第五章 谷氨酸及味精 概述概述 一、定义味精：L-谷氨酸单钠的一水化合物，俗称味精，它有强烈的肉类鲜味，将其添加在食品中可使食品风味增强，鲜味增加，是食品的鲜味调味品。 味精主要物理性质n1、旋光性nL-谷氨酸钠为右旋，在20，2mol/L盐酸介质中的比旋光度为+25.16。n2、溶解度n可溶于水和酒精溶液，在水中随温度升高而增大；在酒精中随酒精浓度升高而降低。主要化学性质n1、与酸作用生成谷氨酸n2、与碱反应生成谷氨酸二钠n3、加热脱水反应，生成焦谷氨酸钠味精安全性n味精代谢：n味精进入胃后，受胃酸作用生成谷氨酸。谷氨酸被人体吸收后，参与体内许多代谢反应，并与其他氨基酸一起共同构成人体组织的蛋白质。人体中的谷氨酸能与血液中氨结合形成谷氨酰胺，从而解除组织代谢过程中所产生的氨的毒害作用。n过食可造成体内钠驻留，血管变细，血压升高。 味精安全性n据最近台湾一项调查发现，约有30%的人由于摄取味精过量而出现了嗜睡、焦躁等现象。n味精的主要成分为谷氨酸钠，在消化过程中能分解出谷氨酸，后者在脑组织中经酶催化，可转变成一种抑制性神经传递物质。当味精摄入过多时，这种抑制性神经传递物质就会使人体中各种神经功能处于抑制状态，从而出现眩晕、头痛、嗜睡、肌肉痉挛等一系列症状。n建议每道菜味精添加量不应超过0.5毫克。 味精安全性使用n关于食用味精安全性问题，国际第14届食品添加物专门委员会曾作过如下结论： n味精作为食品添加物是极其安全的，除婴儿外，普通人一日允许摄取量为120mg/kg体重。 味味精精发发酵酵生生产产工工艺艺流流程程n一、合成谷氨酸的途径n二、葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径n三、控制谷氨酸生产菌细胞膜渗透性的方法n四、谷氨酸生产菌的特征和种类n五、生产菌种的扩大培养第一节第一节 谷氨酸生产菌种及其产酸机制谷氨酸生产菌种及其产酸机制一、谷氨酸发酵的代谢途径一、谷氨酸发酵的代谢途径p生成的丙生成的丙酮酮酸，一部分在丙酸，一部分在丙酮酮酸脱酸脱氢氢酶酶系的作用下氧化脱系的作用下氧化脱羧羧生成乙生成乙酰酰CoA，另一部分，另一部分经经CO2固定反固定反应应生成生成草草酰酰乙酸或苹果酸，催化乙酸或苹果酸，催化CO2固定反固定反应应的的酶酶有丙有丙酮酮酸酸羧羧化化酶酶、苹果酸、苹果酸酶酶和磷酸和磷酸烯烯醇式丙醇式丙酮酮酸酸羧羧化化酶酶。p草草酰酰乙酸与乙乙酸与乙酰酰CoA在在柠柠檬酸合成檬酸合成酶酶催化作用下，催化作用下，缩缩合成合成柠柠檬酸，檬酸，进进入三入三羧羧酸循酸循环环，柠柠檬酸在檬酸在顺乌头顺乌头酸酸酶酶的作用下生成异的作用下生成异柠柠檬酸，异檬酸，异柠柠檬檬酸再在异酸再在异柠柠檬酸脱檬酸脱氢氢酶酶的作用下生的作用下生成成-酮酮戊二酸，戊二酸，-酮酮戊二酸是谷氨酸戊二酸是谷氨酸合成的直接前体合成的直接前体。p-酮酮戊二酸在谷氨酸脱戊二酸在谷氨酸脱氢氢酶酶作用下作用下经还经还原氨基化反原氨基化反应应生成谷氨酸生成谷氨酸1 1、谷氨酸的生物合成包括、谷氨酸的生物合成包括pp糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（glycolysis, EMPglycolysis, EMPglycolysis, EMPglycolysis, EMP途径）途径）途径）途径）pp戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathway，HMPHMPHMPHMP途径）途径）途径）途径）pp三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（tricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycle）pp乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)pp丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（COCOCOCO2 2 2 2固定反应）等固定反应）等固定反应）等固定反应）等CO2固定固定酶酶系系活力活力强强 GDH酶酶活力活力强强乙乙醛醛酸循酸循环环弱弱异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶活力欠缺或微弱活力欠缺或微弱-酮酮戊二酸氧化戊二酸氧化能力缺失或微弱能力缺失或微弱谷氨酸脱谷氨酸脱氢氢酶酶能能力力强强2、控制谷氨酸合成的重要措施、控制谷氨酸合成的重要措施n3、 代谢途径中谷氨酸合成的方式代谢途径中谷氨酸合成的方式n（1）氨基转移作用）氨基转移作用 （2）还原氨基化作用）还原氨基化作用 nNH4+和供氢体还原性辅酶II（NADPH2）存在的条件下，a一酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下形成谷氨酸 。