课题3 血红蛋白的提取和分离1血红蛋白的提取与分离思考思考1分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。2血红蛋白的提取与分离思考思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构思考思考4人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取，人的红细胞无的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。富便于提取血红蛋白。3血红蛋白的提取与分离一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。4血红蛋白的提取与分离3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（入凝胶内部的通道，路程（），移动），移动速度（速度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），相对分子质），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢5血红蛋白的提取与分离洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子6血红蛋白的提取与分离7血红蛋白的提取与分离1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶）的对溶液的（液的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本基本不变。不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值8血红蛋白的提取与分离3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）就可以制得（）使）使用的缓冲液。用的缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO39血红蛋白的提取与分离思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性）10血红蛋白的提取与分离1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用不同，在电场中受到的作用力力大小、方向、阻力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在不同，导致不同蛋白质在电场中的电场中的运动方向运动方向和和运动速度运动速度不同不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可解离的基团会带上电荷，蛋白质可解离的基团会带上电荷电泳：电泳：11血红蛋白的提取与分离影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素决定决定运动方向运动方向电场电场作用作用力力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小12血红蛋白的提取与分离电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离子的分离在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基团下，这些基团会带上正电或负电会带上正电或负电1、原理：、原理：13血红蛋白的提取与分离聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂甲基双丙烯酰胺在引发剂( (过硫过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶聚合交联成三维网状结构的凝胶测定（测定（）通常用十二烷基硫酸钠（通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙聚丙稀酰胺凝胶电泳稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量2、常见方法、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳14血红蛋白的提取与分离蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素原理原理SDSSDS作用作用为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响可以在凝胶可以在凝胶中加入中加入SDS ,SDS ,SDS所带负电荷的量大大超过了所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小于分子的大小十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量应用应用15血红蛋白的提取与分离为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合复合物，物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质分的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小16血红蛋白的提取与分离电泳检测电泳检测PCR结果结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳17血红蛋白的提取与分离二二实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链9018血红蛋白的提取与分离19血红蛋白的提取与分离目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将），将下层（下层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（每个肽链环绕（ ），此基），此基团可携带（团可携带（ ）。血）。血红蛋白因含有（红蛋白因含有（ ）而呈红色。本课题）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯20血红蛋白的提取与分离再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为）质量分数为0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）重复重复4、5步骤（步骤（）次，直至上清）次，直至上清液中已没有（液中已没有（），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。涤次数过少。五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水三三黄色黄色21血红蛋白的提取与分离(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞膜溶解细胞膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分分钟（加速细胞破裂）钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红细胞破裂释放出血红蛋白蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水22血红蛋白的提取与分离第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层（）的液体）的液体第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色23血红蛋白的提取与分离用滤纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透明液体液体。24血红蛋白的提取与分离取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是小时，目的是（）或用于更换样品中的（或用于更换样品中的（）。透）。透析袋一般用析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析125血红蛋白的提取与分离2.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；中间打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ ），在），在0.5ml0.5ml的（的（ ）头部切）头部切下（下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内，）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm26血红蛋白的提取与分离底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在（剪尼龙网小圆片覆盖在（ ）上，用（）上，用（ ）的尼龙纱将橡皮塞）的尼龙纱将橡皮塞（ ）包好，插到玻璃管一端。）包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做（、色谱柱下端用移液头部做（ ），），连接一细的（连接一细的（ ），并用螺旋夹），并用螺旋夹控制尼龙管的（控制尼龙管的（ ），另一端放），另一端放入收集（入收集（ ）的收集器内）的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管打开与关闭打开与关闭色谱流出液色谱流出液27血红蛋白的提取与分离安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作：顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。28血红蛋白的提取与分离2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：）凝胶的选择：（ ）（）（G-75G-75） “G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。 7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。（2 2）方法：）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，）中充分溶胀后，配成（配成（ ）。）。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶29血红蛋白的提取与分离固定：将色谱柱处置固定在支架上固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：装填：将（将（）一次性的缓一次性的缓慢倒入（慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。30血红蛋白的提取与分离洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )( )高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液（液（pHpH为为7.07.0）充分（）充分（ ）1212小时。小时。 洗涤平衡洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。新填装。 50cm50cm31血红蛋白的提取与分离3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓）缓慢下降到与（慢下降到与（）平齐，关闭出口平齐，关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面32血红蛋白的提取与分离加加透析透析样样品品33血红蛋白的提取与分离调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（）将）将1ml（）的样品加到色谱柱的（的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：收集：待（待（）接近色谱柱底接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集收集一试管连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作： 不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质34血红蛋白的提取与分离血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考思考35血红蛋白的提取与分离血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。）。思考思考样品的粗分离样品的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定36血红蛋白的提取与分离3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化37血红蛋白的提取与分离3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红鉴定血红蛋白纯度蛋白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N, N-N, N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离子用去离子水配制水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺，下同）的丙烯酰胺和和1%1%的的N, N-N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS） 用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。 用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 38血红蛋白的提取与分离用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用提供驱过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。基。此溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH HCl(pH 6.8)6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇) )或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲的甲醇，醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。 39血红蛋白的提取与分离由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。骤完成。操作时要戴好一次性手套。40血红蛋白的提取与分离 SDS- SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，TEMED TEMED 0.006mL0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间( (梳子梳子的齿长再加的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入，再在胶液面上小心注入一层水（约高一层水（约高2 23 mm3 mm），以阻止氧气进入凝），以阻止氧气进入凝胶溶液。胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤41血红蛋白的提取与分离配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水用去离子水2.7 mL2.7 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL，10%10%的的SDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL，TEMED TEMED 0.004 mL0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。盖水层，再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理42血红蛋白的提取与分离5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。 按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 L25 L。样。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后( (即进行凝胶色谱分离之前即进行凝胶色谱分离之前) )的样品和凝胶色谱分的样品和凝胶色谱分离之后的样品离之后的样品4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。部两玻璃板之间的气泡。 43血红蛋白的提取与分离7 7）剥胶）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。部切去一角，以标注凝胶的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。 44血红蛋白的提取与分离10)10)观察结果：观察结果：SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质中，待别是样品制备过程中蛋白质与与SDSSDS的结合程度。的结合程度。9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液, ,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景，其间需多次更换脱色液至背景清楚。清楚。 45血红蛋白的提取与分离观察你处理的血液样品离心后是否分层观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），如果分层不明显，），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。蛋白的提取纯度。三三实验结果分析与评价实验结果分析与评价46血红蛋白的提取与分离由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除气泡，消除不了时要重新装柱。 47血红蛋白的提取与分离如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。48血红蛋白的提取与分离讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，质的分子量时，可选用一组已知分子量的可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，率和分子量的对数作标准曲线，可以测定可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售售49血红蛋白的提取与分离50血红蛋白的提取与分离51血红蛋白的提取与分离