第第7章章 氨基酸、多肽、蛋白质和氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验酶类药品检验氨基酸类药物含量测定常用的方法氨基酸类药物含量测定常用的方法1.酸碱滴定法酸碱滴定法示例示例1：谷氨酸的：谷氨酸的含量测定含量测定示例示例2：赖氨酸片：赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸的测定2.非水溶液滴定法非水溶液滴定法示例：酪氨酸的示例：酪氨酸的含量测定含量测定3.定氮法定氮法示例：天门酰氨示例：天门酰氨片的含量测定片的含量测定赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸片中赖氨酸的测定中w1)为什么要用为什么要用NaOH调节调节pH为为7.0？w2）加入甲醛溶液的作用？）加入甲醛溶液的作用？w3）是直接滴定还是其他的滴定方式？）是直接滴定还是其他的滴定方式？非水溶液滴定法非水溶液滴定法w非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。w非水溶剂的种类非水溶剂的种类(1) 酸性溶剂酸性溶剂有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。(2) 碱性溶剂碱性溶剂有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。定氮法定氮法w样品与浓硫酸共热样品与浓硫酸共热,含含氮氮有机物有机物即分解产生氨即分解产生氨（消化消化），氨又与硫酸），氨又与硫酸作用，变成作用，变成硫酸硫酸氨。经氨。经强碱强碱碱化使之分解放出碱化使之分解放出氨，借氨，借蒸汽蒸汽将氨蒸至酸将氨蒸至酸液中，根据此酸液被液中，根据此酸液被中中和和的程度可的程度可计算计算得得样品样品之氮含量。之氮含量。 4.碘量法或溴量法碘量法或溴量法示例一：盐酸示例一：盐酸半胱氨酸水合物半胱氨酸水合物的测定的测定示例一：示例一：L-胱胱氨酸的测定氨酸的测定5.HPLC法法示例一：三氨示例一：三氨基酸注射液基酸注射液-341示例二：六氨示例二：六氨基酸注射液基酸注射液4006.氨基酸自动分析氨基酸自动分析仪仪碘量法碘量法w原理：半胱氨酸分子中含有原理：半胱氨酸分子中含有SH， 在酸性条在酸性条件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的量，间接求出硫化物的含量。量，间接求出硫化物的含量。 w注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，Na2S2O3 标液配制标液配制 碘量法的背景知识碘量法的背景知识w(一一) 方法简介方法简介w 碘碘量量法法也也是是常常用用的的氧氧化化还还原原滴滴定定方方法法之之一一。它它是是以以I2的的氧氧化化性性和和I-的的还还原原性性为为基基础础的的滴滴定定分分析析法法。因此，碘量法的基本反应是因此，碘量法的基本反应是 n由由E可可知知I2是是一一种种较较弱弱的的氧氧化化剂剂，能能与与较较强强的的还还原原剂剂作作用用；而而I-是是一一种种中中等等强强度度的的还还原原剂剂，能能与与许许多多氧氧化化剂剂作作用用，因因此此碘碘量量法法又又可可以以用用直直接接的的和和间间接接的的两种方式进行滴定。两种方式进行滴定。n 1、碘滴定法、碘滴定法(也称直接碘量法也称直接碘量法)n 电电位位比比EI2/I低低的的还还原原性性物物质质，可可以以直直接接用用I2的的标标准准溶溶液液滴滴定定的的并并不不多多，只只限限于于较较强强的的还还原原剂剂，如：如：S2-、SO32-、Sn2+、S2O32-、AsO32-、SbO33-等。等。w剩余碘量法剩余碘量法w在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，待待I2与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的碘滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的碘的量来计算药物含量的方法。的量来计算药物含量的方法。 w 2、滴定碘法、滴定碘法(间接碘量法间接碘量法)w 电电位位比比EI2/I高高的的氧氧化化性性物物质质，可可在在一一定定的的条条件件下下，用用碘碘离离子子来来还还原原，产产生生相相当当量量的的碘碘，然然后后用用Na2S2O3标标准准溶溶液液来来滴滴定定析析出出的的I2，这这种种方方法法叫叫做做间间接接碘碘量量法法或或称称为为滴滴定定碘碘法法。例例如如K2Cr2O7在在酸酸性性镕镕液液中中与过量的与过量的KI作用，析出的作用，析出的I2用用Na2S2O3标准溶液滴定。标准溶液滴定。w Cr2O72-+6I-+14H+2Cr3+3I2+7H2Ow I2+2S2O322I-+S4O62利利用用这这一一方方法法可可以以测测定定很很多多氧氧化化性性物物质质,如如ClO3-、ClO-、 CrO42-、 IO3-、 BrO3-、 SbO43-、 MnO4-、MnO2 、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等等等，以以及及能能与与CrO42-生生成成沉沉淀淀的的阳阳离离子子，如如Pb2+、Ba2+等等，所以滴定碘法的应用范围相当广泛。所以滴定碘法的应用范围相当广泛。w 碘碘量量法法常常用用淀淀粉粉作作指指示示剂剂，淀淀粉粉与与碘碘作作用用形形成成蓝蓝色色络络合合物物，灵灵敏敏度度很很高高，即即使使在在5106 mol/L溶液中亦能看出。溶液中亦能看出。w 淀淀粉粉指指示示剂剂应应在在近近终终点点时时加加入入，因因为为当当溶溶液液中中有有大大量量碘碘存存在在时时，碘碘可可被被吸吸附附在在淀淀粉粉表面，影响终点的正确判断。