平均分子量为种常见氨基酸的平均分子量为138 组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128 每个氨基酸残基的平均分子量为每个氨基酸残基的平均分子量为110蛋白质结构的组织层次一级结构指的是多肽链的氨基酸序列一级结构指的是多肽链的氨基酸序列二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构律的、局部的结构三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象折叠成具有特定走向的紧密球状构象四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。基间不同的排列方式会形成不同的构象。Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu 蛋白质的一级结构SSN端C端蛋白质的二级结构“Shorthand”-helix “Shorthand”-strand蛋白质的三级结构Chymotrypsin space-filling model Chymotrypsin ribbon蛋白质的四级结构蛋白质的一级结构决定高级结构 在肽链内或肽链间有时也有在肽链内或肽链间有时也有 两个半胱氨两个半胱氨酸之间形成二硫键的连接。酸之间形成二硫键的连接。 蛋白质功能的多样性1 1催化；催化； 2 2调节；调节；3 3转运；转运； 4 4贮存；贮存；5 5运动；运动； 6 6结构成分；结构成分；7 7支架作用；支架作用； 8 8防御和进攻；防御和进攻；9 9异常功能。异常功能。二、肽肽的命名肽的命名 肽肽是是两两个个至至数数百百个个氨氨基基酸酸之之间间由由肽肽键键连连接接而而成成的的线线状状聚聚合合物物。根根据据形形成成肽肽的的氨氨基基酸酸数数目目，一一般般氨氨基基酸酸数数目目在在12个个以以内内时时，称称为为二二肽肽、三三肽肽、四四肽肽等等；13个个至至20个个时时称称为为寡寡肽肽（oligopeptide）；20个个以以上上称称为为多多肽肽（polypeptide）。当当分分子子量量大大到到一一定定程程度度时时，就就称称为为蛋蛋白白质质。寡寡肽肽和和多多肽肽的的区区分分完完全全是是人人为为规规定定的的，其其间的界限并不严格。间的界限并不严格。 肽肽链链中中的的氨氨基基酸酸因因缺缺少少了了一一分分子子水水，叫叫做做氨氨基基酸酸残基。残基。 肽的两端 一一条条肽肽链链是是有有方方向向性性的的，肽肽链链的的一一端端具具有有游游离离的的氨氨基基，称称其其为为N端端；另另一一端端具具有有游游离离的的羧羧基基，称称其其为为C端端。有有少少数数小小分分子子量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。 肽的命名 对对于于小小分分子子量量的的肽肽的的命命名名，是是从从其其N端端开开始始，称称为为某某氨氨酰酰某某氨氨酰酰某某氨氨酰酰某某氨氨基基酸酸，下下例例写写成成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左边是，左边是N端，右边是端，右边是C端。端。 肽的命名 对对于于生生物物体体内内的的具具有有特特定定结结构构和和功功能能的的小小分分子子量量肽肽，还还有有特特别别名名称称，如如脑脑啡啡肽肽、内啡肽、催产素、加压素等。内啡肽、催产素、加压素等。 肽基的C、O和N原子间的共振相互作用肽键共振的结果 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨基酸残基只保留两个自由度。基酸残基只保留两个自由度。 组成肽基的组成肽基的4个原子和个原子和2个相邻的个相邻的C原子倾原子倾向向于于共共平平面面，形形成成所所谓谓的的多多肽肽主主链链的的酰酰胺胺平平面面（amide plane）或或称称肽肽平平面面（peptide plane）。）