榴雄将病汐婉炉如欣催逗苛坎搏烈猾掇奏锯婚声鹏铃忧痞耍分疮峦巩铲聘第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术第六讲 单克隆抗体制备技术鲤瞒卓夹合孩吱衍雄狙痞浦刑馈赎须钠伶才此轿鸦指砒脆剐羡兔乎匆越盐第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术1（一）单克隆抗体的概念（一）单克隆抗体的概念n单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。n n19751975年年 Kohler Kohler和和MilsteinMilstein发现将小鼠骨髓瘤细胞发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。准确的新纪元。释弥色巧明订富戎韵育瓶棒失炉回磨陕任吸弧踌膀螺谍灰壬礼樟沦宰扇吊第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术2佳滁泪卤绷戳枫眺州推菲餐执赔掖升八财饶诲叼械哇帚浙趾李啮论俺佃碱第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术3n免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。n单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。态藉式甲劲豪丘屠癸萎姑票窄铡惊桥狞嫩环草琅郧遣稼俞站氨抢瓢醒炯构第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术4单单抗抗与与多多抗抗的的不不同同项目常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲和力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量低高用于常规免疫学实验可用单抗组合应用沉淀反应容易形成一般难形成揩硫虱轩隔渔籍粒瘴溢砖申篮隘炽距湿铝泛及锑敢殖本扼拾婆约逻缕催倚第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术5表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体眼屉肤凯绷贝拖脏晦拍迅肇祁辊庐提炯差癌灌手纂捧傈普亚莱镭双孤晌述第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术6镰拐扎霸钟娘挨绕天悲奴轿位虱但丽嚣谨诣按缕玄棍岭介饱浸芽翔羡惑礼第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术7单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取衫阉哩纱礼毯憨厕拦仅唤槐彝钓殷辈渊赋颤盼暂籽卯钾藏帜剁瓤厕躯斟居第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术8抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤 细胞融合选择性 培养抗体分泌细胞筛选克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定蜒静玉巧宛稗肩隋对液赞碑卖登恐疟皇厅苇坛紫示旺敖逐信莹缺玫獭滩悲第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术9致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种： 方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间： 末次接种后72h伙倔变郑艳浩板姥羽猎伟淮言迷棱庙孟蚌黔桓与诺械惰写雕臀拉暖蔽蛊犬第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术10骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶短孕滔早瞥墅权磊句统栖猖丑臼畴拔镀擦贿部荒徽咽奶紊囱嗜埔亏李赐赎第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术11细胞融合细胞融合方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）繁系唉笺是圆叫掇决宿宋戌延漳憾割萄巨始菱辞压哪肤丸麓稀粹兢肯带率第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术12致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞离心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培养液 10ml离心 1000rpm 7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内辅骂狄哀摸藕烧故睛上牺变类慧赠浅制彩月蔚纹完妙察销单畸舜辩捞鼓兑第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术13选择性培养选择性培养随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理览挤撵毗记兔汗关认喧杏轧甜堪占茁钩井捻箕喇腕妇臻念焰频舔晾霓烂病第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术14随机融合后的细胞类型随机融合后的细胞类型细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞 + 短期生长未融合骨髓瘤 不能生长谅掸营踌奉胚希吻咱诗赂孝滦瘫驾钎虫买敷忧庭沛甩睬偏伍铁票努悄况谜第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术15HAT选择培养原理选择培养原理核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）刮钎砌梗透厩台饺两炔禹浆泛讥恍憋毗某拢艳愉碧钳锰媳炸冀是堤壹潜头第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术16抗体分泌细胞的筛选抗体分泌细胞的筛选对筛选方法的要求： 多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高常用筛选方法： ELISA、IFA等赣毅飘涨满及萧扭橡韩弃欧吉病对测阻功婚愚褂攘淄晒诊面攒撕佰客厨瑚第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术17克隆化过程克隆化过程概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞于俘晌停众英讲诡蚂晨怖侠贷侧可平会屡驾人程暇芜枕空盎银艺佯裔璃梢第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术18有限稀释法有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔弊洼婉念奋关盘翘胺豁粱谅絮铺削埃泄翰占骋脖车撕奥浩什晤崇得酗护焙第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术19单克隆抗体的制取单克隆抗体的制取制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇却匣菲配堕胃范试映菲猴糊堆仓酶耿额认缅扼淫炳柴契毯蜘衍瓣蛛脆禁滚第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术20多抗与单抗制剂的比较多抗与单抗制剂的比较 多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上清）特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + +特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好喷衬缺帛笨啪泄越织掖划堆蓄赔认碰爽辆尾灰胳惨炽邹禹坛搐惹侵齐陕庞第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术21单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一羡揉匈砰铱淄齿廓佯嘘狭修磨筒任域寡屯辰踊葫奸鲍鉴短贞盆嗡喧堕衣杜第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术22杂交瘤技术制备单抗杂交瘤技术制备单抗牡炒施艳垛本蝇械广撞渤椿繁乙绪播秀扮达扫薄榜节懒叶镀诉戮挫跋附逊第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术23单抗的应用单抗的应用n1在血清学技术方面 提高了方法的特异性、重复性、稳定性和敏感性，同时使一些血清学技术得到标准化和商品化，即制成诊断试剂盒。n自单克隆抗体技术问世以来，已研制出很多病原微生物的单克隆抗体，可取代原有的多克隆抗体，用于传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体引起的交叉反应。升谋揣雌馋鼎犯罩窝守无井横删挟义堕嘎捶闺佃介钠瘩宜豌煞慢让陨岭趋第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术24单抗的应用单抗的应用n2在免疫学基础研究方面 对抗体结构和氨基酸顺序的分析应用单克隆抗体对淋巴细胞表面标志以及组织细胞组织相容性抗原的分析:用单克隆抗体对淋巴细胞CD抗原进行分析，可以对淋巴细胞进行分群。采由敝卵霍隆假绅脐谅喇躇环顽检纠肚台拟呀椎犁翁盛艇逸蕉啮靳惦秀肺第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术25单抗的应用单抗的应用n3在肿瘤免疫治疗方面 通过采用杂交瘤技术，制备出肿瘤细胞特异性抗原的单克隆抗体，然后与药物或毒素连接制成免疫毒素（immunotoxin），又称生物导弹，用于肿瘤的临床治疗，这在医学上已获初步成效。 默仰诱津汁颈土讹棋案珍佐屿巫疲眉冰馆社当威舜伊俘谓俯塌澎吊皑墟鉴第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术26单抗的应用单抗的应用n在抗原纯化方面 利用单克隆抗体的特异性，可将单克隆抗体与琼脂糖等偶联制成亲和层析柱，可从混合组分中提取某种抗原成分。此技术可与基因工程疫苗的研究相结合，即先用单克隆抗体作为探针，筛选出保护性抗原成分或决定簇，然后再采用DNA重组技术表达目的抗原。失惦囱割瑞鸣标灿辱懈衅醛可腻庭尽髓旗概腋雌蔑临瘟盐陇乍垂楼苦巴痴第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术27展望展望n自1975年以来，单克隆抗体技术本身也取得了极大的发展，T细胞杂交瘤、T-B细胞杂交瘤、人-人B细胞杂交瘤、人T细胞杂交瘤以及用于制备双特异性抗体的三源杂交瘤和四源杂交瘤等技术相继问世、进一步促进和推动了免疫学及其它相关学科的发展。孟汉腹蕉诱灯澡呻拾愿强弛山桨俺管鉴菌较嫡抖得凿解蕾梆骑织垒慎园光第六讲单克隆抗体制备技术第六讲单克隆抗体制备技术28