（3）其他生物合成方式）其他生物合成方式 n谷氨酸合成酶的催化下可产生下列反应：4、谷氨酸合成途径分析谷氨酸生物合成途径主要有糖酵解途径（EMP途径）、磷酸己糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA）、乙醛酸循环、伍德-沃克反应（二氧化碳的固定反应）等。 4、谷氨酸生物合成过程中的途径（续）、谷氨酸生物合成过程中的途径（续）n(1) 糖酵解途径糖酵解分为两个阶段共10个反应，每个分子葡萄糖经第一阶段共5个反应，消耗2个分子ATP为耗能过程，第二阶段5个反应生成4个分子ATP为释能过程。 葡萄糖6-磷酸葡萄糖1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛1，3-二磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸 （2）磷酸己糖途径n葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖后，经磷酸己糖途径，可以生成核糖、乙酸辅酶A和4-磷酸赤藓糖等芳香族氨基酸的前体物质，这些都是细菌构建细胞所必需的。n过程中有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛和多量NADPH2生成，前两者可以跟糖酵解途径联系起来，进一步生成丙酮酸；后者是a一酮戊二酸进行还原氨基化反应所必需的供氢体。磷酸己糖途径（3）三羧酸循环丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸经脱氨基后，可分别生成丙酮酸、草酸乙酸和a一酮戊二酸。（4 4）二氧化碳固定反应）二氧化碳固定反应n由于合成谷氨酸不断消耗a-酮戊二酸，从而引起草酰乙酸缺乏。n为了保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给a-酮戊二酸，在苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的催化下，分别生成苹果酸和草酸乙酸，前者再在苹果酸脱氢酶催化下，被氧化成草酸乙酸，从而使草酸乙酸得到了补充。 （5）乙醛酸循环n谷氨酸生产菌的a-酮戊二酸脱氢酶活力很弱。因此，琥珀酸的生成量尚难满足菌体生长的需要。通过乙醛酸循环异柠檬裂解酶的催化作用，使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，这对维持三羧酸循环的正常运转有重要意义。 l乙乙醛醛酸循酸循环环的作用的作用谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循可看作三羧酸循环的支路和中间环的支路和中间产物的补给途径产物的补给途径在菌体生长期之在菌体生长期之后，进入谷氨酸后，进入谷氨酸生成期，为了大生成期，为了大量生成、积累谷量生成、积累谷氨酸氨酸 ，最好没有，最好没有异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭催化反应，封闭乙醛酸循环乙醛酸循环（6 6）还原氨基化反应）还原氨基化反应 n-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，发生还原氨基化反应，生成谷氨酸。n异柠檬酸脱氧过程中产生的NADPH为还原氨基化反应提供了必需的供氧体。 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？二、葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径二、葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径 四四 细胞膜通透性控制细胞膜通透性控制 -酮戊二酸脱氢酶活性极低或缺失 细胞膜对谷氨酸的通透性高 谷氨酸脱氢酶活性很高，谷氨酸脱氢酶活性很高， 不被低浓度的谷氨酸抑制不被低浓度的谷氨酸抑制谷氨酸生产菌的谷氨酸生产菌的谷氨酸生产菌的谷氨酸生产菌的 主要生化特点主要生化特点主要生化特点主要生化特点 菌种选育模型与控制方法菌种选育模型与控制方法 控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂） 青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜 通过油酸的合成 控制磷脂含量控制磷脂含量 通过甘油合成 直接控制磷脂合成提高细胞膜的提高细胞膜的提高细胞膜的提高细胞膜的谷氨酸通透性谷氨酸通透性谷氨酸通透性谷氨酸通透性谷氨酸产生菌的选育可从以下几个方面进行： 1 1.