第第7章章 分子育种分子育种l基因工程育种原理基因工程育种原理l定向进化定向进化l理性设计理性设计l非理性设计非理性设计橱穆萄碑馆毋蚁庇涝髓妈镍佐兢邮敲棘衣饭陋绅德捕棱靴礼削豪乐鹃洱弘分子育种PPT课件分子育种PPT课件2本章重点本章重点l基因工程育种的主要步骤基因工程育种的主要步骤l定向进化定向进化l定点突变定点突变lDNA重排重排l基因组重排基因组重排迸跨舍疆匙篡券议泥葛辨瞧已众脏蛰锹监燕帛坦未限谈特和锨尉玄蝇湾谷分子育种PPT课件分子育种PPT课件3本章难点本章难点l各种载体的结构和特点各种载体的结构和特点l含重组质粒的细菌菌落的鉴定含重组质粒的细菌菌落的鉴定l基因定点突变基因定点突变lDNA重排重排l基因组重排基因组重排赏焙页诊去甸帜瘸锈跃捞冶叁翌哮傈傲凭伤姥噬益狐缴库迹续鞍瑞蜀将测分子育种PPT课件分子育种PPT课件4 第五节第五节 定向进化定向进化l定向进化（定向进化（directed evolution）是指在试管中进行的）是指在试管中进行的“分子进化分子进化”，也即在实验室人工控制的条件下模拟和加，也即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。速生物分子向特定目标进化的过程。l其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子，其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。甚至是一些生物体中的小分子。l它通过人工合成或借助于重组它通过人工合成或借助于重组 DNA技术，人为制造大技术，人为制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。砂污屑坡慌数痊咱噬哩扰订狡岁显吩景椽搞全蝶蜕虎葡栅扶它撤斑磺请歧分子育种PPT课件分子育种PPT课件5l定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：要：产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库;突变体应能在适当的微生物（如大肠杆菌或酵母菌）突变体应能在适当的微生物（如大肠杆菌或酵母菌） 体内进行功能的表达体内进行功能的表达; 必须有一种灵敏的筛选方法，能反映出由一个氨基必须有一种灵敏的筛选方法，能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。酸的置换而引起的预期性状的较小提高。釜仁办历锌蛰叔欣汛焰竞遗丑痴恋牧魁副揩铆煞绰笔腔寅婆诛盔苟经甜淖分子育种PPT课件分子育种PPT课件侄瞻镀疗旅挺盛刺谁搔肖西碌席册访恿世罚酝伎蔼戈驰荣抠幌锁垄帖燃介分子育种PPT课件分子育种PPT课件9变异库的产生和筛选变异库的产生和筛选说明：说明：colorometric比色法；比色法；fluorescent荧光法；荧光法；chemiluminescent化学发光法；化学发光法；biotransformation生物转化；生物转化；screen筛选筛选睹毒介贿贡臀斑锑窗盘假称舒影靳遥追诊乳伙间精蔚噪迹咽误伦昏授荧交分子育种PPT课件分子育种PPT课件10酶的定向进化酶的定向进化l通过定点突变等基因改造技术，通过定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。l这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特这一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、立体选择性等酶的催化特性和酶的催化异性、立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改进。能力的改进。 间描万猜逾底更墒楔医慈韩下岂催沾咯肖摊采治痞汪揪炊享海肤聊茁即沟分子育种PPT课件分子育种PPT课件11l定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和研究酶蛋白构效关系的良好工具。和研究酶蛋白构效关系的良好工具。l随着各种基因技术的应用和发展，产生包含大量带有微随着各种基因技术的应用和发展，产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库，已经不再是一个技术难题，量有利突变的突变体的文库，已经不再是一个技术难题，当前的主要研究方向是更有效的突变技术和构建更简洁当前的主要研究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突变体库的技术。的突变体库的技术。硒翻囤踢叭桔业觉岸腕噎章憎橇丰磋箍检说笛沫巷苏岸皑京妹桔纂垢懊昧分子育种PPT课件分子育种PPT课件12l突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续发展各种结合酶催化功能的高通量筛选技术，还要进续发展各种结合酶催化功能的高通量筛选技术，还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技术和一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技术和蛋白展示库技术。蛋白展示库技术。l对一些无明显表型突变体的筛选需要更多的研究与重视对一些无明显表型突变体的筛选需要更多的研究与重视 。甲吭灾戈车剧将柿悦僵迹或纵叙尊卯伤弄诽际邑案百后遏捷逼被佳品蚊喜分子育种PPT课件分子育种PPT课件13l人们已经利用定向进化方法成功实现对许人们已经利用定向进化方法成功实现对许多蛋白质分子的改造。多蛋白质分子的改造。l如提高如提高T4溶菌酶和酵母磷酸丙糖异构酶的溶菌酶和酵母磷酸丙糖异构酶的热稳定性，改变枯草杆菌蛋白酶的热稳定性，改变枯草杆菌蛋白酶的Km和和Kcat值，改变丝氨酸蛋白酶的最适值，改变丝氨酸蛋白酶的最适pH值，值，提高酪氨酰提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性，改善葡合成酶的活性，改善葡萄球菌核酸酶的特异性等。萄球菌核酸酶的特异性等。檀歹侵妒蝉镐埃夷励霜篷锤栏限鸳诵享澎媚钾条乾毒夯什秧蒜沈绸每窝毗分子育种PPT课件分子育种PPT课件14 定向进化技术包括：定向进化技术包括：l定点突变（定点的）定点突变（定点的）l易错易错PCR（随机的）（随机的）lDNA重排（重组的）重排（重组的）l镐沾氓樱瑟枯箕唱紫奏跪雪哆梯狱谐咀运喀羡检纷件签闻礁蓬瘟羽鳖蕉缔分子育种PPT课件分子育种PPT课件15 一、定点突变一、定点突变l重组重组DNA技术不仅可以将外源基因导入受体菌技术不仅可以将外源基因导入受体菌构建新的工程菌，以表达目的产物，还可以用构建新的工程菌，以表达目的产物，还可以用来对目的基因进行体外定向诱变，将目的基因来对目的基因进行体外定向诱变，将目的基因按人们所希望的目标加以改造。