第四章第四章 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备实例种子制备的技术概要种子制备的技术概要 种种子子扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养, ,最最终终获获得得一一定定数数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子种子。第一节第一节 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念: :种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间缩短发酵时间、保证生产水平保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无无杂菌杂菌污染污染第二节第二节 种子制备过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种 一级种子培养一级种子培养 二二级级种子培养种子培养 发酵发酵1、斜面、斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不生长良好，所使用斜面连续传代不超过超过3次次2. 2. 一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）培养条件：培养条件：于于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml，32培养培养12小时。小时。培养基：培养基：葡萄糖葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基料已经基本接近于发酵培养基3. 3. 二二级级种子种子( (种子罐种子罐) )培养条件：培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%1%(10%)(10%)），），3232培养培养7-107-10个小时个小时培养基：培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为糖代替，浓度为2.5%2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.8 8 7.0-7.2活力旺盛活力旺盛二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安安瓿瓿管管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵一、斜面孢子一、斜面孢子培养基：培养基：甘油、甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培养基特点：培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天，注意湿度天，注意湿度50%左右左右二、大米孢子二、大米孢子培养基：培养基：大米及氮源（玉米浆）大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求：大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子3 3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：2727，4040小时小时接种量：接种量：200200亿孢子亿孢子/ /吨吨4 4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：2727、10-1410-14小时小时接种量：接种量：10%10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6 6个期，个期，1-41-4为为年青期，年青期，4-64-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强第三节第三节 种子制备的技术概要种子制备的技术概要一、种子制备的过程一、种子制备的过程实验室阶段实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间生产车间阶段。阶段。二、实验室阶段二、实验室阶段1、培养物选择的原则、培养物选择的原则目的：目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：点最终的培养物可分为两类：q 对于不产孢子和芽孢的微生物对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。氨酸的种子培养。 获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。稳定的种子，但操作繁琐。q 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。2 2、培养基选择的原则、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基孢子培养基应该是有利于孢子的生长应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原培养基的原料一般都比较精细。料一般都比较精细。3 3、起始接种物的传代问题、起始接种物的传代问题q 细菌细菌保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面q 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面目的目的：使菌种的传代次数尽可能的少。使菌种的传代次数尽可能的少。三、生产车间阶段三、生产车间阶段1 1、培养物的选择原则、培养物的选择原则在在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。丝体。q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利菌丝体比孢子要有利：2 2、培养基选择的原则、培养基选择的原则目的：目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在在原料方面：原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: : 一是成本一是成本 二是驯化二是驯化例：例：柠檬酸发酵柠檬酸发酵q 以蔗糖为原以蔗糖为原料料成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5% 20%NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%琼脂琼脂 2%q 薯干粉薯干粉成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 薯干粉薯干粉 10% 22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂琼脂 2%3 3、发酵级数的确定、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受级数受发酵规模发酵规模、菌体生长特性菌体生长特性、接种量接种量的影响的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般一般2-42-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面的一个方面采用三级种子的谷氨酸发酵工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 李文东，李文东， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003,7斜面斜面一级种子（一级种子（1200ml/5000ml1200ml/5000ml三角瓶）三角瓶）二级种子二级种子（2m2m3 3）三级种子（三级种子（20m20m3 3)发酵（发酵（240m240m3 