。肽平面肽平面肽键共振的结果 CN 键键的的长长度度为为0.133nm，比比正正常常的的 CN 单单键键（0.145nm）短短，但但比比典典型型的的 C= =N 键键（0.125nm）长长。估估计计肽肽基基中中的的 CN 键键具具有有约约40%的的双双键键性性质质，而而 C= =O 键键具具有有40%的的单单键键性性质，在室温下足以防止质，在室温下足以防止 CN 键旋转。键旋转。 杂杂化化的的中中间间态态酰酰胺胺带带有有0.28个个净净正正电电荷荷，羰羰基带有基带有0.28个净负电荷，肽键具有永久偶极。个净负电荷，肽键具有永久偶极。 肽基的顺、反构型 肽肽平平面面内内，两两个个C可可以以处处于于顺顺式式或或反反式式构构型型。因因为为顺顺式式构构型型两两个个R基基有有空空间间位位阻阻，所所以以反反式式构构型型比比顺顺式式构构型型稳稳定定，因因此此肽肽链链中中肽肽键键几几乎乎都都是是反反式式构构型。型。脯氨酸的亚氨基形成的肽键 Of the peptide bonds between amino acid residues other than Pro, over 99.95% are in the trans configuration. For peptide bonds involving the imino nitrogen of proline, however, about 6% are in the cis configuration; many of these occur at turns.trans cis肽的物理化学性质由由于于短短肽肽晶晶体体的的熔熔点点都都很很高高，说说明明短短肽肽的的晶晶体体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在在pH014范范围围内内，肽肽键键中中的的酰酰胺胺氢氢不不解解离离，所所以以肽肽的的酸酸碱碱性性主主要要决决定定于于肽肽链链末末端端的的羧羧基基、氨基以及氨基以及R基团上的可解离基团。基团上的可解离基团。因因为为肽肽链链末末端端的的羧羧基基和和氨氨基基相相距距很很远远，它它们们之之间间的的静静电电引引力力较较弱弱，所所以以它它们们的的酸酸碱碱性性比比氨氨基基酸酸的的羧羧基基和和氨氨基基弱弱。R基基上上可可解解离离基基团的解离常数也有所变化。团的解离常数也有所变化。在在某某一一pH下下，肽肽中中各各可可解解离离基基团团解解离离得得到到的的净净电荷为电荷为0，这个，这个pH就是该肽的等电点。就是该肽的等电点。肽的物理化学性质肽肽的的化化学学反反应应和和氨氨基基酸酸的的一一致致。N端端的的氨氨基基酸酸残残基基也也可可以以与与茚茚三三酮酮反反应应，这这一一反反应应可可用用于于肽肽的的定性和定量测定。定性和定量测定。双双缩缩脲脲反反应应是是肽肽和和蛋蛋白白质质特特有有的的，氨氨基基酸酸没没有有此此反反应应。一一般般含含有有两两个个或或两两个个以以上上肽肽键键的的化化合合物物与与CuSO4碱碱性性溶溶液液都都能能发发生生双双缩缩脲脲反反应应，生生成成紫紫红红色色或或蓝蓝紫紫色色的的络络合合物物，利利用用这这个个反反应应可可以以用用分分光光度法（光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。测定蛋白质的含量。 双缩脲反应形成的络合物双缩脲与肽的结构比较双缩脲双缩脲三肽三肽三、蛋白质一级结构的测定蛋白质测序的策略蛋白质测序的策略首首先先要要得得到到较较纯纯的的蛋蛋白白质质样样品品，纯纯度度应应在在97%以上。以上。测出它的分子量。测出它的分子量。分析蛋白质中是否有非肽成分。分析蛋白质中是否有非肽成分。 测定蛋白质分子中的多肽链的数目。测定蛋白质分子中的多肽链的数目。拆分多肽链。拆分多肽链。测定肽链的氨基酸组成。测定肽链的氨基酸组成。鉴定肽链的鉴定肽链的C末端氨基酸及末端氨基酸及N末端氨基酸。