微生物学实验微生物学实验实实 验验 要要 求求坚持课前预习坚持课前预习不迟到，不早退，更不能无故缺课；不迟到，不早退，更不能无故缺课；严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录；严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录；保持实验室整洁保持实验室整洁注意安全注意安全事实求是地、独立地写好实验报告事实求是地、独立地写好实验报告实验报告实验报告姓名、班级和学号姓名、班级和学号实验题目实验题目实验原理（略写）实验原理（略写）实验操作（略写）实验操作（略写）实验结果实验结果画图画图文字描述文字描述分析和讨论分析和讨论思考题思考题实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察形态的观察教学目标或要求：教学目标或要求：巩固和掌握显微镜油镜的正确使用；巩固和掌握显微镜油镜的正确使用；学习细菌制片和单染色技术；学习细菌制片和单染色技术；观察细菌的三种基本形态；观察细菌的三种基本形态；对对人人体体上上的的微微生生物物染染色色检检查查，初初步步建建立立无无菌菌操操作作的的概念；概念；学习细菌的革兰氏染色原理和方法学习细菌的革兰氏染色原理和方法 。显微镜油镜的使用显微镜油镜的使用油镜头的识别和重要参数油镜头的识别和重要参数油镜物油镜物镜的工作原理镜的工作原理油镜的使用方法和注意事项油镜的使用方法和注意事项油镜头的识别和重要参数油镜头的识别和重要参数放大倍数放大倍数数值口径数值口径工作距离工作距离油镜物油镜物镜的工作原理镜的工作原理使用油质作为玻片与接物使用油质作为玻片与接物镜镜之间的介质之间的介质油浸系油浸系可以增加显微镜的放大倍数可以增加显微镜的放大倍数可以增加视野的照明度可以增加视野的照明度可以增大显微镜的分辨率可以增大显微镜的分辨率油镜的使用方法和注意事项油镜的使用方法和注意事项1、用低倍镜对光。最大光圈、用低倍镜对光。最大光圈2、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4、油镜观察：高倍镜观察后、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒上升镜筒- -油镜转至正下方，在油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油载玻片上加一小滴油- -小心地下降镜筒使镜头浸在油里小心地下降镜筒使镜头浸在油里- -用粗用粗螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰物象清晰- -观察记录。最大光圈观察记录。最大光圈5、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。去残留在镜头上的二甲苯。6、将显微镜各部分还原，放回箱中。、将显微镜各部分还原，放回箱中。细菌的制片与染色细菌的制片与染色1单单染色染色1复染色复染色染染 料料碱性染料碱性染料带正电染料。其阳离子部分为发色基团，带正电染料。其阳离子部分为发色基团，可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫沙黄可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫沙黄, 甲基蓝甲基蓝,碱性复红等。碱性复红等。酸性染料酸性染料带负电染料。其阴离子部分为发色基团，带负电染料。其阴离子部分为发色基团，可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红 等。等。脂溶性染料脂溶性染料如如Sudan black。 多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为以下类型：以下类型：涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色12min水洗、吸干镜检镜检细菌的单染色革兰氏染色法革兰氏染色法：是是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.GramC.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌细菌区分为革兰氏阳性菌（G G+ +）和革兰氏阴和革兰氏阴性菌性菌（G G）两大类，是细菌学上最常用的鉴两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为别染色法。该染色法所以能将细菌分为G G+ +菌菌和和G G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。的不同所决定的。革兰氏染色法革兰氏染色法基本原理基本原理vG G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。成红色。 vG G+ +菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。低，因此细菌仍保留初染时的颜色。1 1、活材料活材料：培养：培养2424小时的大肠杆菌和小时的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌。2 2、染色液和试剂染色液和试剂：结晶紫、碘液、：结晶紫、碘液、95%95%酒精、石炭酸复红酒精、石炭酸复红 、蒸馏水蒸馏水、香柏油。、香柏油。3 3、器材器材：载玻片、接种杯、酒精灯、：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。擦镜纸、显微镜。实验材料实验材料（1 1）涂片涂片 （2 2）晾干晾干（3 3）固定固定（4 4）结晶紫染色结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色面）的结晶紫染色液染色1min1min；水洗：倾；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。去染色液，用水小心地冲洗。（5 5）媒染媒染：碘液，媒染：碘液，媒染1min1min；水洗：用水水洗：用水洗去碘液。洗去碘液。方法与步骤（6 6）脱色脱色：将玻片倾斜，连续滴加：将玻片倾斜，连续滴加95%95%乙醇脱乙醇脱色色151520s20s至流出液无色，立即水洗。至流出液无色，立即水洗。（7 7）复染复染：滴加复红复染：滴加复红复染1min1min；水洗：用水水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。洗去涂片上的复红染色液。（8 8）晾干晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。：将染好的涂片用吸水纸吸干。（9 9）镜检镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结果。果。革兰氏染色法革兰氏染色法操作步骤操作步骤涂片涂片干燥干燥固定固定结晶紫结晶紫1min水洗水洗I-KI 1min水洗水洗95%乙醇脱色约乙醇脱色约1520s水洗水洗沙黄或石炭酸复红沙黄或石炭酸复红 1min水洗水洗干燥干燥镜检镜检 革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌实验内容实验内容1 1、用用石石炭炭酸酸复复红红对对苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌、大大肠肠杆杆菌菌进进行行单单染染色色，在在显显微微镜镜油油镜镜下下观观察察形态；形态；2.2.用用混混合合涂涂片片的的方方法法对对大大肠肠杆杆菌菌、苏苏云云金金芽孢杆菌进行革兰氏染色芽孢杆菌进行革兰氏染色3.3.自选材料：用牙签挑取牙垢观察自选材料：用牙签挑取牙垢观察1.1.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色。如脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。严格规定。注意事项注意事项2.2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。而影响染色效果。3.3.选用幼龄的细菌。选用幼龄的细菌。G+G+菌培养菌培养12h-16h12h-16h，E.coliE.coli培养培养24h24h。若菌龄太老，由于菌体死若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。绘出革兰氏染色后大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的形绘出革兰氏染色后大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的形态图并说明染色结果。态图并说明染色结果。思考题：你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的思考题：你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染色结果可信？色结果可信？实验报告实验报告