选育生物素缺陷型 2.2.选育油酸缺陷型 3.3.选育甘油缺陷型 4 4.选育温度敏感型突变株 5.5.其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等。 pGluGlu产生菌主要生理生化特性产生菌主要生理生化特性 需氧，生物素缺陷型需氧，生物素缺陷型biobio- -, ,有乙醛酸循环，有乙醛酸循环，羧化酶活性强（羧化酶活性强（biobio作为辅酶）作为辅酶） 柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，GluGlu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于胞膜通透性差，不利于GluGlu胞外分泌。胞外分泌。生物素对代谢的调控作用生物素对代谢的调控作用l 生物素对生物素对CO2CO2固定反应的影响固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2CO2固固定反应，据报道，生物素大过量时（定反应，据报道，生物素大过量时（100100 g/Lg/L以以上），上），CO2CO2固定反应可提高固定反应可提高30%30%。l 生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响 生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出l 生物素对乙醛酸循环的影响生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊酮戊二酸二酸谷氨酸的方向高效率地移动。谷氨酸的方向高效率地移动。l生物素控制磷脂的合成生物素控制磷脂的合成使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰反应的关键酶乙酰CoACoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中出，积累于发酵液中p控制生物素添加量使菌种生产控制生物素添加量使菌种生产GluGlu 高浓度高浓度biobio增强羧化酶活性，促进羧化反应利增强羧化酶活性，促进羧化反应利于于GluGlu合成。低浓度合成。低浓度biobio降低裂解酶活性，使菌体降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向GluGlu合成，低合成，低浓度浓度biobio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于GluGlu胞外分泌，解除反馈调节，利于胞外分泌，解除反馈调节，利于GluGlu合成并大合成并大量积累。量积累。 添加亚适量，添加亚适量，5-10g/L 5-10g/L 培养基，生产培养基，生产GluGlu 培养前期，培养前期，bio充足，存充足，存在乙醛酸循环，中间物质在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累调节，不积累Glu，细胞，细胞形态正常。形态正常。8hrGlu非积累型细胞非积累型细胞Glu积累型细胞积累型细胞 培养中后期，培养中后期，bio浓度渐浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未，细胞形态异常，未溶解。溶解。四、谷氨酸生产菌的生化特征和种类四、谷氨酸生产菌的生化特征和种类 n（1）有催化固定二氧化碳的二羧酸合成酶苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的存在，使三羧酸循环的中间代谢物能得到补充。同时，丙酮酸脱羧酶活力不能过强，以免丙酮酸被大量耗用而使草酰乙酸的生成受到影响。 （2）a-酮戊二酸脱氢酶的活性很弱，这样有利于a-酮戊二酸的蓄积。n（3）异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物a-酮戊二酸的生成，满足合成谷氨酸的需要。谷氨酸生产菌的生化特征n（4）谷氨酸脱氢酶活力高，有利于谷氨酸的生成。