高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）简介）简介盛盛 卫卫 坚坚目目 录录1, 液相色谱分析法的发展液相色谱分析法的发展2, 高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点3, 高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪简介4, 液相色谱法介绍液相色谱法介绍5, 分析方法的选择分析方法的选择6, 实际分析操作过程实际分析操作过程1、液相色谱分析法的发展、液相色谱分析法的发展v2020世纪初：世纪初： 俄国植物学家茨维特提出俄国植物学家茨维特提出经典液经典液相色谱法相色谱法。经典液相色谱法包括柱色。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。谱、薄层色谱、纸色谱。v2020世纪世纪6060年代末：年代末：随着随着色谱理论色谱理论的发展、的发展、高效细微高效细微固定相固定相的开发、的开发、高压恒流泵高压恒流泵及及高灵敏高灵敏度检测器度检测器的应用，高效液相色谱法得的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。到了突破性的发展。2.12.1 HPLC的特点的特点（一）（一） 项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法色谱柱：柱长色谱柱：柱长/cm/cm 柱内径柱内径/mm/mm101025252 21010101020020010105050固定相粒径固定相粒径/ /mm5 550507575600600色谱柱柱效色谱柱柱效（理论塔板数）（理论塔板数）2 210103 35 510104 42 25050柱压降柱压降/MP/MPa a5 515150.0010.0010.30.3进样量进样量/g/g1010-6-61010-2-20.10.11010分析时间分析时间/h/h0.050.051.01.01 120202 HPLC的特点的特点.2 .2 HPLCHPLC的特点（二）的特点（二）项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法进样方式进样方式样品制成溶液样品制成溶液样品需气化或裂解样品需气化或裂解流动相流动相溶液溶液惰性气体惰性气体分离原理分离原理吸附、分配、筛析、亲和等吸附、分配、筛析、亲和等吸附和分配吸附和分配检测器检测器UVDUVD、PDADPDAD、RIDRID等等TCDTCD、FIDFID、ECDECD等等应用范围应用范围低、中、高沸点有机化合物低、中、高沸点有机化合物离子型无机化合物离子型无机化合物热不稳定化合物热不稳定化合物生物活性分子生物活性分子低沸点有机化合物低沸点有机化合物永久性气体永久性气体3 3、液相色谱仪简介、液相色谱仪简介 贮液罐贮液罐A A 高压输液泵高压输液泵A A 阻尼器阻尼器A A 贮液罐贮液罐B B 高压输液泵高压输液泵B B 阻尼器阻尼器B B 初步混合器初步混合器 压力传感器压力传感器 混合器混合器 进样器进样器 色谱柱色谱柱 检测器检测器 谱图输出谱图输出3.13.1高效液相色谱仪构造高效液相色谱仪构造3.23.2高压输液泵简介高压输液泵简介高压输液泵的一般要求：高压输液泵的一般要求：泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀；泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀；耐压耐压40 40 50MPa50MPa，能连续工作；，能连续工作； 输出流量稳定，重复性佳；输出流量稳定，重复性佳；输出流量范围宽，对填充柱：输出流量范围宽，对填充柱：0.1 0.1 100mL100mLminmin。注射型泵注射型泵-输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。恒流泵恒流泵往复型泵往复型泵-造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。恒压泵恒压泵-压力恒定，但流量不恒定；压力恒定，但流量不恒定；3.33.3阻尼器介绍阻尼器介绍阻尼器阻尼器-消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。3.4.1 3.4.1 检测器简介（一）检测器简介（一）紫外吸收紫外吸收检测器（检测器（UVDUVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率透光率的的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（1010-9-9g g）。）。折光指数折光指数检测器（检测器（RIDRID）原理：监测参比池和测量池中溶液的原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率折射率之差来测量试样之差来测量试样浓度的检测器。浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在特点：通用性检测器，温变化要保持在0.0010.001、灵敏度、灵敏度低（低（1010-6-6g g）。）。3.4.2 3.4.2 检测器简介（二）检测器简介（二） 电导电导检测器（检测器（ECDECD） 原理：监测溶液的原理：监测溶液的电导率变化电导率变化的检测器。的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（组成变化有明显响应、灵敏度低（1010-3-3g g）。适用于离子）。适用于离子型化合物。型化合物。 荧光荧光检测器（检测器（FLDFLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（特点：选择性检测器、灵敏度高（1010-12-12g g）、对流量和）、对流量和温度敏感性低。温度敏感性低。3.4.3 3.4.3 检测器简介（三）检测器简介（三） 蒸发光散射蒸发光散射检测器（检测器（ELSDELSD）原理：通过检测原理：通过检测光散射光散射程度而测定溶质浓度的检测器。程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。度高，是通用型检测器。4 4、色谱分析法简介、色谱分析法简介液固色谱液固色谱-以以固体吸附剂固体吸附剂为固定相，依靠吸附脱附为固定相，依靠吸附脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。氧化镁、活性炭等。特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。液液色谱液液色谱-以吸附载带在惰性固相载体上的以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非极性或非极性固定液极性固定液为固定相，依靠溶解解吸平衡实现分离。为固定相，依靠溶解解吸平衡实现分离。特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。4.1.14.1.1色谱分析法介绍（一）色谱分析法介绍（一）4.1.24.1.2色谱法简介（二）色谱法简介（二） 体积排阻体积排阻色谱法色谱法-以以多孔性凝胶多孔性凝胶为固定相，借为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。小分别先后流出。特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。 适用范围：分子量差别较大的样品。适用范围：分子量差别较大的样品。 