细细 胞胞 培培 养养 cell culture前言细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件细胞培养的基本方法细胞培养的污染和检测细胞冻存和复苏细胞管理及保藏细胞毒性检测 主要内容主要内容 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年年Roux最早尝试使组最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。并首次采用组织培养这个术语。1.1.前言前言Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 1873d. 1944 1907年年Harrison 和和1912年年Carrel开始把组织培养作为一种开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞方法，用于研究离体动物细胞的培养。的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了持续了34年之久年之久(1912-1946) 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。细胞培养(cell culture)：把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养，增殖。2.基本基本概念概念肿瘤肿瘤胚胎胚胎成体成体粗切粗切消化消化细切细切修切修切细胞培养细胞培养 组织培养组织培养器官培养器官培养细胞培养的优点细胞培养的优点活细胞活细胞便于观察检测便于观察检测条件可控条件可控均一性均一性便于人工筛选便于人工筛选培养细胞与体内细胞的差异培养细胞与体内细胞的差异失去原有组织结构和形态，趋向单一性失去原有组织结构和形态，趋向单一性分化减弱分化减弱可能获得不死性可能获得不死性体外培养细胞的生长类型体外培养细胞的生长类型贴壁型：动物的正常细胞贴壁型：动物的正常细胞悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞固定化培养固定化培养来源：由来源：由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心心肌肌，平平滑滑肌肌，成成骨骨细细胞胞，内内皮皮细细胞胞形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态的形态 胞体梭形胞体梭形或不规则三角形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个个长短不等的突起长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核成纤维细胞样细胞成纤维细胞样细胞 生长特点：生长特点： 排列成排列成放射状放射状，漩涡状，漩涡状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片， 细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动单独行动 培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生长和增殖过程原代细胞：从机体取出后立即培养原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞的细胞原代培养：将从体内取出的细胞进原代培养：将从体内取出的细胞进行培养行培养传代培养：从原代培养细胞继续转传代培养：从原代培养细胞继续转接培养接培养传代细胞：在体外培养条件下持续传代细胞：在体外培养条件下持续传代培养的细胞传代培养的细胞细胞培养的工作原则细胞培养的工作原则无菌无菌无毒、生物相容性无毒、生物相容性清洁的环境清洁的环境品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和去离子水去离子水有标准化的工作方法有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等和制备日期等一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放开，已消毒品与未消毒品应分别存放3.3.细胞培养细胞培养的基本条件的基本条件无菌条件无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工超净工作台作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素器，抗生素细胞生长条件细胞生长条件：培养板，培养瓶，：培养板，培养瓶，CO2培养箱培养箱，培养基，血清培养基，血清细胞检测条件细胞检测条件：倒置显微镜倒置显微镜，酶标仪，微孔板，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器震荡器，高速离心机，移液器细胞保存条件细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱：液氮罐，超低温冰箱常用仪器与设备常用仪器与设备超净工作台高压蒸汽灭菌器过滤除菌装置倒置显微镜水纯化装置恒温培养箱电热干燥箱离心机、天平、水浴、摇床液氮罐冰箱：4、-20 、-80 细胞培养器材细胞培养器材移液器移液器移液管移液管吸管吸管培养瓶：培养瓶： 25cm25cm2 2、75cm75cm2 2、150cm150cm2 2培养皿：培养皿： 3030、6060、120120毫米毫米多孔培养板：多孔培养板： 4 4、6 6、2424、9696孔孔离心管离心管冻存管冻存管基础培养基 8095血清 520青、链霉素 各100Uml完全培养基的组成完全培养基的组成天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 培养基培养基合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌血清的使用血清的使用其他细胞培养用液n水：新鲜的三蒸水或去离子水n平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）抗生素溶液抗生素溶液n通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。n配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 n使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。n庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤器过滤除菌。消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液消化液：胰蛋白酶溶液、消化液：胰蛋白酶溶液、消化液：胰蛋白酶溶液、消化液：胰蛋白酶溶液、EDTAEDTAEDTAEDTA溶液、胶原酶溶液溶液、胶原酶溶液溶液、胶原酶溶液溶液、胶原酶溶液物物 品品湿湿 热热干干 热热过过 滤滤紫紫 外外化学化学气体气体消毒消毒剂剂电电离离辐辐射射培养室培养室工作台工作台玻璃玻璃制品制品金属金属器械器械塑料塑料制品制品橡胶橡胶制品制品培养培养用液用液布布类类棉棉类类 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。4.细胞培养的基本方法粘着、粘附粘着、粘附（attachment）铺展铺展（spreading)得到细胞得到细胞1）取材）取材 切割切割组织块培养法组织块培养法消化培养法消化培养法2）直接购买）直接购买 培养培养（原代培养）传代 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。