n（5）谷氨酸生产菌经呼吸链氧化NADPH2的能力要求弱。n谷氨酸脱氢酶催化a-酮戊二酸还原氨基化反应时，需要有NADH2作为供氢体。如果NADPH2过多地经呼吸链氧化，使所带的氢跟氧结合生成水，那么由于氢的不足，将影响谷氨酸的生成。n（6）菌体本身进一步分解转化和利用谷氨酸的能力要低下，有利于谷氨酸的蓄积。 五、生产菌种的扩大培养五、生产菌种的扩大培养一、常用的生产菌株1、 谷氨酸生产菌的共同特征细胞呈球形、棒形或短杆形；革兰氏染色呈阳性反应；无鞭毛，不能运动；是需氧性的微生物；不形成芽孢；以生物素作为生长因子；具有一定的谷氨酸蓄积能力。 2、常用的生产菌株谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、嗜氨小杆菌、硫殖短杆菌等。北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌7338、北京棒杆菌D110、棒杆菌S-944、钝齿棒杆菌AS1.542、钝齿棒杆菌HU7251钝齿棒杆菌93、 培养基的配制培养基的配制1、斜面培养基 2 一级种子和二级种子培养基一级种子培养基。一级种子培养基应该营养丰富，有利于菌体的生长繁殖。为了避免培养过程中因产生有机酸引起培养基pH下降而造成菌体老化，所以培养基的含糖量要低，一般在2.5左右。 二级种子培养基通过一级种子扩大培养后，种量还不能满足发酵用的需要，因此需要进一步扩大培养。二级种子培养基的组成和原料来源应该与发酵培养基相一致，但配比上可有差异，这样就保证二级种子接到发酵罐后能很快适应环境，缩短发酵周期。 3 发酵培养基 发酵培养基不仅提供菌体生长繁殖所需要的营养和能量，而且是形成谷氨酸的物质来源。因此，这就要求发酵培养基含有足够的碳源和氮源，其量比种子培养基中的含量要高出很多。 三、三、 灭菌灭菌 1、无菌室的灭菌方法 2 、使用高压消毒锅的灭菌条件 3 、空罐灭菌 4、实罐灭菌5、 尿素的灭菌6 、消泡剂的灭菌7、 管路的灭菌8 、空气过滤器的灭菌四、 空气的净化1、空气的净化系统2、过滤介质五五 、种子扩大培养、种子扩大培养工艺流程保藏菌种斜面活化摇瓶种子培养种子罐发酵罐一级种子标准二级种子标准五五 、种子扩大培养、种子扩大培养1、一级种子培养通常谷氨酸发酵的接种量为1。 在1000ml三角瓶中，装入一级种子培养基180200ml，摇床上，在3032振荡培养1012h。 2、二级种子培养二级种子是在种子罐里培养的，培养二级种子时的接种量为0.2%0.5，温度为3234，培养时间为68h。注意事项：种子培养基的N源、生物素和P盐适当高，但G 2.5%左右。温度不要波动太大；适当通风搅拌；注意种子培养时间。第二节第二节 原料糖化及发酵培养基配制原料糖化及发酵培养基配制 谷氨酸发酵以糖蜜和淀粉为主要原料。一 糖蜜1 糖蜜：是制糖工厂的副产物，分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两大类，其中含较多的可发酵性糖，总糖含量：甘蔗糖蜜54.8%，甜菜糖蜜49.4%；总糖中主要是可发酵性糖。 目的：降低生物素的含量。方法：活性炭吸附法：用量为糖蜜的30%40%水解活性碳处理法：盐酸+活性碳 树脂处理法：2 糖蜜的处理(1)糖蜜中糖浓度高，必须进行稀释，一般稀释至1820%。(2)糖蜜中杂质很多，如黑色素、灰分等，必须进行澄清、过滤。一般采用加酸静置，加酸调pH 3.03.8，并定时通风，除溶液中的SO2、NO2等有害性挥发成分。(3)糖蜜中的含氮物质较少，应补充营养盐，如硫酸氨，磷酸钙等物质。(4)调pH 7.07.5。(5)灭菌：8090。2 糖蜜的处理二、淀粉质原料薯类、玉米、小麦、大米等。直链淀粉占17%27%，其余为支链淀粉。淀粉的水解有多种方法：酸解、酶解，酸酶结合法等，1、酸解法工艺：原料调浆 糖化 冷却 中和脱色 过滤除杂糖液 淀粉的酸解反应淀粉的酸解葡萄糖的复合反应 影响因素葡萄糖的分解反应 5-羟甲基糠醛 淀粉酸解法工艺要点糖化条件的控制淀粉乳浓度：10-110Be酸种类与用量：盐酸 干淀粉的0.6%，糖化温度和时间： 蒸汽直接加热 133,25min, 138,15min加酸方式:先加1/3,后2/3。糖化终点判定酒精法，酸解结束前，将少量酸解液滴入无水酒精中，若无白色沉淀出现，表示淀粉水解完全。酸解液的中和 液碱酸解液pH 1.5,调至4.5酸解液的除杂 活性炭 干淀粉量0.2%, 60-70,30min水解糖液的质量要求: 还原糖18%； 糖液清,呈浅黄绿色,550nm处透光率90%；无糊精；糖液新鲜2、目前生产中多采用酶解法。