末端氨基酸。蛋白质测序的策略酶酶水水解解肽肽链链成成短短的的肽肽段段。采采用用两两套套以以上上的的酶酶水水解解方方法法，得得到到互互相相重重叠叠的的肽肽段段。分分离离纯纯化化这这些些肽肽段段，并并鉴鉴定定各各肽肽段段的的C末末端端氨氨基基酸酸及及N末末端氨基酸。端氨基酸。测定各肽段的序列。测定各肽段的序列。 确确定定天天冬冬酰酰胺胺、谷谷氨氨酰酰胺胺以以及及链链内内或或链链间间二二硫键的位置。硫键的位置。拼出完整肽链的序列。拼出完整肽链的序列。N末端分析二二 硝硝 基基 氟氟 苯苯 法法 （ DNFB法法 ） ： 用用DNFB（Sanger试试剂剂）与与肽肽链链N末末端端的的氨氨基基反反应应，生生成成DNP多多肽肽或或DNP蛋蛋白白质质。然然后后水水解解肽肽链链，分分离离得得到到DNP氨氨基基酸酸，纸纸层层析析、薄薄层层层层析或析或HPLC分离鉴定。分离鉴定。丹丹磺磺酰酰氯氯法法（DNS法法）：与与DNFB法法类类似似，由由于于丹丹磺磺酰酰氯氯有有强强烈烈荧荧光光，灵灵敏敏度度比比DNFB法法高高100倍。倍。DNP-氨基酸氨基酸N末端分析苯苯异异硫硫氰氰酸酸酯酯法法（Edman降降解解法法）：肽肽链链与与PITC（Edman试试剂剂）反反应应生生成成PTC多多肽肽（苯苯氨氨基基硫硫甲甲酰酰多多肽肽）或或PTC蛋蛋白白质质，在在酸酸性性有有机机溶溶剂剂中中加加热热时时，N末末端端的的PTC氨氨基基酸酸发发生生环环化化，生生成成苯苯乙乙内内酰酰硫硫脲脲的的衍衍生生物物（PTH氨氨基基酸酸）并并从从肽肽链链上上脱脱落落下下来来，除除去去N末末端端氨氨基基酸酸后后剩剩下下的的肽肽链链仍仍然然是是完完整整的的。分分离离PTH氨氨基基酸酸并并鉴鉴定定。肽肽链链可可用用于于鉴鉴定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。氨氨肽肽酶酶法法：根根据据游游离离氨氨基基酸酸出出现现的的时时间间顺顺序序分分析析N末末端端氨氨基基酸酸。值值得得注注意意是是不不同同的的N末末端端氨氨基基酸酸水水解解的速度不同，有时难以分析。的速度不同，有时难以分析。 PTH-氨基酸氨基酸C末端分析肼肼解解法法：蛋蛋白白质质或或多多肽肽与与无无水水肼肼加加热热发发生生肼肼解解。反反应应中中除除C末末端端氨氨基基酸酸以以游游离离形形式式存存在在外外，其其它它氨氨基基酸酸都都转转变变成成相相应应的的氨氨基基酸酸酰酰肼肼。反反应应中中生生成成的的氨氨基基酸酸酰酰肼肼可可与与苯苯甲甲醛醛作作用用变变成成水水不不溶溶性性的的二二苯苯基基衍衍生生物物而而沉沉淀淀。上上清清液液中中游游离离的的C末末端端氨氨基基酸酸借借助助DNFB法法或或DNS法法鉴鉴定定。肼肼解解过过程程中中，天天冬冬酰酰胺胺、谷谷氨氨酰酰胺胺、半半胱胱氨氨酸酸被被破破坏坏不不易易测测出出，精精氨氨酸酸转转变成鸟氨酸。变成鸟氨酸。 肼解法反应式C末端分析还还原原法法：肽肽链链C末末端端的的氨氨基基酸酸可可用用硼硼氢氢化化锂锂还还原原成成相相应应的的氨氨基基醇醇，肽肽链链水水解解后后层层析鉴定。析鉴定。 C末端分析羧羧肽肽酶酶法法：目目前前常常用用的的有有4种种羧羧肽肽酶酶：A、B、C和和Y。羧羧肽肽酶酶A能能释释放放除除Pro、Arg和和Lys之之外外的的任任何何一一种种C末末端端氨氨基基酸酸；羧羧肽肽酶酶B只只能能水水解解以以碱碱性性氨氨基基酸酸Arg和和Lys为为C末末端端的的氨氨基基酸酸；羧羧肽肽酶酶C和和Y可可以释放任何一种以释放任何一种C末端氨基酸。末端氨基酸。- -Val- -Ser- -Gly二硫桥的断裂 先先加加8mol/L尿尿素素或或6mol/L盐盐酸酸胍胍使使蛋蛋白白质质变变性性，再再用用氧氧化化法法或或还还原原法法断断裂裂二二硫硫键键。还还原原法法产产生生的的巯巯基基要要用用烷烷基基化化试试剂剂如如碘碘乙乙酸酸保护起来，以免重新形成二硫键。保护起来，以免重新形成二硫键。 