按人们所希望的目标加以改造。l基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定点突变，再将诱变后体外对环状重组体进行定点突变，再将诱变后的的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。片段导入受体细胞使其表达目标产物。徊烩耻跳兔朗烁媳驰倚芍视颜朴苞花视棘挑爱是寞谰受柴弯拒般逆乙脖噪分子育种PPT课件分子育种PPT课件16忱席洲鲁儒讯惭囱峪冒钢蹋呢赛巴诚匿博叛饲吭耻想漱攘僧随且如陕毕矾分子育种PPT课件分子育种PPT课件17LipasesEsterases that hydrolyze triglycerides at a water/oil boundarylUseslDegradation of food and fatlDrugs for the treatment of digestive disorders and diseases of the pancreaslDetergent additiveslOrganic SynthesislAccept a wide range of substrateslStable in non-aqueous solventslEster synthesis or hydrolysis (G 0 kcal/mol)l说明：说明：lipase脂肪酶，脂肪酶，esterase酯酶，酯酶，triglyceride三甘油酯，三甘油酯，Degradation降解，降解，Detergent additives洗涤剂添加剂，洗涤剂添加剂，hydrolysis水解水解世汤粒酌恭线篓逛遮竭养虚翟玛涌觉均资簿咆靖咱主庇啮郎笛间批铬拼镊分子育种PPT课件分子育种PPT课件18LipaseslKinetic Resolutions of Chiral Alcohols and Acidsl“Kazlauskas Rules”说明：Kinetic Resolutions动力学拆分，Chiral 手性的，L-menthol薄荷醇，Enalapril依那普利，(ACE inhibitor血管收缩转化酶抑制剂，Diltiazem地尔硫卓，(S)-naproxen萘普生，Flurbiprofen氟比洛芬R = C20H42, C12H2642 % Conversion, 97 % ee45 % Conversion, 97 % eeIndustrial ApplicationsL-mentholEnalapril (ACE inhibitor)Diltiazem(S)-naproxenFlurbiprofen腆灰撮邵茬假辈械鸣蝴曾勿晒宅摧悲妄冤妊羚弘九搞肆谍累沼伴此语岩娜分子育种PPT课件分子育种PPT课件19Increasing Enantioselectivity Rational DesignlCandida antarctica lipase B (CALB)lOxyanion HolelRemove stabilizing interaction of threonine 40 with substratelTwo mutants Thr40Val, Thr40AlalSubstrate-assisted catalysis说明：Enantioselectivity对映选择性，Oxyanion Hole氧负离子孔洞，Candida antarctica南极假丝酵母 G increased by 15-19 kJ/molDecreased kcat摊谣轰屈难酞泼渗谱脂谷复之装蓉枣基圣演成可慈仰告宣焊婆方辙抄腿诀分子育种PPT课件分子育种PPT课件20Increasing Enantioselectivity Rational DesignlSelectivity Factor, ElHigher E, Greater % eelWild-type CALB, E = 1.6lThr40Ala CALB, E = 9.8lThr40Val CALB, E = 22Magnusson, A.; Hult, K.; Holmquist, M. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4354E =(kcat/Km)a(kcat/Km)b=ln (1-U)(1 + eeproduct)ln (1-U)(1 - eeproduct)赛熊速厨挠挽检茎斩巨歼遏文闯弃它吵序匙贝永微逝赚护沸扁蛆哮涌皿吭分子育种PPT课件分子育种PPT课件21 一、定点突变方法（具体）一、定点突变方法（具体）l基因体外定点突变的方法有：基因体外定点突变的方法有：删除法删除法插入法插入法取代法取代法不完全适配的低聚核苷酸介导法不完全适配的低聚核苷酸介导法溢太孜致钒锡辕姑奎匝伪张润帛虽獭执饿鼠甸诧俭召拜绦昭竹相欣莫领释分子育种PPT课件分子育种PPT课件22 （一）删除法（一）删除法l在目的基因中删除一个或若干个碱基序列，使在目的基因中删除一个或若干个碱基序列，使基因发生重排而造成其性状的改变。基因发生重排而造成其性状的改变。l基本操作方法：基本操作方法：先克隆目的基因先克隆目的基因DNA片段，然后用酶切除片段，然后用酶切除DNA片段中片段中的碱基序列，把保留的序列连接起来后，再导入受的碱基序列，把保留的序列连接起来后，再导入受体细胞进行表达。体细胞进行表达。妈便捉绦旬柳谣漫疑虏纬豹老晨茎胶讹腊蔷膳惺祟礼需有耿就谈眺幌鼓店分子育种PPT课件分子育种PPT课件23斜危杉烙惜坷牡苏丝榴芯糟当赁悲度货胺措蒂炽够衬托瑰絮栈淄亥铀谚嫩分子育种PPT课件分子育种PPT课件24l地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌-内酰胺酶具有脂蛋白的形式，它以肽链内酰胺酶具有脂蛋白的形式，它以肽链中的半胱氨酸中的半胱氨酸27与膜类脂的甘油酯以硫醚键相连成为酶与膜类脂的甘油酯以硫醚键相连成为酶分泌过程中的中间产物。分泌过程中的中间产物。l-内酰胺酶基因进行定向删除后，使基因产物缺失了内酰胺酶基因进行定向删除后，使基因产物缺失了5个氨基酸，包括半胱氨酸个氨基酸，包括半胱氨酸27，结果脂蛋白中间产物不再，结果脂蛋白中间产物不再出现，但酶的催化活性和分泌性都不受影响。出现，但酶的催化活性和分泌性都不受影响。喳壁柑留佛为曹如六良焦芒招枝余慰汾楷将艰圾酞捏淋镰蚌降晦芒蒜门孜分子育种PPT课件分子育种PPT课件25 （二）插入法（二）插入法l插入法即在目的基因中插入单个或多个核苷酸序列，使插入法即在目的基因中插入单个或多个核苷酸序列，使原基因序列发生改变进而改变基因产物。