表面，影响终点的正确判断。 w 碘滴定液碘滴定液(0.1mol/L) I2=253.81 12.69g1000ml 【配制配制】 取碘取碘13.0g,加碘化钾加碘化钾36g与水与水50ml溶解后，加盐酸溶解后，加盐酸3滴与水适量使成滴与水适量使成1000ml，摇，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。匀，用垂熔玻璃滤器滤过。 w 碘碘量量法法的的主主要要误误差差来来源源，一一是是I2易易挥挥发发，二二是是I-易被空气中的氧所氧化。易被空气中的氧所氧化。w 为防止为防止I2挥发，应采取以下措施：挥发，应采取以下措施：w 1. 加加入入过过量量KI，KI与与I2形形成成I3，以以增增大大I2的的溶溶解解度，降低度，降低I2的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。w 此此外外，加加入入过过量量的的KI，可可以以加加快快反反应应的的速速度度和和提提高反应的完全程度。高反应的完全程度。w 2.反反应应时时溶溶液液的的温温度度不不能能高高，一一般般在在室室温温下下进进行行。因因升升高高温温度度增增大大I2的的挥挥发发性性，降降低低淀淀粉粉指指示示剂剂的的灵灵敏敏度度。保保存存Na2S2O3溶溶液液时时，室室温温升升高高，加加速速Na2S2O3的分解。的分解。w 3.析析出出碘碘的的反反应应最最好好在在带带塞塞的的碘碘量量瓶瓶中中进进行行，滴滴定切勿剧烈摇动。定切勿剧烈摇动。w 为防止为防止I-被空气中的氧所氧化，被空气中的氧所氧化，应采取以下措施应采取以下措施：w 1.避光避光 光线能催化光线能催化I被空气氧化。被空气氧化。w 2.溶溶液液pH值值的的影影响响 S2O32与与I2之之间间的的反反应应必必须须在在中中性性或或弱弱酸酸性性溶溶液液中中进进行行。因因为为在在碱碱性性溶溶液液中中，I2与与S2O32将会发生下述副反应：将会发生下述副反应：w S2O32+4I2+10 OH2SO42+8I十十5H2Ow 而且，而且，I2在碱性溶液中还会发生歧化反应：在碱性溶液中还会发生歧化反应：w 3 I2+6OHIO3+5I+3H2Ow 如如 果果 在在 强强 酸酸 性性 溶溶 液液 中中 ， Na2S2O3溶溶 液液 会会 发发 生生 分分 解解 ： S2O32+2H+SO2+S+ H2Ow 同时，同时，I在酸性溶液中也容易被空气中的在酸性溶液中也容易被空气中的O2氧化：氧化：w 4I+4H+O2=2I2+2H2O w 3.在在间间接接碘碘量量法法中中，当当析析出出碘碘的的反反应应完完成成后后，应应立立即即用用Na2S2O3进进行行滴滴定定(避避免免I2的的挥挥发发和和I被被空空气气氧氧化化)。w（二）应用实例（二）应用实例w1.铜矿石中铜的测定铜矿石中铜的测定w 矿矿石石经经HCl、HNO3、溴溴水水和和尿尿素素处处理理成成溶溶液液后后、用用NH4HF2掩掩蔽蔽试试样样中中的的Fe3+，使使其其形形成成稳稳定定的的FeF63-络络合合物物，并并调调节节溶溶液液的的pH为为3.54.0，加加入入KI与与Cu2+反反应应，析析出出的的I2，用用Na2S2O3标标准准溶溶液液滴滴定定，以以淀淀粉粉为为指示剂，反应式如下：指示剂，反应式如下：w 2Cu2+4I2CuI+I2w I2十十2S2O322I+S4O62w 本法可测定矿石中本法可测定矿石中0.5%以上的铜。以上的铜。 w 2.钡盐中钡的测定钡盐中钡的测定w 在在HAc-NaAc缓缓冲冲溶溶液液中中，CrO42能能将将Ba2+沉沉淀淀为为BaCrO4。沉沉淀淀经经过过滤滤、洗洗涤涤 后后 ， 用用 稀稀 HCl溶溶 解解 ， 加加 入入 过过 量量 KI，Cr2O72将将I氧氧化化为为I2，析析出出的的I2，以以淀淀粉粉为为指指示示剂剂用用Na2S2O3标标准准溶溶液液滴滴定定。反反应应式式如下：如下：w Ba2+ CrO42BaCrO4 (黄黄)w 2BaCrO4+4H+2 Ba2+H2Cr2O7+H2Ow Cr2O72+6I+14H+3I2+2Cr3+7H2Ow I2+2S2O322I+S4O62HPLC（高效液相色谱）柱的类型：柱的类型： 检测器类型：检测器类型：固定相：固定相： 流动相：流动相：氨基酸自动分析仪w一种专门用来分析氨基酸的自一种专门用来分析氨基酸的自动化的液相色谱仪。动化的液相色谱仪。w原理：蛋白质经盐酸水解原理：蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分酸分析仪的离子交换柱分离，与茚三酮溶液产生颜离，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。计比色测定氨基酸含量。w 一份水解液可同时测定天一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，精氨酸等冬，苏，丝，精氨酸等16种氨基酸。种氨基酸。多肽类药品检测1.酸碱滴定法酸碱滴定法2.紫外分光光度法紫外分光光度法3.效价测定法（略）效价测定法（略） 示例一：抑肽酶效价的测定示例一：抑肽酶效价的测定 示例二：杆菌肽效价的测定示例二：杆菌肽效价的测定蛋白质类药品的检验蛋白质类药品的检验w定氮法定氮法w电泳法（重点介绍）电泳法（重点介绍）w生物检定法生物检定法w电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。荷的电极移动的现象。w醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。为宜。w特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时间短，一般电泳间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需整个电泳完成仅需90min左右。