双向电泳的操作双向电泳的操作步骤步骤v样品制备（样品制备（Sample preparation）v固相固相pH 梯度胶条的水化（梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）v第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEF）v第一向胶条的平衡（第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）v第二向第二向SDS 电泳（电泳（SDS-PAGE）v检测染色（检测染色（Detection/Staining）v蛋白点的挖取，收集蛋白点的挖取，收集v质谱分析质谱分析常用裂解液常用裂解液vUreavThioureavCHAPSvDTTvPharmalyte pH 3-10vTris-BasevPefabloc protease inhibitorv1% SDS样品制备程序样品制备程序v培养细胞（培养细胞（culture cellculture cell）样品处理方法）样品处理方法（1） 培养细胞的收集；（2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g， 各2min）；（3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS；（4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100L 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5） 4，40,000g，离心1h；（6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78 备用。v组织样品处理方法组织样品处理方法 三氯醋酸丙酮沉淀法（三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation） 超速离心法超速离心法BACKIPG IPG 胶条的水化胶条的水化v加样品水化加样品水化v不加样品水化不加样品水化加样品水化加样品水化加样品水化加样品水化BACKIEFv限流 50uAv200V 1hrv500V 1hrv1000V 1hrv8000V 30min gradientv8000V 5hr (40000Vh)v500V 维持BACKIPG strip equilibrationBACK分装40ml 贮存于-20这是一个贮存液。用之前在加1%DTT 或者2.5%碘乙酰胺。第二向第二向SDS 电泳（电泳（SDS-PAGE）BACK2-DE 2-DE 胶蛋白质点的检测胶蛋白质点的检测v1）考马斯亮兰染色法；v2) 银染法；v3）负染法；v4）荧光染色法；v5）放射性同位素标记法。考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法v经典的考马斯亮兰染色（经典的考马斯亮兰染色（R-250R-250） 局限：灵敏度低（1g protein/spot）vNeuhoff Neuhoff 胶体考染法胶体考染法 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spotv热考马斯亮兰染色及二次染色法热考马斯亮兰染色及二次染色法.银染法银染法v银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。v由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上。SYPRO Ruby 蛋白染色 (荧光)Bio-Safe 考马斯蓝染(可见光)银染(可见光)背景信息背景信息不同的染色方法BACK