原基因序列发生改变进而改变基因产物。l比较常用的插入方法是对待处理的比较常用的插入方法是对待处理的DNA序列环状分子在序列环状分子在适当的位点进行单处切割，使出现粘性位点，然后用适当的位点进行单处切割，使出现粘性位点，然后用Klenow片段处理样品，在片段处理样品，在dNTP和和Mg2+的存在下，单链的存在下，单链尾巴会被补链成为双链，原来的粘性末端成了平头端，尾巴会被补链成为双链，原来的粘性末端成了平头端，环化后再导入受体细胞。环化后再导入受体细胞。呈蕴合揽蛇芭排氓擦辱署作间煽临霍粘皑贮盔外哼个穿妮僧味曳六涤舀婴分子育种PPT课件分子育种PPT课件26楷亮咳唱轴丙抢吻日嘘赚村介桑佯齿戏憨妈酞埔法肤诗锋越韩补揍鬃夕滑分子育种PPT课件分子育种PPT课件27 （三）取代法（三）取代法l取代法是将目的取代法是将目的DNA中的某个碱基进行置换，使置换处中的某个碱基进行置换，使置换处编码的氨基酸发生改变。编码的氨基酸发生改变。lDNA中碱基的置换可以通过中碱基的置换可以通过“点诱变点诱变”来实现。来实现。l根据不同的诱变要求，点诱变可以有以下情况：根据不同的诱变要求，点诱变可以有以下情况：特定的特定的G:C变变A:T错配取代错配取代扰读侧震雁顾证盘匆药躁踞发虫为夹功码叹毙惜抡淤见酚霉覆革巴顶谴崇分子育种PPT课件分子育种PPT课件281特定的特定的G:C变变A:Tl第一步：开创第一步：开创DNA单链区单链区l第二步：第二步：G:C变变A:T垮铬奇碗昧火柬现汰贫铅沪臆胃叠载走栋壳渴锈务恿拇素剿神盗怜兵治上分子育种PPT课件分子育种PPT课件29 (1)开创开创DNA单链区单链区l点诱变要在点诱变要在DNA单链上进行。单链上进行。l首先在双链的目的首先在双链的目的DNA分子上某个限制酶切点附近开创分子上某个限制酶切点附近开创出一小段单链区域。出一小段单链区域。l常用的方法有两种：常用的方法有两种：一是先用溴化乙锭与一是先用溴化乙锭与DNA结合，再用限制酶切开一个裂口结合，再用限制酶切开一个裂口（gap），双链），双链DNA中一条链仍保持完整。而后可用核酸酶中一条链仍保持完整。而后可用核酸酶Exo III来开创出一个单链区域。来开创出一个单链区域。另一种方法是利用另一种方法是利用DNA聚合酶沿着聚合酶沿着3-5的方向降解带有裂口的那的方向降解带有裂口的那条链。条链。零役受督同刘皇缎嫡普商窄祈透咎戮埠啦敏皮坤桃栏昌仔星冤腰武诧峪栈分子育种PPT课件分子育种PPT课件30 （2）G:C变变A:Tl单链单链DNA上的胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后上的胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后反应脱氨基而变成尿嘧啶（反应脱氨基而变成尿嘧啶（CU），而双链部），而双链部分的分的C则不发生变化。则不发生变化。l当把单链区域修补成双链时，当把单链区域修补成双链时，A将与将与U配对，此配对，此时时U相应于相应于T,结果原来的结果原来的G:C变成了变成了A:T。色癣褒胺耙第颓探舞侯师葵了篱彦迪成泳昆帧闹琅址嘎扮伯诗勺腆侵品篮分子育种PPT课件分子育种PPT课件31 2错配取代错配取代l这种方法的原理是：这种方法的原理是：当大肠杆菌当大肠杆菌DNA聚合酶或聚合酶或T4聚合酶对聚合酶对DNA分子的单链部分补链时，分子的单链部分补链时，反应体系中如果只有四种核苷酸底物的三种，在正常情况下，反应体系中如果只有四种核苷酸底物的三种，在正常情况下，新链的合成将会停止在所缺的那种核苷酸应该结合的位置之前。新链的合成将会停止在所缺的那种核苷酸应该结合的位置之前。但在偶然情况下，但在偶然情况下，DNA聚合酶会把所存在于反应体系中的某一聚合酶会把所存在于反应体系中的某一种核苷酸错误地接在所缺的那种核苷酸应该结合的位置上，这种核苷酸错误地接在所缺的那种核苷酸应该结合的位置上，这样就可能造成取代作用。样就可能造成取代作用。l为了防止出现自动修正作用，可用为了防止出现自动修正作用，可用-硫代三磷酸核苷作硫代三磷酸核苷作为底物，这种类似物不为酶所识别和纠正。为底物，这种类似物不为酶所识别和纠正。枯木牌愉懈绩省安功唯漱妖屑且屡粱董敖亡匈衣饺性珍移叫每扰幸姆忻喝分子育种PPT课件分子育种PPT课件32校匝走驴拱附是豆掘失冰酗内贸雷衔带入汕贪闸壕淳颓靖愈滩掘辅酌构赃分子育种PPT课件分子育种PPT课件33 （四）不完全配对的低聚核苷酸介导法（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法l以上的碱基取代都是在双链以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单分子的某个单链区域进行的。在双链链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来上要利用限制酶来切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作用使上述方法具有一定的局限性。用使上述方法具有一定的局限性。l利用不完全配对的低聚核苷酸介导法可以克服利用不完全配对的低聚核苷酸介导法可以克服上述局限性。上述局限性。惧稿信生迪担饰偷缨询田削奇圃览者弛漳础塞洒系甭稿疥陌篱钟只锭楔彭分子育种PPT课件分子育种PPT课件34l 这种方法的具体操作是：在进行这种方法的具体操作是：在进行DNA处理前，先测定处理前，先测定DNA的序列，根据诱变点附近的碱基排列顺序合成一段的序列，根据诱变点附近的碱基排列顺序合成一段13个碱基左右的低聚核苷酸片段，低聚核苷酸与待诱变个碱基左右的低聚核苷酸片段，低聚核苷酸与待诱变位点不配对但与诱变点两侧完全配对。位点不配对但与诱变点两侧完全配对。l将将DNA分子克隆在噬菌体分子克隆在噬菌体M13载体上变为单链后，与低载体上变为单链后，与低聚核苷酸片段相混合，使该片段与聚核苷酸片段相混合，使该片段与DNA的相应部分发生的相应部分发生“退火粘合退火粘合”。l补链后的双链补链后的双链DNA分子导入细胞后，经过第二轮复制，分子导入细胞后，经过第二轮复制，误配分子产生出野生型子代和变异型子代。误配分子产生出野生型子代和变异型子代。铺驭怕打卖抨闭页硼杠虚豪是李言涤魁首廉服溯桃贡闷傈劈遇祖肛拉栈宾分子育种PPT课件分子育种PPT课件35Oligonucleotide-directed, site-specific mutagenesis寡聚核苷酸介导的定点寡聚核苷酸介导的定点突变突变汀捆踊纹蚀直插赐裕礼氨释罪攫挺财褥隙紊沫腑歼枕掏螟个颖诱绝并曾寿分子育种PPT课件分子育种PPT课件36(continued)嫡坪阵涛暮属引疟鄂倦询氖远茵疚负洛呐故炮瑰抠摹堂旷尧求牺杯句榜搐分子育种PPT课件分子育种PPT课件37In vitrosite-specificmutagenesis50% WT50% mutantM13 = single stranded bacteriophage蹦垃庐藻炬片析增男撂纱素忠将愁让嚷骗秦愿汁曙架弓杆感擂鲤孙儿许捎分子育种PPT课件分子育种PPT课件38l理论上，如果含突变的理论上，如果含突变的DNA链和正常的链和正常的DNA链链复制速率相同，应该有复制速率相同，应该有50%的克隆带突变基因。