左右。醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白效价单位Uw效价效价:指某一物质引起生物反应的功效单位指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理可用理化方法检测化方法检测,也可用生物检测方法测定，通常以重量也可用生物检测方法测定，通常以重量单位或效价单位来计量。不同的药物有各自的效价单位或效价单位来计量。不同的药物有各自的效价的定义。的定义。w某些生化药物，其药物中含有一些杂质，不可能是某些生化药物，其药物中含有一些杂质，不可能是纯品。故不能以重量单位准确表示其含量，只能依纯品。故不能以重量单位准确表示其含量，只能依靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的效价剂量。因此，采用特定的效价剂量。因此，采用特定的“单位单位”“U”来来计量。产生相同效应药品的剂量比较时，所需剂量计量。产生相同效应药品的剂量比较时，所需剂量越小，药物的效价就越高，反之效价就低。越小，药物的效价就越高，反之效价就低。w临床上常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂临床上常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素类药。这些药物依中国药典规定，均以其特有的药类药。这些药物依中国药典规定，均以其特有的药理效价表示剂量。理效价表示剂量。w肝素的效价是以每毫克肝素制剂肝素的效价是以每毫克肝素制剂(602mmHg柱真空柱真空干燥干燥3小时小时)所相当的单位数来表示。所相当的单位数来表示。1U为为24h内在内在冷处阻止冷处阻止1ml猫血凝结所需的最低肝素量。在制药猫血凝结所需的最低肝素量。在制药工业的发展过程中，随着制药工艺的提高，药物的工业的发展过程中，随着制药工艺的提高，药物的纯度也逐年提高，其生物效价亦随之愈来愈高。该纯度也逐年提高，其生物效价亦随之愈来愈高。该药研制初期的生物效价，每药研制初期的生物效价，每1.0mg效价相当于效价相当于125U,1977版中国药典规定肝素钠每版中国药典规定肝素钠每1.0mg效价不效价不得少于得少于140U，而，而1995版药典则定为每版药典则定为每1.0mg效价不效价不得少于得少于150U，2005年为不少于年为不少于156U，2010年版改年版改为不得少于为不得少于170U。酶类药品检验-酶活力测定法酶活力概念w 酶活力酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。活力低。w但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。它的催化能力进行定量。所以，酶的定量就是测定所以，酶的定量就是测定所以，酶的定量就是测定所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。酶的活力，也即测定酶促反应的速度。酶的活力，也即测定酶促反应的速度。酶的活力，也即测定酶促反应的速度。一. 酶活力的测定：（一）酶活力测定的基本知识： 酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，真正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。 酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有(如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话)，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。 测定酶活力时通常都附有适当的对照(control )以消除非酶促反应所生成的产物，常用的对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。 1.样品对照 若测定酶活力的样品是粗提取液，属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物，也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。 2.底物对照 某些酶的底物能自发(非酶促)地分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。 3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。 （二）酶活力测定的方法： 酶活力测定要符合两个原则： 在零级反应期测定，即-s或p与反应时间t成正比， 反应速度与酶量成线性关系，即 E E= = k(-k(-s s/ t) = / t) = k kp p/ t/ t 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法 如何测定酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线速度曲线速度曲线速度曲线0 0产产物物浓浓度度时间时间注意：初速度的注意：初速度的注意：初速度的注意：初速度的测定是关键。测定是关键。测定是关键。测定是关键。可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降产产物物浓浓度度时间时间0 0原原原原 因因因因vv底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度的的的的降降降降低低低低、产产产产物物物物的的的的增增增增加加加加造造造造成成成成的的的的逆反应的加快逆反应的加快逆反应的加快逆反应的加快vv产物的抑制作用产物的抑制作用产物的抑制作用产物的抑制作用vv酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活1.