离子对色谱离子对色谱法法-分析离子化的分析离子化的强极性强极性化合物。化合物。 亲和亲和色谱法等等色谱法等等4.1.3 色谱法简介（三）色谱法简介（三）键合相键合相色谱法简介色谱法简介键合相色谱键合相色谱-是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决决固定液的流失固定液的流失问题问题, ,是目前用的最多的一种是目前用的最多的一种色谱分析法。色谱分析法。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。法与反相键合相色谱法。正相键合相色谱正相键合相色谱-固定相极性强；固定相极性强；反相键合相色谱反相键合相色谱-固定相极性弱。固定相极性弱。.2.1 .2.1 色谱柱简介（一）色谱柱简介（一）v正相柱正相柱-固定相通常为硅胶以及其他具有固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团极性官能团胺基团，如胺基团，如（NHNH2 2）和氰基团（）和氰基团（CNCN）的键合相填料。）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（由于硅胶表面的硅羟基（SiOHSiOH）或其他极性基团极性较强，因此，）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。已烷，氯仿，二氯甲烷等。 v反相柱反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱极性相对较弱官能团官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：常用的反向填料有：C18C18（ODSODS）、）、C8C8（MOSMOS）、）、C4C4（ButylButyl）、）、C6H5C6H5（PhenylPhenyl）等。）等。 4.2.2 4.2.2 色谱柱简介（二）色谱柱简介（二） 聚合物填料柱聚合物填料柱-通常为聚苯乙烯通常为聚苯乙烯二乙烯基苯或聚二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等甲基丙烯酸脂等. . 优点：优点：PHPH值为值为114114均可使用；具有更强的疏水性；大均可使用；具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。 缺点：色谱柱柱效较低。缺点：色谱柱柱效较低。 其它无机填料柱其它无机填料柱-如石墨化碳黑正逐渐成为反向色如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。由于在谱柱填料。由于在HPLCHPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任流动相中不会被溶解，这类柱可在任何何PHPH与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。氧化铝也可以用于氧化铝也可以用于HPLCHPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在色谱柱柱床，其优点是可以在PHPH高达高达1212的流动相中使用。的流动相中使用。4.2.3 4.2.3 色谱柱简介（三）色谱柱简介（三）v手性柱手性柱-将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外消旋物的广泛分离。如下图：消旋物的广泛分离。如下图：特点：具有专一性、通用性不广。特点：具有专一性、通用性不广。价格较贵。价格较贵。5 5、分析方法的建立、分析方法的建立5.1 5.1 色谱柱的选择：色谱柱的选择：疏水性的样品疏水性的样品反相键合色谱；反相键合色谱；亲水性的样品亲水性的样品正相键合色谱；正相键合色谱；生物大分子生物大分子 体积排阻体积排阻色谱；色谱；无机离子化合物无机离子化合物离子对色谱；离子对色谱；高分子聚合高分子聚合 凝胶色谱；凝胶色谱；同系物的分离同系物的分离吸附、分配和键合色谱；吸附、分配和键合色谱；同分异构体同分异构体 双键或取代基异构用吸附色谱；双键或取代基异构用吸附色谱； 多环芳烃异构选用反相键合；多环芳烃异构选用反相键合；对映异构体对映异构体 流动相加入手性选择剂或具有光流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。学活性的固定相。5.2 5.2 流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择v根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。v为达到较好的分离效果，确定流动相配比。为达到较好的分离效果，确定流动相配比。v流动相的总流量增加，通常柱效增加。流动相的总流量增加，通常柱效增加。v梯度洗脱梯度洗脱-在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时分较多及不同溶质的性质差别较大时。v特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的溶液及调节流动相的PhPh值来改善峰型。值来改善峰型。5.3 5.3 样品组分保留值和容量因子的选择样品组分保留值和容量因子的选择1. 1. 分析时间控制在分析时间控制在101030min 30min ；2. 2. 容量因子控制在容量因子控制在1 11010，对于复杂的样品，容量因子，对于复杂的样品，容量因子范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。容量因子容量因子定义：调整保留时间与死时间之比，即可表定义：调整保留时间与死时间之比，即可表示为示为:3. 3. 相邻组分分离度的要求：相邻组分分离度的要求： 对于难分离的样品对于难分离的样品, ,要求分离度要求分离度R1.0R1.0。6、样品分析方法介绍、样品分析方法介绍1 1，流动相的准备流动相的准备流动相的流动相的选择选择-有机相（甲醇、乙腈）与有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液）水（去离子水、缓冲溶液）流动相的流动相的过滤过滤-用孔径为用孔径为0.450.45m m滤膜过滤滤膜过滤除去固体颗粒杂质。除去固体颗粒杂质。流动相的流动相的脱气脱气-超声脱气、吹氦脱气、加超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。2 2，样品的准备样品的准备称量称量、用流动相超声、用流动相超声溶解溶解、过滤过滤。6.16.1流动相及样品的准备流动相及样品的准备流动相过滤器流动相过滤器样品过滤器样品过滤器6.26.2分析方法的设定分析方法的设定流动相的配比及流量流动相的配比及流量-选择何种有机相，选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。的总流量。紫外检测波长的确定紫外检测波长的确定-通过测定被分析通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如2080)2080)及终点配比及终点配比( (如如8020)8020)。.3 .3 样品的分析样品的分析1, 选定分析条件，走基线；选定分析条件，走基线；2, 待基线平稳后，发出进样指令；待基线平稳后，发出进样指令；3, 用进样针吸取已过滤好的定量样品；用进样针吸取已过滤好的定量样品；4, 进样分析，获得色谱图及分析结果；进样分析，获得色谱图及分析结果；5, 如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。谢谢大家！