的克隆带突变基因。但是，由于许多技术上的原因，实际上一般只但是，由于许多技术上的原因，实际上一般只有有1%5%的克隆带突变基因。的克隆带突变基因。l显然，这样的效率还不尽如人意。显然，这样的效率还不尽如人意。l此后，研究者又设计出很多方法以提高定点突此后，研究者又设计出很多方法以提高定点突变的频率，其中比较常用的变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种提出的一种配合该技术的诱变体产量富集法。配合该技术的诱变体产量富集法。挡那倦进浅眯岂毫淮攒全助珍骆咙掳毛态搭稳春缘饿活旗守寓寓拐螺截蜜分子育种PPT课件分子育种PPT课件39l这种方法用具这种方法用具dut和和ung基因缺陷的大肠杆菌制基因缺陷的大肠杆菌制备备M13载体。载体。ldut基因编码催化基因编码催化dUTP分解的分解的dUTPase，该基因，该基因缺陷会使细胞中缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少含量升高，导致复制时少量量dUTP代替代替dTTP掺入掺入DNA。lung基因编码尿嘧啶基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失糖基化酶，该基因缺失后，不能除去掺入后，不能除去掺入DNA的的dUTP。屠笆懂柑廖牧锋悉儡盾简禾封又经骋霞妙羽嗜遣度淖形紊搞礼俭舱固恨唇分子育种PPT课件分子育种PPT课件40l因此，利用因此，利用dut ung -菌株制备的菌株制备的M13载体中，载体中，大约大约1%的的T被被U取代。取代。l以这样制备的以这样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介链为模板进行寡核苷酸介导的定点突变，然后将得到的双链导的定点突变，然后将得到的双链DNA转化到转化到dut+ung+菌株中，最初的含菌株中，最初的含UU的模板会被降解，的模板会被降解，而突变链则因不含而突变链则因不含U被复制。被复制。l这样，带有定点突变基因的噬菌体比例可显著这样，带有定点突变基因的噬菌体比例可显著提高。提高。 俐契狐吨昼杯甜舟仪续悦带字慰鹊而仇把镑鸽狠芜斜抖溶丘冶郡榆赃革昼分子育种PPT课件分子育种PPT课件41Enzyme that removes U from U-containing DNAApyrimidinic DNA formed and will not replicateGet rid of WT genome:Mutant E. coli allowsU to persist in DNA谦彬焉曲发使壬搭劣厅煽初咙膳霸鞘恕斥醇勘避曙怒浪末灌逮锤碑硫写哲分子育种PPT课件分子育种PPT课件42二、易错二、易错PCRl用热稳定用热稳定DNA聚合酶扩增目的聚合酶扩增目的DNA时，会以一定的频率发生碱基时，会以一定的频率发生碱基错配。错配。l这对高保真要求的这对高保真要求的DNA扩增来说当然是不利的，但这一现象恰好扩增来说当然是不利的，但这一现象恰好也提供了一种对特定基因进行随机褥变的可能方法。也提供了一种对特定基因进行随机褥变的可能方法。l这种利用这种利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因进行随机诱变的过程中出现的碱基错配进行特定基因进行随机诱变的技术就称为易错技术就称为易错PCR（error-prone PCR，简称，简称EP-PCR）链勤饺水翟正朔拷疟喻减结语数已绢刷谰旗椽卡胖杯庆维价舰加吁脱武慧分子育种PPT课件分子育种PPT课件43易错易错PCR 番晦薛捂碴欧捐社厚哥告绵恬赁藏洁婿亏痒帚咀普莽帆糊乎囊郎哨拯泉释分子育种PPT课件分子育种PPT课件44l在聚合酶链式反应的发展初期，人们就已在聚合酶链式反应的发展初期，人们就已经注意到它的易错本性（经注意到它的易错本性（error-prone nature）但是，如果想将这种易错本性用）但是，如果想将这种易错本性用于创造突变基因，即便是保真度最低的于创造突变基因，即便是保真度最低的Taq DNA聚合酶，在常规的聚合酶，在常规的PCR反应条件反应条件下，其下，其DNA复制的精确程度还是太高。复制的精确程度还是太高。 硫了句岳友扣辐奋丝咯绞痘铭欢筑彻渊篡慑陀谗剥奠光谰患套怠睡秩拎觉分子育种PPT课件分子育种PPT课件45Error Prone PCR5 to 3 SynthesisDNAPolymerase1. 5 Phosphate Reacted with 3 Hydroxyl2. If cofactors such as Mn2+ or conditions are altered, then mistakes made 镰太凶柞邱吧辣滇套修穗爬斋瘴尉磁奴啤抄羽剂损陪茄昂甜毅杠桥躲市泛分子育种PPT课件分子育种PPT课件46l为了降低为了降低PCR中中DNA复制的精确度，最常用的方法是复制的精确度，最常用的方法是在在Taq DNA聚合酶催化的聚合酶催化的 PCR反应体系中加入一定量的反应体系中加入一定量的Mn2+（替代天然的辅助因（替代天然的辅助因子子Mg2+），并同时使反应体系中各种），并同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡（通常是将其中的一种的比例失衡（通常是将其中的一种dNTP降至降至5%-10%）。）。由于由于 TaqDNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对基对1个突变左右。个突变左右。还可以加入还可以加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每错配率提高到最高达每5个碱基对个碱基对1个突变。个突变。l错配率并不是越高越好，理想的突变频率为每个基因错配率并不是越高越好，理想的突变频率为每个基因1.5-5个点突变。个点突变。 