3) )背景：背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%1%左右）左右）三级种子大种量（种子罐是发酵罐的三级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%5%以上）以上）文章：文章：三级种子工艺三级种子工艺用途用途用途用途成分（成分（成分（成分（% % % %）规模规模规模规模保藏保藏保藏保藏牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏 （英国）（英国）（英国）（英国） 1 1 1 1，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）脂粉（日本）脂粉（日本）脂粉（日本）1.81.81.81.8， 无机盐无机盐无机盐无机盐斜面斜面斜面斜面添加添加添加添加 0.10.10.10.1的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上一级一级一级一级口服葡萄糖口服葡萄糖口服葡萄糖口服葡萄糖 3 3 3 3， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 2.42.42.42.4，尿素，尿素，尿素，尿素 0.650.650.650.65，无机盐等，无机盐等，无机盐等，无机盐等1200 ml 1200 ml 1200 ml 1200 ml /5000 ml/5000 ml/5000 ml/5000 ml二级二级二级二级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 2.02.02.02.0， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 2.0 2.0 2.0 2.0 ，甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜 1.0, 1.0, 1.0, 1.0, 尿素尿素尿素尿素 0.350.350.350.35， 无机盐等无机盐等无机盐等无机盐等1.2 / 2 1.2 / 2 1.2 / 2 1.2 / 2 m3m3m3m3三级三级三级三级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 4.04.04.04.0， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 1.5 1.5 1.5 1.5 ，甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜 1.0, 1.0, 1.0, 1.0, 液氨，复合维生素液氨，复合维生素液氨，复合维生素液氨，复合维生素 01 01 01 01 mg/Lmg/Lmg/Lmg/L， 无机盐等无机盐等无机盐等无机盐等12 / 20 12 / 20 12 / 20 12 / 20 m3m3m3m3发酵发酵发酵发酵玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 13-1413-1413-1413-14， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 0.06-0.06-0.06-0.06-0.08 0.08 0.08 0.08 ，甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜 1.0, 1.0, 1.0, 1.0, 液氨，维生素液氨，维生素液氨，维生素液氨，维生素 50 50 50 50 g g g g， 无机盐等无机盐等无机盐等无机盐等154 / 154 / 154 / 154 / 240 m3240 m3240 m3240 m3培养基成分表培养基成分表三级三级种子的特点：种子的特点： 种量更大，生长速度快：种量更大，生长速度快：工艺工艺8 8小时产酸小时产酸（% %）1212小时产酸小时产酸（% %）发酵周期发酵周期（h)h)三级三级种子种子2.22.22.72.74.64.65.25.23232二级二级种子种子1.01.01.51.52.62.63.43.43535 糖酸转化率高且稳定糖酸转化率高且稳定工艺工艺产酸（产酸（% %）糖酸转化率糖酸转化率（% %）单罐单罐产量产量( (吨）吨）三级三级种子种子10.9310.9359.859.82121二级二级种子种子9.89.8585818184 4、接种量的确定、接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为为7-15%7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。双种：双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒倒种：种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。酵罐。 接种量对菌体形态和产亚麻酸的影响 杨博， 中国油脂，2002 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前列亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功能。因增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理功能。因发酵法生产发酵法生产亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，发酵法生产发酵法生产亚麻酸成了当今研究的一个热点。亚麻酸成了当今研究的一个热点。 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的形亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵亚麻酸时菌亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。 采用被孢霉进行采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体本研究发现，采用被孢霉进行本研究发现，采用被孢霉进行亚麻酸发酵时接种量可以明亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和亚麻酸产量。亚麻酸产量。 不同接种量影响菌体的生长和发酵不同接种量影响菌体的生长和发酵发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率20%20%种子罐种子罐10%10%发酵罐前期发酵液效果最好发酵罐前期发酵液效果最好5 5、种龄、种龄种龄是指种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：种龄短：菌体太少；种龄长：易老化菌体太少；种龄长：易老化。原则：原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。相对较大，但是最终由实验结果定。舒琴， 林产化学与工业，2004镜镜检：检：2424小时多个杆菌首尾相连成线形，处于繁殖旺盛小时多个杆菌首尾相连成线形，处于繁殖旺盛期期3030小时开始出现芽孢小时开始出现芽孢6 6、种子的质量要求：、种子的质量要求：量：量：要求达到一定的浓度要求达到一定的浓度质质: 形态形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）（生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：理化指标：C、N、P的含量，的含量，pH 酶活等酶活等 无无污染污染本章小结：本章小结：了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念理解种子扩培的目的和要求理解种子扩培的目的和要求掌握控制种子质量的基本方法和手段掌握控制种子质量的基本方法和手段发酵工程实验发酵工程实验实验一实验一 酸奶的制作酸奶的制作实验二实验二 淀粉酶的液态发酵及提取实验淀粉酶的液态发酵及提取实验 实验三实验三 苏云金芽胞杆菌的发酵苏云金芽胞杆菌的发酵