第二章第二章生物大分子分离纯化技术生物大分子分离纯化技术 生化物质分离的特殊性：要求：分离方法简便，选择性好，效率高，保持生化物质的分子结构和构型，分离方法尽量不影响生化物质的生物活性。 由于生化物质一般都很脆弱，易受化学、物理因素影响而变性，因而分离过程常要求在低温、洁净、温和的条件下进行。 本章所提到的生物大分子主要是指蛋白质、酶及核酸。生化及临床分析样品的预处理。生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微过滤、冷冻干燥及离心技术；生物大分子的电泳分离纯化技术；生物大分子的色谱分离纯化技术；本章主要的内容包括：2.1 生化分析样品的准备与预处理 生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测物处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。2.1.1 样品的类型、采集及保存样品的类型 生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成，如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎是完全稳定的药物的代谢物。样品的采集 对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。 尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采样者应该有相应的样品采集及保存的设备。1. 血样 成人平均含6L的血液、其中约55的血浆和45的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的影响。动物一般采取禁食1216h后采血，一般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。血样有全血、血浆和血清之分。2组织样品 组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这类组织是代谢活性的，因此采样后几秒之内要在液氮中或其它冷却剂中冷冻。液氮样品的保存样品的保存 一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注明保存日期及保存条件等。 生物体液中许多成分保存在室温或4下时，由于沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白进行分析，当样品保存在-20时，20天内不会发生明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显的变化，如儿茶酚胺，因此必须保存于20或70下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。所以、一般要快速分离成单一的相。样品的初步处理 尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除蛋白质的各种沉淀方法的比较见表：常用蛋白质沉淀方法的比较常用蛋白质沉淀方法的比较2.1.2 2.1.2 酶样品的准备酶样品的准备 酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物活性的保持问题。 生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。 酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中，通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方面是否具有纯的酶制剂非常关键。酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。 可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞器内的，其蛋白质浓度从100 mg/ml 到高达400 mg/ml (线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护环境中释放出来被限制在不同部位的蛋白水解酶也同时被释放出来。