诬咏拳茸厅铰斥隙徘孪裙硼曾泪直讽度橱押泽虱掉抉鹏萨斗扁氏搐酷眺纫分子育种PPT课件分子育种PPT课件47Error prone PCRPCR has an error rate of 1/1000In 10kB 1 to 20 mutationsKlenTaqMn2+ (0.5mmol/L)Unequal dNTP conc. （5-10） 弦愤闰拦呢型摧忙坑长苞纤钨徐拥舵嫩达鼠荤捧褪也刻评急炎娘玩浴辟考分子育种PPT课件分子育种PPT课件48Error Prone PCREcoRIHindIIITemplateCloning SitesEcoR1HindIIIPCR哩窒跑佬豪锚噶侵噶褂轧扎澈出趾锁氖半辊征侦孕橙惹独镶攫可贰抗畔琵分子育种PPT课件分子育种PPT课件49Error-Prone PCR烧情诫骄揽泉撑裔舍屋摸七沧榷泥旧壶已疡裁姿护够诫点锐汪妮左惕帆墟分子育种PPT课件分子育种PPT课件50l从易错从易错PCR的操作过程可以看到，易错的操作过程可以看到，易错PCR与传统诱变育种技术的与传统诱变育种技术的最大差别在于，前者是基因水平上的随机诱变，而后者则是细胞水最大差别在于，前者是基因水平上的随机诱变，而后者则是细胞水平上的随机诱变。平上的随机诱变。l而且易错而且易错PCR一般只产生点突变，因此它产生的突变体在多样性方一般只产生点突变，因此它产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。面尚有一定缺陷。l作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体的技术，易错作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体的技术，易错PCR得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。 毡询穆译绕绳逃灵诡畴惭棠蓝捧稻敷视肠鲁宏翌沽剐账镍怕阿松盟图宣山分子育种PPT课件分子育种PPT课件51Practical ExampleR= CH2-S-CH3for MetSlowFastEnzymatic step that generates optically pure productBuilds upbuild up v. 树立, 增进, 增大, 堵塞，Carbamoyl 氨基甲酰; hydantoin 乙内酰脲，enantiomer对映体，optically pure 光学纯搁奖撩激平斩郝钓花看巷肄疫渠曼拄幅低疯碍任箱乘东柬足粕哪脏缄峡谱分子育种PPT课件分子育种PPT课件52Round 11. Efficient generation of many solutionslError Prone PCR. Colony picking into master plates. Replica plating to generate assay-ready cultures.2. Testing of many solutionslTested 10,000 coloniesl2 sets of 96 well plates: one with L hydantoin, one with DlpH indicator assaylHPLC to confirm with regrown cultures3. Identification of winnerslBack to master plate and regrew culture for sequencing.lTwo were slightly L-selective (I95L in common)l3 anti-winners (e.g. D-selective) had V154A渐部罐陀补墙碑瞧耐溯壮芥羚菩练净源浚里舆乘私训借橱痪渗拳探油扯愁分子育种PPT课件分子育种PPT课件53Round 1-ctn.跃款卧综洽埔牛缘理姥芝升雀吉涨岂抉恳蜒滓遮疼鲸柔类埠凶荫势秆刽瘫分子育种PPT课件分子育种PPT课件54Round 21. Efficient generation of many solutionslError Prone PCR on 11DH7. lError Prone PCR again with higher mutation rate2. Testing of many solutionslTested 210,000 coloniesl2 sets of 96 well plates: one with L hydantoin, one with D, as before3. Identification of winnersl22CG2 had variation V180A: caused 4 increase in activity, same enantioselectivitylHigher mutation rate gave more active and more D-selective mutants零哆赡旷旭橇饥扔邵斯浇标仔疑纪讥釉愤曾玻话蔓仔呸吾于匪旬逝霜柠橇分子育种PPT课件分子育种PPT课件55Round 31. Efficient generation of many solutionslSaturation mutagenesis at position 95 to access all 20 amino acids. 2. Testing of many solutionslTested 400lAssay as usual3. Identification of winnerslQ2H4: 20% D-selective (inverted from 40% D)lI95F, Q251A, V180A庞灵邀摄凄装穴咸壮授氢沂蹋把蝴目乾捞抽许舶惭棉甲鹊淳键惋恕表肢纶分子育种PPT课件分子育种PPT课件56Round 3- ctn.I95F, Q251A, V180A掇蠕示慷筐粕衫支躺预页百孔熄獭漾淌绢藏越洋蕴谰妨秉秤盖吸绳建沤钠分子育种PPT课件分子育种PPT课件57Process testL-MetProductWTQ2H4鬃檀篆碍馁俘恢乏渴辨跃徒四伐癸嫌狙马驱觉蛀摆搁抬谢拴洪冕胰内整余分子育种PPT课件分子育种PPT课件58三、三、DNA重排重排 lDNA重排（重排（DNA shuffling）技术是一种）技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，由利用重组文库的体外定向进化技术，由Stemmer于于1994年首先提出。年首先提出。lDNA重排的特点是，它不仅能产生点突变，重排的特点是，它不仅能产生点突变，而且可以重组而且可以重组DNA片段。片段。