弃去旧培养液弃去旧培养液 清洗清洗 加入消化液加入消化液 吸弃消化液吸弃消化液 加入培养液加入培养液 吹打分散细胞吹打分散细胞 分装稀释细胞分装稀释细胞 补加培养液补加培养液 继续培养继续培养接种数量为51048105个/ml。传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。传代注意事项传代注意事项游离期游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性细胞传代的增殖生长过程细胞传代的增殖生长过程细胞观察细胞观察肉眼观察：培养液的颜色和透明度肉眼观察：培养液的颜色和透明度显微镜观察显微镜观察生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清轮廓不清生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物时细胞表面及周围出现丝絮状物细胞计数细胞计数每毫升细胞数每毫升细胞数血细胞计数板血细胞计数板细胞生长的指标细胞生长的指标细胞生长曲线细胞生长曲线贴壁率贴壁率有丝分裂指数有丝分裂指数(MI)(MI)：分裂相数量占全部细胞数量：分裂相数量占全部细胞数量的百分比的百分比细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间四唑盐四唑盐(MTT)(MTT)比色法比色法标记胸腺嘧啶脱氧核苷标记胸腺嘧啶脱氧核苷( (3 3H-TdR)H-TdR)掺入量掺入量细胞活力测定细胞活力测定细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比台盼蓝法台盼蓝法四唑盐四唑盐(MTT)(MTT)比色法比色法荧光素双乙酸酯法荧光素双乙酸酯法(FDA)(FDA)四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。细胞培养的其他指标细胞培养的其他指标细胞大小：显微测微计法细胞大小：显微测微计法细胞重量：称重法细胞重量：称重法鲜重鲜重干重干重细胞固定与染色细胞固定与染色细胞固定细胞固定苏木精苏木精- -伊红染色伊红染色GiemsaGiemsa染色染色FeulgenFeulgen染色染色考马斯蓝染色考马斯蓝染色免疫法免疫法细胞核染色：细胞核染色：HoechstHoechst、DAPIDAPI细胞污染细胞污染混浊、混浊、pHpH异常改变、细胞外形异常改变、细胞外形模糊、漂浮的集落模糊、漂浮的集落细胞出现增殖缓慢或死亡细胞出现增殖缓慢或死亡化学物质的污染化学物质的污染非同种细胞污染非同种细胞污染微生物污染：细菌、真菌、支微生物污染：细菌、真菌、支原体、病毒原体、病毒5.5.细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测细菌污染细菌污染培养液变黄，出现浑浊培养液变黄，出现浑浊镜下可见圆球状颗粒漂浮镜下可见圆球状颗粒漂浮预防和处理：青霉素、链霉素预防和处理：青霉素、链霉素真菌污染真菌污染培养液一般不浑浊培养液一般不浑浊白色或黄色小点漂浮于培养基表面白色或黄色小点漂浮于培养基表面光镜观察到菌丝光镜观察到菌丝预防和处理：抗真菌剂预防和处理：抗真菌剂支原体污染支原体污染可透过滤膜无细胞壁细胞胞营养液养液仍清亮但仍清亮但变黄，黄，细胞生胞生长变缓，部分部分细胞胞发生生脱落脱落，细胞间隙可见铺满，细胞间隙可见铺满细沙样小点细沙样小点。污染的控制污染的控制预防预防重新培养重新培养鉴别鉴别清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、重新克隆法、动物体内接种除菌法法、重新克隆法、动物体内接种除菌法防止交叉污染防止交叉污染6.6.细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏慢冻快融慢冻快融低温保护剂：低温保护剂：10%10%的甘的甘油或二甲亚砜油或二甲亚砜DMSODMSO 细胞深低温保存的基本原理： -80以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。慢冻快融慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。成大冰晶，即冰晶的重结晶。 7.7.细胞的管理及保藏细胞的管理及保藏对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。HeLaHeLa：为供体患者的姓名：为供体患者的姓名(Henrietta Lacks(Henrietta Lacks，来源于宫颈癌，来源于宫颈癌) )CHOCHO：中国仓鼠卵巢细胞：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)(Chinese Hamster Ovary)NIH/3T3NIH/3T3：美国国立卫生研究所：美国国立卫生研究所(National Institute of (National Institute of Health)Health)建立建立, , 每每3 3天传代一次，每次接种天传代一次，每次接种3 310106 6细胞毫升。细胞毫升。细胞库的建立细胞库的建立主细胞库主细胞库生产用细胞库生产用细胞库原始细胞库主细胞库生产细胞库细胞保存机构细胞保存机构ATCC (American Type Culture ATCC (American Type Culture Collection) www.atcc.orgCollection) www.atcc.orgECACC (European Collection of Cell ECACC (European Collection of Cell Cultures)Cultures) www.hpacultures.org.uk www.hpacultures.org.uk中国科学院典型培养物保藏中国科学院典型培养物保藏 委员会细胞库委员会细胞库 www.cellbank.org.cnwww.cellbank.org.cn8.8.细胞毒性细胞毒性检测检测 参照GB/T16886.5-2003（或ISO10993-5），医疗器械生物学评价-第5部分：细胞毒性试验体外法规定的方法进行检测。 l样品准备 辐照灭菌l将待检材料在相应条件下浸提（不含血清的培养基中在37环境下浸提24h）l细胞计数l接种于96孔培养板，置CO2培养箱37培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，供试品加入样品浸提液（加血清），置CO2培养箱继续培养（至少24h）l于设定培养时间后置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20L质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入200L DMSO，在酶标仪570 nm波长下测定吸光度，计算相对增值率（RGR）。细胞毒性评价:根据下式计算相对增殖率(Relative growth rate, RGR) 。RGR =实验组OD均值/阴性对照组OD均值100%级别级别相相对对增增值值率率/%0 01001 180-9980-992 250-7950-793 330-4930-494 40-290-29浸提液细胞毒性浸提液细胞毒性浸提液细胞毒性浸提液细胞毒性直接接触细胞毒性直接接触细胞毒性直接接触细胞毒性直接接触细胞毒性将样品放入培养器皿内从细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿里合适条件培养（最少24h)如有需要可换液固定细胞（戊二醛稀释液）梯度脱水临界点干燥扫描电镜观察谢谢！谢谢！