定时法: 测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法。因t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一般 取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间(t2)后终止反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。 这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。 因此，用定时法测定酶活力时，应先做预试验来确定线性时间，并在线性时间内进行测定，否则，不能用p除以t来表示每分钟产生的p，并用其计算酶活力单位。 2.连续监测法: 连续测定(每15s-1min监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只测定两个时间 点，而连续监测法则进行多点连续测定。 这种方法的优点是可将多点的测定结果(s或p的变化)连接成线，容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高，也较为准确，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。 用连续监测法测定的缺点是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器(比色计或分光光度计)必须有保温装置，而且产物(或底物)应是可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物(或产物)有明显差别，否则，需加入其它试剂(如显色剂、酶试剂等)，将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。3.平衡法: 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称终点法。因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。 用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把p或s 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆 反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监 测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。 (三) 酶活力的表示方法: 酶活力的大小是以酶单位数表示的。所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间(秒、分、小时)内反应物的变化量(毫克、微克、微 摩尔、摩尔等)。酶单位一般有三种表示方法。 1.惯用单位 : 60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、 甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义。这这种种单单位位简简单单方方便便，省省去去了了许许多多计计算算；但但只只能能进行酶活力的相对比较。进行酶活力的相对比较。 酶酶酶酶习习习习惯惯惯惯上上上上或或或或测测测测定定定定时时时时使使使使用用用用的的的的反反反反应应应应速速速速度度度度的的的的单单单单位位位位定定定定义义义义为为为为酶酶酶酶的的的的活活活活力力力力单单单单位位位位。有有有有的的的的甚甚甚甚至至至至直直直直接接接接用用用用测测测测得得得得的的的的物物物物理理理理量量量量，如如如如单单单单位位位位时时时时间间间间内内内内消消消消光光光光值值值值的的的的变变变变化化化化 ( (D D D DA/t) A/t) 表表表表示示示示酶酶酶酶活活活活力单位。力单位。力单位。力单位。2. 国际单位 : 1961年国际生化学会(IUB)酶学委员会建议使用统一的国际单位(IU)。规定一 个国际单位(IU)为在实验规定的条件下(如温度为25、最适pH、最适底物浓度时)，每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。酶的浓度可以IU/L或IU/mL来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算 。 国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。但也有不少缺点，如 ：从惯用单位换算成国际单位比较麻烦；某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数； 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的不同，常采用不同的测定温度，如25、30、37等，这也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。 3.katal3.katal单位单位 1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal(简称kat)，即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为1kat单位。