工艺流程原料 粉碎 加水 液化 糖化 淀粉水解糖 该工艺优点：淀粉的液化条件、方法、控制淀粉糖化 水解作用、酶来源、糖化工艺糖液透光率90%（420nm）。不含糊精、蛋白质（起泡物质）。转化率90%。DE值（Dextrose equivalent，葡萄糖当量值）还原糖浓度16%。糖液不能变质。三、 糖化液质量指标 发酵培养基的作用：发酵培养基的作用： 满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成三、 糖化液质量指标 葡萄糖葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。萄糖效应。工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖, ,但是糖液必须达到一但是糖液必须达到一定的质量指标。定的质量指标。四、发酵培养基的组成四、发酵培养基的组成（一）碳源（一）碳源 1. 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃 （1 1）淀粉水解糖的制备）淀粉水解糖的制备 （2 2）糖蜜原料）糖蜜原料 （3 3）碳源浓度过高时，对菌体生长不利，）碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类种类和所采用的发酵操作决定碳源种类2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加合适C/N氮源用于调整pH。合成菌体生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高。 氮源：铵盐、尿素、氨水氮源：铵盐、尿素、氨水 C/N C/N100100：1515 2121，实际高达，实际高达100100：2828 因为：因为：1 1）用于调整）用于调整pHpH。 2 2）分解产生的）分解产生的NHNH3 3从发酵液中逸出。从发酵液中逸出。 产酸阶段：产酸阶段： NH NH4 4+ +不足：使不足：使 - -酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。 NH NH4 4+ +过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。3.3.无机盐无机盐 磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中 磷酸盐对发酵有显著影响。磷酸盐对发酵有显著影响。 不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。 过多：过多：a.a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b. b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩 合生成缬氨酸的前体物合生成缬氨酸的前体物 乙酰乳酸，乙酰乳酸， 使使缬氨酸在发酵液中蓄积。缬氨酸在发酵液中蓄积。4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。8、锰：是许多酶的激活剂。9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。 4. 4. 生长因子：生物素生长因子：生物素 作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。 （1 1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoA CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响 磷酯的合成。磷酯的合成。 （2 2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为： a. a.乙醛酸循环活跃，乙醛酸循环活跃， - -酮戊二酸生成量减少。酮戊二酸生成量减少。 b. b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。n工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，应采用的最好方法是（应采用的最好方法是（ ）A A加大菌种密度加大菌种密度B B改变碳源和氮源比例改变碳源和氮源比例C C改变菌体细胞膜通透性改变菌体细胞膜通透性D D加大葡萄糖释放量加大葡萄糖释放量 为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？ 