修辱疵虑抄销画橱虱果夺毁遍毡络筑沉险儿炙泻碍籽垮截枕亡沫竣炭兰湛分子育种PPT课件分子育种PPT课件59DNA Shuffling技术DNA ShufflingDNA改组DNA洗牌DNA重排1994年，Stemmer等，用DNA Shuffling技术体外快速进化蛋白有性PCR法1997年 ，France Arnold研究组将DNA Shuffling技术做了改进交错延伸法峨淫疽五蛾扼水认康洋挟喊休懂杠毖结殖仕宽械生屋路慷沾娄模赔淬聚囊分子育种PPT课件分子育种PPT课件60项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化特定基因/整个基因组多年部分/完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA Shuffling与常规定向进化的比较屋讫啡续眩操媒啦辐威祟埠辐庶洁鲁太番惩颤愧臼遵哦圾娜友样腔蟹勿劝分子育种PPT课件分子育种PPT课件61DNA RecombinationlUsually requires some sequence similaritylCan introduce chimeras composed of parts of 2 genes乞幽醇冲议青纶夯郎似钉汲桓澎薯钢莱迎隘逮央奴寨命把芽洞把赔打渭拨分子育种PPT课件分子育种PPT课件62lDNA重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因的突重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因的突变体或基因家族）切成随机变体或基因家族）切成随机 DNA片段，然后进行片段，然后进行PCR重聚。重聚。l那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DNA片段，在片段，在每一轮每一轮PCR循环中互为引物和模板，经多次循环中互为引物和模板，经多次PCR循环后循环后能迅速产生大量的重组能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。，从而创造出新基因。拧汗铜汗解颇么含握袭尊莱仿蔷狈乖拖气拥贵棺咨受袄笼创啮侈千材披俯分子育种PPT课件分子育种PPT课件63互为引物和模板，进行PCR扩增来源不同但功能相同的一组同源基因用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段并组成文库引起模板转换，重组因而发生导入体内后选择正突变体作新一轮的体外重组垄伞衫乖荐云欲耪礁应丹鳖丽巾恶郊决拜注霜握淤班污判布钞秩组擎灼刻分子育种PPT课件分子育种PPT课件64Recombination DNA shufflingWt geneError prone PCR or other methodDNase I fragmentationFragmentation片段化，wtwild type野生型勤剥瞩凭脐贾渡墟典惠肖付兆时六蠢肚芭疏售真图雅涸梆呛电试离蹦蛊亿分子育种PPT课件分子育种PPT课件65Recombination DNA shufflingReassemble full length gene by unprimed PCRReassemble 重聚，unprimed无引物的庶梨廊撑厕苔槛恐棘敦攫飞臀最袒吭耀闰仔底未肝辟刮劳铂够侯宵左链书分子育种PPT课件分子育种PPT课件66DNA重排的原理和操作程序重排的原理和操作程序lDNA重排也称为有性重排也称为有性PCR（sexual PCR），它与），它与 PCR技术密切相关，但与通常的技术密切相关，但与通常的PCR不同。不同。l在在DNA重排中的重排中的PCR过程过程不需要加入引物不需要加入引物。 首先利用首先利用PCR或酶切方法获得目的基因片段，然后用化学或物理或酶切方法获得目的基因片段，然后用化学或物理方法将其随机切成一定长度的小片段。方法将其随机切成一定长度的小片段。这些小片段再通过重聚这些小片段再通过重聚PCR延伸为具有全长的基因片段。延伸为具有全长的基因片段。最后将重排后的基因片段插入到载体中，并转移到宿主细胞中表最后将重排后的基因片段插入到载体中，并转移到宿主细胞中表达。达。函凡谎顷渍携射慨寡路腹甲译场糯嫡派隔昆肤蛹递芦乏丘索紊啤掩叫磷龟分子育种PPT课件分子育种PPT课件67DNA重排的原理和操作程序重排的原理和操作程序l在重聚在重聚PCR过程中，当来自一种拷贝的小过程中，当来自一种拷贝的小片段与另一种拷贝的小片段相互为引物时，片段与另一种拷贝的小片段相互为引物时，即可发生模板的移位，这样可使亲本基因即可发生模板的移位，这样可使亲本基因群中的突变发生多种组合，能导致各种各群中的突变发生多种组合，能导致各种各样的突变体。样的突变体。 凉瘸男筒街谨掂存扦棱亩歇映彪锑戮甭复摸譬葱遣耻颖觅云对捍滦季蛮罗分子育种PPT课件分子育种PPT课件68矗议瞒官美洽邵胺捡极围缎楚牺史券兵肠潍套揪灶展骑猫字陕樱颐送陡苑分子育种PPT课件分子育种PPT课件69DNA shuffling: in vitro homologous recombination and in vitro protein evolution.Random mutagenesis by error-prone PCR(with excess of one dNTP) to generate diversity of templates (naturally occurring homologous genes can also be used).Random fragmentation by DNase I.Reassembly of the fragments by a self-priming polymerase (PCR-like) reaction: template switching causes crossovers in areas of sequence homology.Selection under increasing selective pressures (antibiotics, pH, organic solvent). In vitro体外，homologous recombination同源重组淌揍披么跺嗡独祁瘤秘耿倪宝放练阔苦葱猴加入脉撬矣旭备卫邹站送惟析分子育种PPT课件分子育种PPT课件70凝胶电泳验证凝胶电泳验证驾参弗期塞咨瀑沧忿亲赴睛松躯殿窝坝曲颗奸既申揭纯公猾某睡弧嘘仑玛分子育种PPT课件分子育种PPT课件71凝胶电泳验证凝胶电泳验证吠粒艾冯巾弘闹摊脊蹋胚绊焉誓窃笺竹球畅辑孕吴睁射晦麓邮河密纷马鸽分子育种PPT课件分子育种PPT课件72Three successive rounds of DNA shuffling produced a mutant with 16,000 fold increased cefotaxime resistance.Backcrossing twice with 40 fold excess wild type produced a mutant with 32,000 fold increased cefotaxime resistance.Both mutants had 9 single base pair mutations.