1kat = 601kat = 6010106 6 IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力比活力 酶活力单位数酶活力单位数（U U）酶蛋白质量酶蛋白质量（mgmg）酶的比活力酶的比活力 酶的酶的纯度纯度 纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数 = = 每次比活力每次比活力每次比活力每次比活力/ /第一次比活力第一次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率产率产率( ( ( (回收率回收率回收率回收率) ) ) ) = = 每次总活力每次总活力每次总活力每次总活力/ /第一次总活力第一次总活力第一次总活力第一次总活力100%100% 示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL300mL300mL300mL含有含有含有含有150mg150mg150mg150mg蛋白质，总活力为蛋白质，总活力为蛋白质，总活力为蛋白质，总活力为360360360360单位。经过一系列纯化单位。经过一系列纯化单位。经过一系列纯化单位。经过一系列纯化以后得到的以后得到的以后得到的以后得到的4mL4mL4mL4mL酶制品酶制品酶制品酶制品( ( ( (含有含有含有含有0.08mg0.08mg0.08mg0.08mg蛋白蛋白蛋白蛋白) ) ) )，总活力为，总活力为，总活力为，总活力为288288288288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？酶活力测定的方法w有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。w终止反应法终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。w连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。 酶活力测定的步骤w配制底物、对照品溶液、供试品酶溶液等配制底物、对照品溶液、供试品酶溶液等 。w确定酶催化反应的温度、确定酶催化反应的温度、pH、浓度、辅助因、浓度、辅助因子等反应条件。子等反应条件。w进行酶促反应，准确记录反应时间。进行酶促反应，准确记录反应时间。w终点法（终止反应）、连续法测定产物的增终点法（终止反应）、连续法测定产物的增量。量。常见的测定方法有分光光度法、荧光法、化学反应法等。常见的测定方法有分光光度法、荧光法、化学反应法等。w计算酶活力。计算酶活力。 学习学习FolinFolin- -酚法测定蛋白酶活力的原理方法酚法测定蛋白酶活力的原理方法 掌握分光光度计的操作方法掌握分光光度计的操作方法【目的要求目的要求】实验实验 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定【重点掌握重点掌握】 蛋白酶浸提、分离、提取技术蛋白酶浸提、分离、提取技术 最适条件下酶促水解反应的操作程序最适条件下酶促水解反应的操作程序 酶活力的测定及活力单位的计算酶活力的测定及活力单位的计算【重点掌握重点掌握】 测定酶活的程序测定酶活的程序1 1 1 1、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度2 2 2 2、最适条件、最适条件、最适条件、最适条件下下下下进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应3 3 3 3、测定反应量、测定反应量、测定反应量、测定反应量4 4 4 4、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力【重点掌握重点掌握】 1 1 1 1、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度 在在在在底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即吸光度限制在吸光度限制在吸光度限制在吸光度限制在0.250.250.250.250.400.400.400.40范围内。范围内。范围内。范围内。【重点掌握重点掌握】2 2 2 2、最适条件、最适条件、最适条件、最适条件下下下下进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应最适温度最适温度最适温度最适温度 37 37 37 37 恒温水浴恒温水浴恒温水浴恒温水浴 最适最适最适最适pHpHpHpH值值值值 pH7.5 pH7.5 pH7.5 pH7.5 缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液底物浓度足够大底物浓度足够大底物浓度足够大底物浓度足够大 1% 1% 1% 1% 酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液1mL1mL1mL1mL反应时间准确反应时间准确反应时间准确反应时间准确 10min 10min 10min 10min及时灭活及时灭活及时灭活及时灭活 三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸 2mL2mL2mL2mL【重点掌握重点掌握】 3 3 3 3、测定反应量、测定反应量、测定反应量、测定反应量 测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量 测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量 