生物素生物素：乙酰：乙酰-CoA-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。酸的分泌和反馈调节。 生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍GluGlu分泌，并引起反馈分泌，并引起反馈抑制，加适量青霉素可提高抑制，加适量青霉素可提高GluGlu产量。产量。 青霉素青霉素：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。 第三节 谷氨酸发酵一、谷氨酸发酵控制原理1、发酵过程菌体变化 1 1）、适应期：）、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使该期缩短。 2 2）、对数生长期：）、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降；溶氧急剧下降后维持在一定水平；菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形；不产酸；12h。措施：措施：采取流加尿素办法及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH在7.5-8.0；维持温度30- 32 3 3、菌体生长停止期：、菌体生长停止期：谷氨酸合成，糖和尿素分解产生-酮戊二酸和氨用于合成谷氨酸。措措施：施：及时流加尿素以提供足够的氨并使pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37 。 4 4、发酵后期：、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一般为30h。2、温度对氨基酸发酵的影响及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。温度的控制。国内常用菌株的最适生长温度为3034， 产生谷氨酸的最适温度为3436。012h的发酵前期，主要是长菌阶段；发酵12h后，菌体进入平衡期，增殖速度变得缓慢；温度提高到3436，谷氨酸的生成量就增加。 3、pH对氨基酸发酵的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。 pH的控制 前期一般发酵前期pH控制在7.5-8.5左右，发酵中、后期pH控制在7.07.2，调低pH的目的在于提高与谷氨酸合成有关的酶的活力。尿素被谷氨酸生产菌细胞的脲酶所分解放出氨，因而发酵液的pH会上升。发酵过程中，由于菌体不断利用氨，以及有机酸和谷氨酸等代谢产物进入发酵液，使N源不足和发酵液pH下降，需再次流加尿素 。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。4 种龄和种量的控制 所谓种龄，是指在正常培养条件下，种子培养的时间。 种龄长短关系到种子活力的强弱，影响下一次增殖的适应期长短。 接种量多少，将明显影响种子生长期的长短。一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。 5、通气量的控制通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。氧对氨基酸发酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵溶解氧的控制 在实际生产中，搅拌转速固定不变，通常用调节通风量来改变供氧水平。通风比（ m3 /m3 .min ）：每分钟向1m3的发酵液中通入0.1cm3无菌空气，用1:0.1表示。 5 OD值的控制OD值是细菌个数、菌体大小和发酵液色泽深浅的综合反应。 以B9和T6-13菌株为例，当初糖为12.514%时，长菌期的OD净增值在0.70.9。当细胞进入平衡期后，OD值已达到最大值，此时细胞数不再增加，但因为细胞个体还会继续伸长增大，所以OD值会略有上升。5 OD值的控制生物素是谷氨酸生产菌不可缺少的生长因子。当培养基的生物素将被耗尽时，细菌就停止增殖。提高生物素的含量，OD值会上升，但一方面细胞的膜通透性会变差，影响谷氨酸从胞内往胞外渗出；另一方面，在高生物素环境下，菌体只进行增殖并不生成谷氨酸。因此，控制OD值的增长，是保证菌体在胞外大量蓄积谷氨酸的重要手段。6 泡沫的控制 生产上为了控制泡沫，除了在发酵罐内安装机械消泡器外，还在发酵时加入消泡剂。