还原法断裂二硫桥巯基保护反应巯基保护反应氧化法断裂二硫桥过甲酸过甲酸氨基酸组成的分析酸酸水水解解分分析析除除色色氨氨酸酸外外的的其其它它氨氨基基酸酸，碱碱水水解解分分析色氨酸。析色氨酸。为为了了准准确确分分析析酸酸水水解解中中被被部部分分破破坏坏的的Ser、Thr、Tyr、Cys的的量量，酸酸水水解解24、48、72小小时时后后，分分析析这这些些氨氨基基酸酸的的量量，然然后后外外推推至至0时时得得到到这这些些氨氨基基酸酸不不被破坏时的量。被破坏时的量。分分析析酸酸水水解解液液中中NH3的的量量，得得出出有有多多少少个个Asn + Gln。氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。色，比色定量。 某些氨基酸含量随水解时间的变化易被破坏的氨基酸易被破坏的氨基酸采用外推法测定采用外推法测定疏水氨基酸难以水解，疏水氨基酸难以水解，采用极限法测定采用极限法测定氨基酸分析仪示意图加热加热氨基酸分析仪示意图长长柱柱用用于于分分离离酸酸性和中性氨基酸性和中性氨基酸短短柱柱用用于于分分离离碱碱性氨基酸和氨性氨基酸和氨柱柱中中填填料料为为细细粒粒聚聚苯苯乙乙烯烯磺酸型阳离子交换树脂磺酸型阳离子交换树脂氨基酸的离子交换柱层析图谱洗洗脱脱曲曲线线多肽链的部分裂解酶酶裂裂解解法法：胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶（糜糜蛋蛋白白酶酶）、嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、葡葡萄萄球球菌菌蛋蛋白白酶酶、梭梭菌菌蛋蛋白白酶酶等等，它它们们各各自自有有自自己己的的水水解解专专一一性性。蛋蛋白白酶酶分分为为内内肽肽酶酶和和外外肽肽酶酶（羧肽酶、氨肽酶）。（羧肽酶、氨肽酶）。化化学学裂裂解解法法：溴溴化化氰氰（只只裂裂解解由由Met的的羧羧基基形形成成的的肽肽键键）、羟羟胺胺（裂裂解解Asn-Gly之之间间的的肽肽键键，也能部分裂解也能部分裂解Asn-Leu及及Asn-Ala之间的肽键）。之间的肽键）。蛋白酶的专一性AECys溴化氰裂解法溴溴化化氰氰只只裂裂解解由由Met的的羧羧基基形形成成的的肽键肽键肽段的分离纯化凝胶过滤凝胶过滤凝胶电泳凝胶电泳高效液相色谱高效液相色谱氨基酸序列测定质质谱谱法法：两两台台质质谱谱仪仪联联用用，第第一一台台质质谱谱仪仪通通过过电电喷喷射射电电离离使使肽肽段段带带上上电电荷荷，将将不不同同大大小小的的肽肽段段分分离离。第第二二台台质质谱谱仪仪分分析析肽肽段段的的序序列列。在在第第二二台台质质谱谱仪仪上上，小小肽肽段段在在碰碰撞撞池池中中与与氮氮气气分分子子或或氩氩气气分分子子碰碰撞撞，碎碎裂裂成成依依次次少少一一个个氨氨基基酸酸残残基基的的碎碎片片，分分析析这这些些碎碎片片的的质质量量差差，可可得得出出序列。序列。串联质谱仪串联质谱测序工作原理分离肽段分离肽段测序测序氨基酸序列测定Edman降降解解法法：由由N端端向向C端端逐逐步步降降解解。先先将将被被测测肽肽段段的的羧羧基基端端固固定定到到不不溶溶性性的的树树脂脂上上，便便于于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。分离切下的氨基酸和剩余的肽段。酶酶降降解解法法：用用外外肽肽酶酶逐逐个个切切下下氨氨基基酸酸分分析析。只只能分析很少的几个氨基酸。能分析很少的几个氨基酸。根根据据核核苷苷酸酸序序列列的的推推定定法法：找找到到该该蛋蛋白白质质的的基基因因，从从基基因因的的编编码码序序列列按按三三联联密密码码推推出出氨氨基基酸酸序序列。列。 