遗传毒性试验主要内容遗传毒性试验开展的原因遗传毒性试验涉及的医疗器械类样品遗传毒试验内容试验中注意事项扩项的试验仪器设备和试剂试验原始记录1.遗传毒性试验GBT16886.1-2001持久表面粘膜接触类持久损伤表面接触类持久血路接触类长期组织/骨/牙接触长期循环血液接触长期植入类医疗器械2.遗传毒性试验涉及的医疗器械类样品人工食道、接触眼镜、宫内节育器创伤、愈合和保护用敷料（烫伤用敷料、硅橡胶纱布）3.遗传毒性试验内容体外遗传毒性哺乳动物细胞畸变哺乳动物细胞基因突变哺乳动物细胞染色体畸变细菌基因突变Ames试验遗传毒性-食品检测Ames试验和小鼠精子细胞染色体畸变试验体外与体内原核与真核常染色体与性染色体Ames试验试验原理试验流程结论判断Ames试验原理自发回复菌落空白对照无组氨酸突变菌落阳性无组氨酸 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成微菌落。受诱变剂作用后，大量细菌发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成2倍以上阴性对照的菌落数。Ames试验流程试剂和琼脂的配置菌株鉴定平板深入试验结果观察和记录溶液和琼脂的配置0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液顶层琼脂培养基磷酸盐缓冲液20%葡萄糖溶液底层培养基营养肉汤培养基S9混合物阳性物：敌克松（TA97、TA98和TA102），1.0mg/ml，用DMSO配制；叠氮钠（TA100）,1.0mg/ml。 活化组用2-蒽基芴（TA97,TA98,TA100），0.1mg/ml;1,8-二羟基蒽醌（TA102）0.6mg/ ml.菌株鉴定菌株购买，投入使用前准备冻存菌株时对诱变剂丧失敏感时自发图变数不在正常范围时鉴定内容组氨酸缺陷型鉴定脂多糖屏障缺失鉴定R因子鉴定四环素鉴定紫外线照射修复鉴定自发回复突变鉴定组氨酸缺陷性鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102TA97 TA98 TA100 TA102无组氨酸有组氨酸脂多糖屏障缺陷鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102结晶紫染色沾有结晶沾有结晶紫的滤纸紫的滤纸片片R因子鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102青霉素沾有青霉沾有青霉素滤纸片素滤纸片四环素鉴定 TA98 TA102 四环素沾有四环沾有四环素滤纸片素滤纸片uvrB突变鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102紫外线照紫外线照射射8s33cm自发回复突变鉴定底层培养基顶层培养基+菌液每个菌株做两个平行皿菌株菌株自发回复图变数自发回复图变数TA9790180TA983050TA100100200YA102240320平板渗入试验配试剂高压烘干倒平板接种菌株，摇菌试验前准备样品剂量设定0.2g/ml0.1g/ml0.05g/ml0.025g/ml0.0125g/ml平板分组阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阳性样品样品样品样品TA97TA98TA100TA102平板分组阴性阳性样品TA97TA97 S9阴性TA97 +S9阴性TA97 S9阴性TA97 +S9阴性TA97 S9阳性TA97 +S9阳性TA97 S9阳性TA97 +S9阳性TA97 S9样品高剂量TA97 +S9样品高剂量TA97 S9样品高剂量TA97 +S9样品高剂量试验底层培养基样品液0.1ml菌液0.1ml活化组加S9溶液0.5ml每支试管结论判断倒置培养48h后，计算每皿菌落数。阴性对照组回变菌落数应在预期范围内，阳性对照组回变菌落数应至少为预期范围的3倍。否则对不在范围内的菌株应重新试验。试验样品组变异频率比阴性对照至少增加两倍（即回变菌落数2阴性对照数）即为阳性反应。只要有一个试验菌株，无论在加S9 或未加S9 条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性体外哺乳动物细胞染色体畸变试验试验原理试验流程结论判断试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。试验流程传代细胞到六孔板染毒换液，继续培养秋水仙素处理，收细胞，制片染毒样品设计三个剂量，0.2g/ml 0.1g/ml 0.05g/ml染毒过程分加S9混合物和不加S9混合物阴性 S1阴性 S1 S2 S2 S3 S3 阳性 阳性 -S9&+S9-S9阳性对照为甲磺酸甲酯+S9阳性对照为环磷酰胺秋水仙素处理，收细胞，制片消化细胞后加含血清培养液，以1200 r/min离心7min，弃上清。加入0.075mol/L氯化钾溶液7ml，于37水浴低渗处理7min，加入2ml固定液，以1500r/min离心5min7min，弃去上清液。再加入7ml固定液，固定7min，以1500r/min离心7min，弃上清。同法再固定12次，弃上清，加入数滴新鲜固定液自然干燥，用姬姆萨染液染色。制片秋水仙素处理4h消化细胞，1200rpm离心7min0.075mmol/L氯化钾低渗处理7min后加固定液，1500rpm，7min加固定液7ml，7min后1500rpm离心7min，重复两次滴片吉姆萨染色结论判断在光学显微镜下每一试验组选择100个分散良好的中期分裂相进行染色体畸变分析染色体结构异常包括：裂隙、断裂、微小体，单体互换等用2 检验或其他适当的显著性检验方法，对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。当畸变率4.9%为阴性，5.0%9.9%为可疑阳性，10%19.9%为+，20%49.9%为+，50%为+注意事项1.剧毒物质：敌克松、叠氮钠、2-蒽基芴、1,8-二羟基蒽醌、多氯联苯、甲磺酸甲酯2.操作中，避免菌株的交叉污染3.废弃菌液煮沸10min处理4.低渗时间的把握5.染色体结构异常的判断扩项的实验设备和试剂Ames实验 培养箱、水浴摇床、水浴箱、灭菌器、烘箱、普通冰箱、液氮灌、电子天平等 组氨酸、生物素、琼脂粉、氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钾、磷酸氢氨钠、硫酸镁、葡萄糖、牛肉膏、胰胨、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、辅酶2、6-磷酸葡萄糖、氨苄青霉素、四环素、结晶紫、体外哺乳动物细胞染色体 畸变 超净工作台、离心机、倒置显微镜等 甲磺酸甲酯、环磷酰胺、DMSO、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰醋酸、吉姆萨染料、甘油谢谢！谢谢！