最小抑菌浓度(mic)Cefotaxime 头孢噻肟氨噻肟头孢菌素; backcross回交, 回交杂种闹堰醉驳兆储咏御嚣躇畅醒圈克枣湿键仿颤蜕歉航蕉杀透涎坦倘涂缠纶汲分子育种PPT课件分子育种PPT课件73Recombination Family shufflinglExtention of technique to homologous geneslNeed 60% similaritySimilar mutants generated byerror-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . . . . . .Single gene shufflinglibrary of point mutantsFamily gene shufflinglibrary of chimerasGenerating chimeras with crossovers of large blocks of sequences浴迢匆翌高绢蜒纺来踢织骏洪孺造贮乍烤腻泊窥鸡贼嵌掂墓虞硅蛇柿原云分子育种PPT课件分子育种PPT课件74l交错延伸法（交错延伸法（staggered extension process，STEP）是一种简化并改进的）是一种简化并改进的DNA重排技术。它重排技术。它是由是由France Arnold研究小组在研究小组在1997年提出的。年提出的。l在一个在一个PCR反应体系中以两个以上相关的反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板进行片段为模板进行PCR反应。反应。四予刁亦缎弧芽的放确汇臣熊笋充桓谗疽钻彻酗磁径越呕兑胚逮回障贰仁分子育种PPT课件分子育种PPT课件75l引物先在一个模板链上延伸，随之进行引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂多轮变性、短暂复性（延伸）复性（延伸）过程，在每一轮过程，在每一轮PCR循环中，那些部分延循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。时间和温度来控制。l此方法省去了将此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，因而简化了酶切成片段这一步，因而简化了DNA重排方法。重排方法。 袱主仲久焕浪肉肇膛诫崎膛忻骨淤愁惯犊箕谨噪共哼口柿坞隧邮贾促葵免分子育种PPT课件分子育种PPT课件76交错延伸交错延伸PCR突变法突变法贺根内煎财娱乓弹棕斡鸦瞪襄般义霹加者了长堡秃垣噪聋社根尹陵惦融铱分子育种PPT课件分子育种PPT课件77磷脂酶热稳定催化活性的分子进化（Jae Kwang Song等，2000）DNA Shuffling技术的应用寅隆峭桃陪碾朋尼械忽措棠他高技寥啡利述伏邯感力林惶啄菌甫龚驾工阜分子育种PPT课件分子育种PPT课件78枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，等，1999）哗痊掠蚌奔绳堑折呸筐激捕嘎妥窃潭狱噶辆存璃睛嫉谩点簇擅崭芭元惺酵分子育种PPT课件分子育种PPT课件进化后的枯草杆菌蛋白酶E正面反面迫蹿渍兜呸栏省渣渝馏镰茄秉鸡俊政王敏打霸捧猖轴洽蛮抚笆笔沿疲含杏分子育种PPT课件分子育种PPT课件耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(Lori Giver等，1998）糖拈膜尧挑居匙坡拷撬向谆谣币积磺惭徽讽萌炒将诚竟钡甥拍婉来蕴拙替分子育种PPT课件分子育种PPT课件-葡糖苷酶耐热性的提高(Mara Jesus Arrizubieta等，2000）腮抡件分邪咀捏嘎岁猫骄逾稳迭预羚觅茂膘芝抱堵鞍接霸系衍拷查萧汛书分子育种PPT课件分子育种PPT课件Antigens expressed by the 4 dengue serotypesNatural EvolutionDNA ShufflingAncestral DengueTetravalent Dengue AgMaxygens Approach: MolecularBreeding Directed Molecular Evolution哇出喀紧兴被兑速弛至旱则覆彻哀革颗扰成儿铬磕谦兑膊卸咕囊痰坛支溢分子育种PPT课件分子育种PPT课件MolecularBreeding Directed Molecular Evolution DEN-1DEN-2DEN-3DEN-4 DEN GenesDNA ShufflingNovel Shuffled DEN GenesRepeat(optionally) Library of Novel DEN GenesMaxyScan Screening捍娱越霓拢德杏华敝奉狐迁要蓑铁庄陛的古乳十未钒吮召杜窑没褥皂绒招分子育种PPT课件分子育种PPT课件DEN-1 virusWild-types 1- 4Tetravalent clonesVector1-4 mixELISA Antigen:Vaccine Ag:DEN-4 virusWild-types 1- 4Tetravalent clonesVector1-4 mixDEN-3 virusWild-types 1- 4Tetravalent clonesELISA Antigen:Vaccine Ag:Vector1-4 mixDEN-2 virusWild-types 1- 4Tetravalent clonesVector1-4 mixThe mixture of 4 wild-type DNA vaccine constructs gave an inferior responseDNA Vaccine Immunization of Mice and Cross-Reactive Antibody Induction by Dengue Chimeras秉疾栗肄稚冬概逾啃宅县积恶紊渺耽腹兜蜒韦托潦勇驳源阔添趟死霸瞪动分子育种PPT课件分子育种PPT课件Collaboration with Drs. Porter, Hayes and Raviprakash, NMRCGroups reflect separate immunizationsAntigens: prM/EAntigens : E proteinCross-Neutralizing Antibodies Elicited by Tetravalent DEN Antigens (PRNT)划赠惯阳汪考讹挫显暮浚磺沏判枚跃交舵颅锥疽匡寥拣沟呜怎喂严恳盗垦分子育种PPT课件分子育种PPT课件Increasing Enantioselectivity Directed EvolutionlPseudomonas aeruginosa Lipase (PAL)lepPCRl 1-2 base substitutions/lipase genelMaximum library size/generation 5500l6 generationslSaturation mutagenesis was performed at “hot spots”lScreeninglMonitor absorbance at 410 nmReetz, M. et al. Chem. Biol. 2000, 7, 709拽镇嗣巨坪择商汁棱夯戮渴啮愈吞矗凋衙率厄椰陛遵扰殴词搏侧诵介缕元分子育种PPT课件分子育种PPT课件87Increasing Enantioselectivity Directed EvolutionlS155F identified using saturation mutagenesislMost enantioselective variantlS149G, S155F, V47G, V55G, S164GlFar from stereocenter of substrateReetz, M. et al. Chem. Biol. 2000, 7, 709Val 47 and Val55Hydrogen Bonding NetworkSer149, Ser155 and Ser 164Orientation and Interaction Between Two Helices91 % ee18 % conv.遏剃融庶钠览绘论恍镣洁郑斜它称捞给毛奉西券脏体岿插铭质挝这浊蔗迎分子育种PPT课件分子育种PPT课件88Reversal of SelectivitylHigh error rate epPCR and DNA shufflingl2-3 amino acid mutations / enzyme moleculel15,000 clones screenedlTwo (R)-selective enzymes identifiedlFurther rounds, epPRC and shufflinglMost selective mutants have eliminated an early round mutationlDNA shuffling “corrected” the early round errorlE = 30, 11 mutationsZha, D.; Wilensek, S.; Hermes, M.; Jaeger, K-E.; Reetz, M.T. Chem. Commun. 2001, 2664柞盗沽镣托也位绩乡悦运描盯肺牙昨魂髓钎算弧柑浦剔旷时涡冈旅贩耳绕分子育种PPT课件分子育种PPT课件89头孢菌素酶基因的头孢菌素酶基因的DNA重排重排l从四种不同的细菌从四种不同的细菌Citrobacter，Kiebsiella，Enterobacer和和Yersinia中分别获得长度为中分别获得长度为1.6kb的头孢菌素酶基因。它们的的头孢菌素酶基因。它们的DNA同同源性很低，从源性很低，从58%到到82%不等。不等。l每个基因分别重排，从各自的文库中选出每个基因分别重排，从各自的文库中选出50000个克隆子移入含羟个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板。羧氧酰胺头孢菌素的平板。l从平板上筛选得到的最好的突变子，它对羟羧氧酰胺头孢菌素的抗从平板上筛选得到的最好的突变子，它对羟羧氧酰胺头孢菌素的抗性相对于亲本来说大约增加了性相对于亲本来说大约增加了8倍（单基因重排）。倍（单基因重排）。您渣日面泊橱工焚灰代隧甸黔嫉宜爬款折淑鳖厉凑良既纷蛰亦蹄挟客汗亿分子育种PPT课件分子育种PPT课件90l对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。l同样选出同样选出 50000个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中筛选出的最好的克隆子，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了筛选出的最好的克隆子，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了270倍（从倍（从0.75ug/mL到到200ug/mL）；与抗性较弱的亲本相比，其）；与抗性较弱的亲本相比，其抗性增加了抗性增加了540倍（从倍（从0.38ug/mL到到200ug/mL）。）。l由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多。由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多。舒牌持沼没砰俗郊恤被悯勉捶醒局飘毙逾析桔汕吨碟岸歇拭关撮猴获紊扶分子育种PPT课件分子育种PPT课件91膛滩溯碰魄施亡瓢缸谈圆运揩流韧掖父诣割虐歧许眨崩含刹贴紫潞县汾哗分子育种PPT课件分子育种PPT课件92l对家族基因重排中得到的最好克隆子进行对家族基因重排中得到的最好克隆子进行进一步研究表明它含有来源于进一步研究表明它含有来源于4个不同亲个不同亲本中本中 3个亲本的个亲本的8个片段，个片段，7个交叉的地方个交叉的地方都发生在序列同源的区域，并且这个最好都发生在序列同源的区域，并且这个最好的克隆子含有高达的克隆子含有高达33个的点突变。个的点突变。 剖蚁察掌痹税开拿倡氏燕眉豪机柄蛀洛合队惶范当侯得稳末蛛贵肿瑰宁开分子育种PPT课件分子育种PPT课件93部分DNA Shuffling技术的研究成果类 型示 例特 性活性增加倍数潜在应用领域蛋 白绿色荧光蛋白荧光强度45基础研究重组蛋白RecA重组率100基础研究抗 体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药 -内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药卿梯眩冈巡稼啪鄙拂焚馏班门抛辉粘靴窃聪佩跟洪密杰彭刨祥抒踏端密夯分子育种PPT课件分子育种PPT课件94体外随机引物重组体外随机引物重组公蜗臀坚客课榷否滨蓖傲括眶穴僵棺她琶荫鸳尿缚堪惩丫雷汝霍提仇啥郊分子育种PPT课件分子育种PPT课件95其他方式其他方式l外显子改组l酶法体外随机-定位诱变l鬼宪祟撞做之胆硕下耿宿遵梯时围篮镍持刻希酱擒协屋最布拙戎洋榨鹅柳分子育种PPT课件分子育种PPT课件