目前谷氨酸发酵常用的消泡剂有： 花生油、豆油、玉米油、棉子油、泡敌和硅酮等。 天然油脂类的消泡剂的用量较大，一般为发酵液的0.1%0.2%(体积分数)， 泡敌的用量为0.02%0.03%(体积分数)。 谷氨酸发酵控制（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。9.4 谷氨酸生产工艺三、三、 发酵异常现象及处理发酵异常现象及处理1 发酵过程的检查 OD值的测定 细胞形态的观察 还原糖的测定 pH的测定 温度的测定 通风量的测定 残脲的测定 谷氨酸的测定2 异常现象及处理污染杂菌和感染噬菌体引起的发酵异常a.污染杂菌 污染杂菌后，OD值增长快，糖耗也快，且发酵液泡沫增多，但谷氨酸生成量少。处理：如果发酵前期发现杂菌污染，可将培养基重新灭菌，并酌加培养基成分，重新接种后再发酵。如果发酵中期发现染菌，而pH、OD值和糖耗等尚属正常，此时可加大风量，按常规继续发酵。如果发酵后期染菌，一般对发酵影响不大。b.感染噬菌体感染噬菌体后，OD值不上升甚至下跌，因此发酵液pH上升且变得粘稠，泡沫也增多。发酵液中很少有谷氨酸蓄积。 处理：如果发酵前期发现感染噬菌体，可将培养基重新灭菌，或采用并罐法。如果发酵中期发现感染噬菌体，将培养基在70加热10min杀死噬菌体，补料补种，重新发酵。如果发酵后期染菌，一般对发酵影响不大。种子质量差引起的发酵异常将种龄过长或活力弱的种子接入发酵罐后，在发酵中、后期，糖耗就变得缓慢，pH不下降、波动不活跃，谷氨酸生成量少。处理：停止搅拌或减小通风量，追加生物素、磷盐和镁盐。 培养基配比差错引起的发酵异常a.生物素生物素是谷氨酸生产菌不可缺少的生长因子。生物素不足，长菌慢，糖耗慢，菌体生长不足。生物素过量，葡萄糖的消耗被用于菌体增殖。生物素生物素b.磷盐。磷在微生物细胞中含量较高，它是合成核酸、核蛋白、磷脂、各种核苷酸和辅酶的重要元素。如果培养基中不加或少加磷酸盐，则菌体生长缓慢，糖耗慢，最终菌体生长不足。如磷盐过多，糖的降解都通过EMP和TCA，菌体增殖快。发酵条件控制不当引起的发酵异常通风量、发酵前期通风量不足，影响不大；中后期供氧不足，则谷氨酸生成少。温度、发酵前期、中期温度过高，细胞易衰老；温度过低，发酵周期长。pH 谷氨酸棒状杆菌能谷氨酸棒状杆菌能够利用葡萄糖，经够利用葡萄糖，经过复杂的代谢过程过复杂的代谢过程形成谷氨酸；形成谷氨酸；但当终产物但当终产物谷氨谷氨酸的合成过量时，酸的合成过量时，就会抑制就会抑制谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶的活性，氢酶的活性，从而从而导致合成途径中断，导致合成途径中断，当谷氨酸浓度下降当谷氨酸浓度下降时，抑制作用就会时，抑制作用就会被解除，该合成反被解除，该合成反应又重新启动应又重新启动。第五节第五节 谷氨酸的分离纯化谷氨酸的分离纯化 谷氨酸发酵液、提取液和水解液中，还含有许多杂质:诸如丙氨酸、天门冬氨酸等其他氨基酸；乳酸、酮酸等有机酸；各种糖类；各种无机离子；微生物菌体等。需要通过一系列分离纯化技术，将杂质分离，才能得到所需的纯化谷氨酸。 谷氨酸分离纯化的方法主要有离心分离、沉淀分离、离心分离、沉淀分离、过滤与膜分离、层析分离过滤与膜分离、层析分离等。一一 、离心分离、离心分离离心分离是借助离心机高速旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。常速离心机 转速8000r/min，相对离心力 10kg高速 1-2.5 x 104 r/min，相对离心力10- 100kg超速 2.5 8 x 104 r/min，相对离心力8 x 108kg二二 、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件，使混合液中某种溶质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的技术。沉淀分离是谷氨酸分离纯化过程中经常使用的技术。 1、等电点沉淀法等电点沉淀法是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质具有不同的等电点这一特性，通过改变溶液的pH，而对两性电解质进行分离的技术。谷氨酸是两性物质，在等电点的条件下，谷氨酸的溶解度最小，谷氨酸的等电点为pH 3.22。它除与溶液的pH有关，温度越低，溶解度越小，很多生产厂采用低温等电点法。二二 、沉淀分离、沉淀分离2、复合沉淀法溶液中加入某些大分子物质，使之与微生物菌体、蛋白质等形成复合物而沉淀。3、加热沉淀法经加热使混合液中微生物菌体和蛋白质变性而沉淀。谷氨酸发酵液加热到80-85，使菌体蛋白除去。