所以要对所关心的酶进行保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。 通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25可以使许多降解过程减慢3-5倍。 酶在稀溶液中由于对器皿壁或色谱填料的吸附会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失去活性，这种变性可以通过加入载体蛋白来阻止。比较常用的载体蛋白有牛血清白蛋白，或商品化的结构简单、分子量已知的合成蛋白。载体蛋白选择条件：1.与酶之间无相互作用；2.分子量与酶的分子量差至少12倍，以便必要时可以很方便地用排阻色谱将二者分离。 一些特殊的反应会使催化活性部位的活性丧失一些。在纯化过程中一些辅助因子的失去会使酶的活性丧失，为此可以在纯化缓冲液中加入辅助因子。 催化活性部位氨基酸残基的共价化学修饰很常见，最易被修饰的氨基酸为半胱氨酸。R-SH+R-SHR-S-S-R 对巯基氧化的防止：1.EDTA络合金属离子(非金属酶)2. 加入含巯基试剂，如巯基乙醇、2,3-二巯基丙醇、巯基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等对蛋白质酶解的防止： 蛋白水解酶来自活细胞的内部，哺乳动物将其包装在溶酶体中，而在微生物中它们则存在于质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取物时会发生蛋白水解酶的释放，所以对其活性要进行抑制。根据蛋白水解酶的类型可以选用不同的抑制剂。常用蛋白酶抑制剂1. 氟代磷酸二异丙酯(DEP)：可抑制丝氨酸蛋白酶，但在使用上DEP比较危险，因为它具有挥发性，并能进攻人的乙酰胆碱酯酶而影响人的神经传导。2. 苯基甲基磺酰氟(PMSF)：非挥发性丝氨酸酶的抑制剂，而且不与人的乙酰胆碱酶作用。它还可以抑制一些巯基蛋白酶及羧酸肽酶。3. 胃蛋白酶抑制素和甲(乙)酰-亮-亮-精三肽是酸性蛋白水解酶类很强的抑制剂，被抑制的酶有胃蛋白酶、组织蛋白酶及酵母蛋白酶A。 由于细胞质中含有高达10一15(W/V)的非水成分，处在蛋白质周围的水分子不能自由流动而使蛋白质分子的结构加以稳定。在酶提取物制备过程中为了模拟这种情况，通常加入非水的亲水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山梨糖醇。 在每步纯化之后都要进行酶活性和蛋白质量的测定。在纯化过程中酶的比活性(u/mg)逐渐增加并最终达到最大。酶的粗提物要用硫酸铵或聚乙二醇(PEG)进行分组沉淀加以浓缩，也可以用色谱吸附，然后再迅速从色谱基质上解离下来。沉淀的蛋白质溶解在小的体积中，这样可由于浓度高而更稳定。离心法(500050000 g)很适合于亚细胞组分及硫酸铵和PEG沉淀的酶的分离。生理样品中具有生物活性酶的制备生理样品中具有生物活性酶的制备 1酶活性测定过程 确定生理样品中酶的活性一般都要经过以下几个步骤： (1)酶及反应液的制备，反应液通常由一定浓度的底物组成，并有确定的温度、pH及其它催化反应所需要的辅助因子； (2)将酶加入反应液或将反应液加入到酶制剂中并进行温育以引发反应，随后的测定都以引发反应的时间为起点； (3)反应可以用不同的方式终止，最常用的方法是使酶失去活性； (4)将酶反应产物从酶和底物中分离出来；(5)测定和鉴定在特定的时间内由酶反应所生成的产物；(6)在有些情况下酶的活性可以用反应速度法来测定； (7)数据分析。 2样品的制备方法 对所有的生物样品(组织、尿液、脑脊髓液及细胞培养液等)在分析之前都要进行下述准备工作； (1)研究对象的准备(如动物)； (2)标本的采集； (3)由标本制备样品； (4)标本或样品的形态； (5)标本或样品的保存； (6)用于酶法分析样品的预处理； (7)标本是来自于研究对象的一部分，并作为研究的 代表。 从生理样品制备具有生物活性的酶时，主要应考虑两种因素：1. 选择什么样的生物样品作为进行纯化的起始原料。如：含有器官、组织、生物液、微生物细胞及从培养液或发酵液中获得的单细胞生物等；分离开的各种细胞混合物，经溶解所释放出来的亚细胞碎片，它们包括像线粒体类的细胞器及膜组分或含可溶性成分。对这类样品进行处理的第一步是不同细胞器的分离及可溶物与不溶物的分离，然后对膜成分进行溶解，最后将不同种类的分子加以分离。