所得资料：所得资料：N-末端残基末端残基 H C-末端残基末端残基S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基末端残基 H S 末端肽段末端肽段 H O W T A P S 第一套肽段第一套肽段 H O W T O U S E O V E R L A P S 第二套肽段第二套肽段 H O W T O U S E O V E R L A P S 推断全序列推断全序列 H O W T O U S E O V E R L A P S 肽段在多肽链中次序的决定 二硫桥位置的确定 在在保保留留二二硫硫桥桥的的情情况况下下对对蛋蛋白白质质部部分分水水解解，利利用用对对角角线线电电泳泳可可以以鉴鉴定定出出哪哪些些肽肽段段带带有有二二硫硫桥桥。对对角角线线电电泳泳是是双双向向电电泳泳，把把水水解解后后的的肽肽段段混混合合物物点点到到滤滤纸纸的的中中央央，第第一一向向将将肽肽段段按按大大小小和和带带电电荷荷情情况况分分离离，然然后后把把滤滤纸纸暴暴露露到到过过甲甲酸酸蒸蒸气气中中，使使二二硫硫桥桥断断裂裂，再再在在同同样样的的条条件件下下进进行第二向电泳。行第二向电泳。对角线电泳对角线电泳二硫桥位置的确定 二二硫硫桥桥连连接接的的两两个个肽肽段段在在第第一一向向时时是是一一个个斑斑点点，第第二二向向时时成成了了两两个个斑斑点点，并并离离开开对对角角线线。对对这这两两个个斑斑点点相相对对应应的的肽肽段段进进行行测测序序，如如果果两两个个肽肽段段中中各各只只有有一一个个Cys，它它们们就就是是参参与与二二硫硫桥桥的的Cys。根根据据这这两两个个肽肽段段的的序序列列，可可知知它它们们在整个肽链中的位置。在整个肽链中的位置。 酰胺位置的确定 对对肽肽链链进进行行各各种种部部分分水水解解，直直到到测测得得一一个个肽段中只有肽段中只有1 1个天冬酰胺或谷氨酰胺为止。个天冬酰胺或谷氨酰胺为止。 四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 有有些些来来源源于于不不同同生生物物的的蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列具具有有明明显显的的相相似似性性，这这种种序序列列上上的的相相似似性性叫叫做做同同源源性性。同同源源蛋蛋白白质质中中有有许许多多氨氨基基酸酸残残基基是是相相同同的的，称称为为不不变变残残基基，或或保保守守性性残残基基，而而在在不不同同物物种种的的同同源源蛋蛋白白质质中中不不同同的的氨氨基基酸酸残残基基称称为为可可变变残残基基。亲亲缘缘关关系系越越近近的的同同源源蛋白质的同源性越强。蛋白质的同源性越强。 同同源源蛋蛋白白质质往往往往在在不不同同生生物物体体中中行行使使相相同同或或相相似似的的功功能能，例例如如各各种种脊脊椎椎动动物物体体内内的的血血红红蛋蛋白白就就属属于于同同源蛋白质。源蛋白质。细胞色素C 细细胞胞色色素素C是是一一种种含含血血红红素素的的蛋蛋白白质质，在在线线粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素 C 含含一一百百零零几几个个氨氨基基酸酸残残基基，40多多个个物物种种的的细细胞胞色色素素C氨氨基基酸酸序序列列分分析析表表明明，有有28个个残残基基是是不不变变的的，所所有有细细胞胞色色素素C在在第第17位位上上都都是是一一个个Cys残残基基，这这个个残残基是血红素结合的部位。基是血红素结合的部位。细胞色素C的不变残基此此区区域域可可能能是是与与酶酶结结合合的的区区域域不同物种细胞色素C的差异残基数黑猩猩黑猩猩绵羊绵羊响尾蛇响尾蛇鲤鱼鲤鱼蜗牛蜗牛天蛾天蛾酵母酵母花椰菜花椰菜欧防风欧防风人人01014182931444443黑猩猩黑猩猩1014182931444443绵羊绵羊20112427444646响尾蛇响尾蛇262833474543鲤鱼鲤鱼2626444746蜗牛蜗牛28485150天蛾天蛾444441酵母酵母4747花椰菜花椰菜13根据细胞色素C建立的系统树哺乳类哺乳类鸟和爬虫类鸟和爬虫类硬骨鱼类硬骨鱼类软骨鱼类软骨鱼类真菌真菌昆虫昆虫两栖类两栖类植物植物氧合血红素蛋白质 肌肌肉肉中中的的氧氧合合血血红红素素蛋蛋白白质质肌肌红红蛋蛋白白（Myoglobin）由由一一条条肽肽链链组组成成，含含153个个氨氨基基酸酸残残基基，红红细细胞胞中中的的血血红红蛋蛋白白（Hemoglobin）是是一一个个由由两两条条链链（每每条条链链141个个氨氨基基酸酸残残基基）和和两两条条链链（每每条条链链146个个氨氨基基酸酸残残基基）组组成成的的四四聚聚体体蛋蛋白白。