三三 、谷氨酸的离子交换层析、谷氨酸的离子交换层析1、原理：它是利用离子交换剂上的可解离的基团对各种离子的亲和力的不同，而使不同物质分离的技术。 由于谷氨酸是一种两性电解质，可以用阳离子交换树脂也可用阴离子交换树脂进行分离纯化。在溶液的pH小于3.22时，谷氨酸分子带正电荷，可以用阳离子交换树脂进行层析分离。由于在此条件下，阳离子交换树脂对谷氨酸的吸附力较弱，所以应采用强酸性阳离子交换树脂，若采用弱酸性阳离子交换树脂，则吸附性较差，容易脱落； 三三 、谷氨酸的离子交换层析、谷氨酸的离子交换层析在溶液的pH大于3.22时，谷氨酸分子带负电荷，则要用阴离子交换树脂进行层析分离，在此条件下，阴离子交换树脂对谷氨酸的吸附力较强，宜采用弱碱性阴离子交换树脂，若采用强碱性阴离子交换树脂，则吸附牢固而难以洗脱。 四、过滤与膜分离1、粗滤常压、加压、减压过滤2、膜分离技术加压膜分离静压膜分离 微滤、超滤、反渗透电场膜分离扩散膜分离第六节第六节 谷氨酸钠的生产谷氨酸钠的生产 谷氨酸钠，又称麸酸钠，谷氨酸一钠，学名为一氨基戊二酸一钠 谷氨酸钠的生产是在前述获得的纯化的谷氨酸的基础上，再经中和、脱色、浓缩、结晶、分离等步骤制造而成。 纯化谷氨酸中和脱色浓缩结晶分离味味精精发发酵酵生生产产工工艺艺流流程程一一 、谷氨酸的中和、谷氨酸的中和谷氨酸的中和是指谷氨酸与碱或碱性盐反应生成谷氨酸钠的过程。中和作用所使用的碱是氢氧化钠，使用的碱性盐为碳酸氢钠或碳酸钠。在谷氨酸钠的生产过程中，控制中和液的pH在6.46.7的范围，就可使谷氨酸大部分生成谷氨酸钠。pH过低，则中和不完全；pH过高，则生成较多谷氨酸二钠，都会使谷氨酸钠生成率降低。温度一般控制在60左右。 二二 、除铁、除铁在谷氨酸加碱中和后，中和液还需要进行除铁过程，即通过一些处理，以除去存在于中和液中过量的铁离子。由于铁离子容易氧化变成黄色，对谷氨酸钠的质量有所影响。所以谷氨酸钠产品必须控制铁离子的含量，一般要求低于5mgkg。(1)硫化钠除铁硫化钠除铁是在谷氨酸中和液中加入一定量10%左右浓度硫化钠溶液，生成硫化亚铁沉淀。 Fe2+ + Na2S FeS + 2Na+由于硫化亚铁在碱性条件下几乎不溶于水，而在酸性条件下溶解度较大，所以在操作时为了除铁较完全，应控制好pH，并加入稍过量的硫化钠。(2)离子交换树脂除铁 谷氨酸中和液中的铁，一般以二价或三价铁离子存在。可以采用适当的离子交换树脂进行离子交换而除去。我国常用于谷氨酸中和液除铁的离子交换树脂有通用一号树脂、122弱酸性阳离子交换树脂和酚醛树脂等。采用离子交换树脂除铁，除铁较完全，而且不会有残留的硫化钠存在于谷氨酸钠产品之中，在实际生产中较多采用。 三、脱色三、脱色(1)活性炭脱色采用颗粒状的活性炭进行脱色时，一般是让谷氨酸钠溶液通过活性炭柱，色素被吸附，而得到的流出液为脱除了色素的谷氨酸钠溶液。采用粉末状活性炭进行谷氨酸钠溶液的脱色时，一般是将粉末状的活性炭按溶液体积的1%2%的比例加到谷氨酸中和液中，不断搅拌2h左右，使活性炭充分吸附色素，然后通过过滤除去，以达到脱色目的。 (2)离子交换树脂脱色由于谷氨酸钠溶液中所带的色素大部分是与蛋白质结合的大分子物质，一般带负电荷，所以，选用的脱色树脂一般都是大孔径的阴离子交换脱色树脂。脱色是在谷氨酸中和、除铁以后进行，中和液的pH为6.46.7。脱色温度以4050为宜。四、四、 浓缩与结晶浓缩与结晶经过上述中和、除铁、脱色处理以后，得到较纯的谷氨酸钠溶液。该溶液含有大量的水，需要经过浓缩与结晶，才能得到所需的谷氨酸钠结晶产品。 1、浓缩在6570条件下进行蒸发浓缩，当溶液浓度达到3030.5波美度时，即可加入谷氨酸钠晶种进行结晶。2、结晶 自然起晶、刺激起晶、晶种起晶加入的晶种颗粒的大小一般为2440目，加入量一般为谷氨酸钠含量的10%15%。加入晶种后，慢慢搅拌。五、干燥五、干燥真空干燥、气流干燥、红外线干燥、冷冻干燥、吸附干燥、喷雾干燥等。在谷氨酸钠结晶的干燥方面，常用的有真空干燥和气流干燥等。 味精发酵设备 我国味精技术进展情况我国味精技术进展情况制糖工艺进展：制糖工艺进展：酸法水解酸法水解酶酸法水解酶酸法水解双酶法水解。双酶法水解。发酵工艺进展发酵工艺进展：亚适量生物素水平（产酸：亚适量生物素水平（产酸4 46g6gdldl） 高生物素水平（产酸高生物素水平（产酸121215g15gdldl）。）。提取工艺进展提取工艺进展：等电点法（少数锌盐法）：等电点法（少数锌盐法）等电离交法等电离交法 低温连续等电点法（少数厂家采用）。低温连续等电点法（少数厂家采用）。精制工艺进展：精制工艺进展：全粉炭脱色、硫化碱除铁全粉炭脱色、硫化碱除铁颗粒炭脱颗粒炭脱 色、树脂除铁。色、树脂除铁。