2. 样品应纯化到什么程度。 传统的纯化法最终所得到的是均匀的蛋白质溶液。样品纯化的主要目的是能够分析单一的酶活性而不受其它物质的干扰。但对有些研究，其它有活性成分的存在则是有利的或必要的。 (1)从组织或器官制备样品 组织和器官至少可以分为两部分，即细胞和细胞内成分。所感兴趣的成分可能存在于上述两个部分中的任何一个。将整个未损伤的细胞从稳定的小纤维基质中分离出来要采用细胞筛选技术。通常所使用的用于基质破碎的方法(如切、剪、粉碎)会造成一些细胞的破碎，而利用纯化的酶可以对基质进行特殊方式的破碎，如胶原酶可用来破碎哺乳动物组织。使用胰蛋白酶及其它蛋白水解酶也取得了一定的成功，这样的方法所得到的是细胞的混合物，细胞内成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶和试剂。(2)从组织或器官培养液中制备样品 经培养的样品通常可按类似于上面的方法进行。值得注意的是要避免由于外加的细胞内成分及培养介质所产生的影响。因为它们中可能含有来自于介质本身或在样品培养过程中所产生的具有酶活性的物质。 (3)从细胞培养液制备样品 对在培养液中生长的哺乳动物细胞或细菌等样品，在分析之前要将非细胞成分与细胞成分分开，细胞与培养液的分离采用低速离心就可以实现，上清液要进行酶活性分析，滤饼留下来用于溶解和分析。 总之，酶样品的制备区别于其它的生物大分子，其预处理过程相对较复杂，应根据实验的要求严格进行每步操作。2.2 生物样品的常规分离纯化方法2.2.1 透析(Dialysis) 透析是用于生物大分子分离和纯化的一种简单而古老的方法，它是在渗透中既有溶剂流动又有溶质流动的过程。操作：把待分离或纯化的样品封入由半透膜组成的透析袋内，然后将袋子放入低离子强度的透析液中进行透析。根据半透膜规格的不同，只有膜内分子量小于分子量阻截范围的分子才可以透过膜进入透析液中，从而实现大分子与小分子的分离或生物大分子的纯化 操作要点： 为了加速透析的进程，一般在透析的过程中要进行连续搅拌，同时在透析袋内留下大约透析袋总体积10的空隙，以便使得透析膜界面两侧能透过膜的分子浓度梯度加大。透析平衡的时间一般为46小时，进一步透析需要换液。考虑到被透析的生物分子较高温度下易变性，透析一般在34C下进行。透析膜 常用的透析膜材料有火棉胶、玻璃纸以及纤维素等。膜孔径的大小可以有不同的规格，在医药工业中常使用纤维素透析管，其分子量阻截范围为1.0 x1035.0 x104。透析管的选择：主要考虑分子量阻截范围其次考虑管的尺寸透析管的预处理 透析管使用之前一般要进行适当的处理，以除去诸如甘油、重金属离子、含硫污染物及可能存在的蛋白或核酸水解酶类。1%乙酸浸泡1h水洗碱性EDTA煮1h水洗浸泡水中保存透析液 最常用的透析液是水，一定pH和离子强度的缓冲液或高分子惰性物质的浓溶液。在纯的水中透析一般速度比较快但有造成生物物质活性丧失的危险。所以，通常选择具有一定pH和离子强度的缓冲液作为透析液有时也可以选择高分子惰性物质的浓溶液，因为高分子不会进入膜内而水分子可以自由出入膜孔。在这种情况下，除了正常的透析之外，由于膜内外渗透压差的存在，膜内更多的水会透析到膜外，直到内外渗透压达到平衡为止，因而，也具有浓缩样品的功能，透析的主要用途是从生物大分子样品中除去盐类或其它小分子物质。透析的应用透析的应用1. 在分离及纯化蛋白质及菌时经常要加入有机溶剂或无机盐类，如硫酸铵或硫酸钠以沉淀蛋白质类生物大分于，由于生物大分子在沉淀的同时会不可避免地混杂有这些小分子，从而干扰生物大分子的进一步纯化或性质鉴定。透析法是除去这些小分子的简便而有效的方法。2. 用来除去与生物大分子结合较弱的小分子或离子，如金属离子及酶的辅助因子NAD，FAD等。当透析要除去金属离子时常常要在透析液中加适量的螯合剂(如EDTA)，这样可以加快透析的速度。3. 用来测定生物大分子(如：核酸及蛋白质)与金属离子间的亲和常数。例如：可以用Tb3和Eu3作为Mg2离子的荧光探针来测定Mg2与核酸的亲和常数，因为这两种稀土离子与镁和钙离子具有相同的结合位点透析的应用透析的应用 透析法的主要缺点是整个过程需要的时间较长，有时需要透析几天。因而，近来人们更乐于使用诸如凝胶过滤(Gel Filtration)及空心纤维过滤器透析(Hollow Fiber-filter Dialysis)等方法。这些方法完成同样的任务一般只需要12小时。