4 4 4 4、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力 酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，1min1min1min1min水解酪蛋水解酪蛋水解酪蛋水解酪蛋白产生白产生白产生白产生1g1g1g1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪蛋白酪蛋白蛋白酶蛋白酶酪氨酸酪氨酸比色测定比色测定钼蓝钼蓝钨蓝钨蓝酪氨酸酪氨酸FolinFolin- -酚试剂酚试剂【实验原理实验原理】pHpHpHpH值、温度值、温度值、温度值、温度OHOHOHOH- - - - 1 1 1 1）用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与FolinFolinFolinFolin- - - -酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液，680nm680nm波波长处，作出长处，作出酪氨酸浓度酪氨酸浓度- 吸光度标准曲线。吸光度标准曲线。 2 2 2 2）用用酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作，比色后，查阅，比色后，查阅标准曲线，即可求得待测酶活力。标准曲线，即可求得待测酶活力。操作程序操作程序 1 1、取、取6 6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂； 2 2、混匀器充分、混匀器充分混匀后，混匀后，置置3737恒温水浴反应恒温水浴反应20min20min； 3 3、以、以0 0# # 管做参比，分别比色测定各管管做参比，分别比色测定各管A A680 680 ； 4 4、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为吸光度为1 1时的酪氨酸的量（时的酪氨酸的量（gg）即为）即为K K值。值。【实验器材实验器材实验器材实验器材】一、一、一、一、标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制 1 1、取、取6 6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂； 2 2、混匀器充分、混匀器充分混匀后，混匀后，置置3737恒温水浴反应恒温水浴反应20min20min； 3 3、以、以0 0# # 管做参比，分别比色测定各管管做参比，分别比色测定各管A A680 680 ； 4 4、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为吸光度为1 1时的酪氨酸的量（时的酪氨酸的量（gg）即为）即为K K值。值。【操作方法操作方法】 【操作方法操作方法】二、待测酶液的制备二、待测酶液的制备二、待测酶液的制备二、待测酶液的制备 称取酶粉称取酶粉0.500g0.500g，用少量，用少量pH7.5pH7.5pH7.5pH7.5缓冲液溶解缓冲液溶解用缓冲液定容至用缓冲液定容至50mL50mL容量瓶中（容量瓶中（N =100N =100N =100N =100倍倍倍倍）。摇）。摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（至吸光度在缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（至吸光度在0.250.250.400.40范围内，范围内，N =1000N =1000N =1000N =1000倍倍倍倍）。）。【操作方法操作方法】取取3 3支试管，分别加入支试管，分别加入1mL1mL酶液，置酶液，置3737预热预热5min5min空白管空白管 平行管平行管2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸3737，10min10min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸3737，10min10min1mL 1%1mL 1%酪蛋白酪蛋白3737，10min10min1mL 1%1mL 1%酪蛋白酪蛋白3737，10min10min过过 滤滤（1）（2）（3）三、蛋白酶活力的测定三、蛋白酶活力的测定三、蛋白酶活力的测定三、蛋白酶活力的测定【操作方法操作方法】【操作方法操作方法】另取另取3 3支试管，分别支试管，分别取取管滤液管滤液1mL1mL（3）各加入各加入5mL Na5mL Na2 2COCO3 3溶液溶液1mL 1mL FolinFolin酚试剂酚试剂（4）3737反应反应20min20min（5）（6）比色测定比色测定A A680680， 管做参比管做参比可见分光光度计可见分光光度计四、酶活力的计算四、酶活力的计算四、酶活力的计算四、酶活力的计算酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，1min1min水解酪蛋白产生水解酪蛋白产生1g1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。蛋白酶活力（蛋白酶活力（u/gu/g或或u/mLu/mL）=AK=AK4 4 NN1 10 0 式中式中 AA样品平行试验的平均吸光度；样品平行试验的平均吸光度；K K 吸光常数；吸光常数；4 4 反应试剂的总体积（反应试剂的总体积（mLmL）；）；1010 反应时间反应时间10min10min，以，以1min1min计；计；N N 稀释倍数稀释倍数 所得结果表示至整数。所得结果表示至整数。【操作方法操作方法】酶类药品检验 -效价测定