复方白芍保肝颗复方白芍保肝颗粒标志性成分检粒标志性成分检测方法研究测方法研究专专 业：食品科学与工程业：食品科学与工程学学 号：号：姓姓 名：名：指导教师：指导教师：目目 录录研究的目的及意义研究的目的及意义 主要研究内容主要研究内容 实验结论实验结论 致致 谢谢一、研究目的及意义一、研究目的及意义 本论文是复方白芍保肝颗粒研究的子项目，通过紫外分光光度法对原药材（白芍、葛根、五味子、丹参和甘草）及成品标志性成分进行含量测定。 紫外分光光度法对测定原药材及成品标志性成分含量具有简便、快速、准确、选择性好、分析成本低、操作简便、快速等优点，适用浓度范围广。通过对复方白芍保肝颗粒标志性成分检测方法的研究为制定企业标准、工艺选择、工业生产奠定了理论基础。二、主要研究内容二、主要研究内容原药材的定性、定量分析原药材的定性、定量分析成品中功效成分的提取成品中功效成分的提取成品中功效成分定性、定量分析成品中功效成分定性、定量分析方法学考察方法学考察1. 原药材的定性分析原药材的定性分析1）白）白 芍芍0.5g粉末粉末乙醇乙醇10mL振摇振摇5min滤过，滤液蒸干，滤过，滤液蒸干，1mL乙醇回溶乙醇回溶 另取芍药苷对照品，用乙醇配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验喷喷5%香香草醛草醛三氯甲烷三氯甲烷-乙乙酸乙酯酸乙酯-甲醇甲醇-甲酸甲酸（40:5:10:0.2）图图1 白芍薄层白芍薄层白芍薄层分析，结果见图1。葛葛 根根0.8g粉末粉末甲醇甲醇10mL，放置，放置2h滤过，滤液蒸干，滤过，滤液蒸干，0.5mL甲醇回溶甲醇回溶 另取取葛根素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验三氯甲烷三氯甲烷-甲醇甲醇-水（水（7：2.5： 0.25）紫外光灯紫外光灯（365nm）下检视）下检视葛根薄层分析，结果见图2。图图2 葛根薄层葛根薄层五味子五味子1g粉末粉末三氯甲烷三氯甲烷20mL加热回流加热回流30min滤过，滤液蒸干，滤过，滤液蒸干，1mL三氯甲烷回溶三氯甲烷回溶 另取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验紫外光灯紫外光灯（254nm）下检视）下检视石油醚石油醚-甲酸甲酸乙酯乙酯-甲酸甲酸（15：5：1）五味子薄层分析，结果见图3。图图3 五味子薄层五味子薄层丹丹 参参丹参酮丹参酮A1g粉末粉末乙醚乙醚5mL，振摇，振摇放置放置1h滤过，滤液蒸干，滤过，滤液蒸干，1mL乙酸乙酯回溶乙酸乙酯回溶 另取丹参酮A对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验石油醚石油醚-乙酸乙酸乙酯乙酯（4:1）相同位相同位置显色置显色丹参酮A薄层分析，结果见图4。图图4 丹参酮丹参酮A薄层薄层丹丹 参参丹酚酸丹酚酸B0.2g粉末粉末加热回流加热回流1h75%甲醇甲醇25mL滤过，滤液浓缩至滤过，滤液浓缩至1mL 另取丹酚酸B对照品，加75%甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验紫外光灯紫外光灯（254nm）下检视）下检视甲苯甲苯-三氯甲三氯甲烷烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-甲酸甲酸（2：3：4：0.5：2）丹酚酸B薄层分析，结果见图5。图图5 丹酚酸丹酚酸B薄层薄层甘甘 草草1g粉末粉末乙醚乙醚40mL滤过，弃滤过，弃去醚液去醚液加热回加热回流流1h甲醇甲醇30mL加热回加热回流流1h滤过，滤滤过，滤液蒸干液蒸干残渣加残渣加水水40mL正丁醇提正丁醇提取取3次次合并正丁合并正丁醇液醇液每次每次20mL水洗涤水洗涤3次次正丁醇蒸干，加正丁醇蒸干，加5mL甲醇回溶甲醇回溶弃弃去去水水液液 另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。薄层试验薄层试验喷以喷以10%硫酸乙醇硫酸乙醇溶液，加溶液，加热至斑点热至斑点显色清晰显色清晰乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸甲酸-冰醋冰醋酸酸-水（水（15：1：1：2）甘草薄层试验，结果见图6。