肌肌红红 蛋蛋 白白 、 血血 红红 蛋蛋 白白 的的 链链 和和 链链 都都 是是 珠珠 蛋蛋 白白（globin），它它们们有有很很高高的的序序列列同同源源性性，通通过过血血红红素素结合氧的能力都被这结合氧的能力都被这3种多肽链保留下来了。种多肽链保留下来了。 氧合血红素蛋白的进化树丝氨酸蛋白酶类 胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶、弹弹性性蛋蛋白白酶酶、凝凝血血酶酶以以及及纤纤溶溶酶酶都都是是丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶，它它们们有有足足够够的的序序列列同同源源性性，在在它它们们的的活活性性中中心心都都有有丝丝氨氨酸酸，说说明明它它们们可可能能是是由由祖祖先先丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶进进化而来。化而来。 生物活性和来源差异很大的蛋白质 卵卵清清中中的的溶溶菌菌酶酶（含含129个个残残基基，水水解解细细菌菌细细胞胞壁壁的的多多糖糖成成分分）和和人人乳乳汁汁中中的的-乳乳清清蛋蛋白白（含含123个个残残基基，调调节节乳乳糖糖合合成成）功功能能和和来来源源都都很很不不相相同同，但但它它们们有有48个个残残基基是是相相同同的的，三三级级结结构也很相似，说明它们具有共同的构也很相似，说明它们具有共同的蛋白质祖先。蛋白质祖先。 五、肽和蛋白质的人工合成肽的人工合成肽的人工合成 最最广广泛泛应应用用的的氨氨基基保保护护基基是是苄苄氧氧甲甲酰酰基基，它它可可以以用用催催化化加加氢氢或或用用金金属属钠钠在在液液氨氨中中处处理理去去除除。其其它它可可以以用用作作氨氨基基保保护护基基的的还还有有三三苯苯甲甲基基、叔叔丁丁氧氧甲甲酰酰基基、对对甲甲苯苯磺磺酰酰基基等等，这这些些基基团团可可以以用用HBr/CH3COOH在室温下除去。在室温下除去。（氨基的保护）肽的人工合成（羧基的保护） 羧羧基基一一般般用用盐盐或或酯酯的的形形式式保保护护。盐盐是是对对羧羧基基临临时时性性的的保保护护。酯酯有有甲甲酯酯、乙乙酯酯、苄苄酯酯和和叔叔丁丁酯酯等等。甲甲酯酯和和乙乙酯酯可可用用皂皂化化法法除除去去，但但易易引引起起消消旋旋。苄苄酯酯可可用用H2/Pd法法或或金金属属钠钠液液氨氨法法除除去去。叔叔丁丁酯可在温和条件下用酸除去。酯可在温和条件下用酸除去。 肽的人工合成（侧链上活泼基团的保护） 侧侧链链上上需需要要保保护护的的活活泼泼基基团团有有：Asp和和Glu的的和和羧羧基基，Ser、Thr和和Tyr的的羟羟基基，Cys的的巯巯基基，Lys的的氨氨基基，Arg的的胍胍基基等等。这这些些保保护护基基团团有苄基、对甲苯磺有苄基、对甲苯磺酰基、甲基等。酰基、甲基等。各种保护基团现在最常用的氨基保护基团Fmoc(9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基羧基的叠氮法活化羧基的活化酯法活化羧基的混合酸酐法活化氯甲酸乙酯氯甲酸乙酯叔胺叔胺碳二亚胺缩合剂缩合剂催化的肽键形成固相肽合成 将将待待合合成成肽肽链链C端端的的第第一一个个氨氨基基酸酸的的羧羧基基连连接接到到氯氯甲甲基基聚聚苯苯乙乙烯烯树树脂脂上上，然然后后向向N端端方方向向依依次次将将后后续续的的氨氨基基酸酸缩缩合上去。此法便于自动化操作。合上去。此法便于自动化操作。 固相肽合成图固相肽合成图分步合成的效率对最终产量的影响