图图6 甘草薄层甘草薄层2. 原药材的定量分析原药材的定量分析1).芍药苷芍药苷的提取的提取圆底烧瓶中圆底烧瓶中加加5g粉末粉末85%乙醇乙醇100mL过滤，减过滤，减压浓缩压浓缩加热回加热回流流2h用用25mL石石油醚去脂油醚去脂水饱和正丁醇水饱和正丁醇萃取，浓缩萃取，浓缩留下留下水相水相 用85%乙醇做空白，将配制好的对照品溶液于紫外分光光度计于230nm的紫外光处测定吸收值，并以浓度为横坐标、吸收值为纵坐标绘制标准曲线，见图7。样品的吸光度为0.2494。 如图7，得到芍药苷的标准曲线的回归方程为Y=0.0598X+0.0015 （R2=0.9998），根据样品的吸光度得到芍药苷的含量为3.16%1.6%，符合中华人民共和国药典含量的规定。图图7 苯甲酸对照品的标准曲线苯甲酸对照品的标准曲线 用30%乙醇做空白，将配制好的对照品溶液于紫外分光光度计于250nm的紫外光处测定吸收值，并以浓度为横坐标、吸收值为纵坐标绘制标准曲线，见图8。样品的吸光度为1.5918。2）.葛根素葛根素提取提取 如图8，得到葛根素的标准曲线的回归方程为Y=0.2138X+0.034（R2=0.9992），根据样品的吸光度得到葛根素的含量为3.97%2.4%，符合中华人民共和国药典含量的规定。图图8 葛根素对照品的标准曲线葛根素对照品的标准曲线提取提取3次次/1.5h，浓缩，定容，浓缩，定容25mL容量瓶容量瓶 用甲醇做空白，将配制好的对照品溶液于紫外分光光度计于254nm的紫外光处测定吸收值，并以浓度为横坐标、吸收值为纵坐标绘制标准曲线，图9。样品的吸光度为1.5317。2g粉末置于粉末置于250mL索氏索氏提取器中提取器中氯仿氯仿-甲醇甲醇(1:3)60mL3）.五味子五味子醇甲提取醇甲提取图图9 五味子醇甲对照品的标准曲线五味子醇甲对照品的标准曲线 如图9，得到五味子醇甲的标准曲线的回归方程为Y=35.339X+0.0069（R2=0.9994）根据样品的吸光度得到五味子醇甲的含量为1.79%0.4%，符合中华人民共和国药典含量的规定。3. 成品中功效成分的提取成品中功效成分的提取超声波提取超声波提取芍药苷芍药苷料液比料液比1:20(g/mL),20min,60,75W,乙醇浓度乙醇浓度为为60%。葛根素葛根素料液比料液比1:20(g/mL),1:20(g/mL), 60min,60min, 50,50, 100W,100W,乙醇浓度为乙醇浓度为50%50%。丹参酮丹参酮A料液比料液比1:10(g/mL),40min,60,100W,乙醇浓度为乙醇浓度为85%。丹酚酸丹酚酸B料液比料液比1:8(g/mL),15min,50,50W,以蒸馏以蒸馏水为溶剂。水为溶剂。五味子五味子醇甲醇甲料液比料液比1:25(g/mL),40min,60,60W,以甲醇为以甲醇为溶剂。溶剂。甘草苷甘草苷料液比料液比1:25(g/mL),1:25(g/mL),40min,60,40min,60,60W,60W,以甲醇以甲醇为溶剂。为溶剂。4. 定性分析成品中功效成分定性分析成品中功效成分丹参酮丹参酮A丹酚酸丹酚酸B甘草苷甘草苷5. 定量分析成品中功效成分定量分析成品中功效成分 分别取成品粉末各1g，按芍药苷、葛根素、五味子醇甲超声波提取法提取功效成分的工艺流程图提取，分别稀释250倍、125倍、85倍，各在230nm、251nm、254nm下测定吸光度值，分别为0.1906、1.5780、1.0762。计算公式： W=CVN/M 其中 W 功效成分含量（）； C 标准曲线查得的功效成分浓度(mg/mL) V 样品所取的体积（mL）； N 稀释倍数； M 总质量。6. 方法学考察方法学考察 加标回收率试验加标回收率试验（1）芍药苷芍药苷 表表1 芍药苷回收试验数据表芍药苷回收试验数据表由表1可知，平均回收率为99.56%，RSD=2.57%。（2） 葛根素葛根素 表表2 葛根素回收葛根素回收试验数据表数据表由表2可知，平均回收率为98.33%，RSD=0.34%。（3） 五味子醇甲五味子醇甲 表表3 五味子醇甲回收试验数据表五味子醇甲回收试验数据表由表3可知，平均回收率为98.55%，RSD=0.67%。精密度试验精密度试验（1） 芍药苷芍药苷 表表4 芍药苷精密度试验数据表芍药苷精密度试验数据表 结果表明：精密度试验RSD=0.265%，该方法精密度较高。（2） 葛根素葛根素 表表5 葛根素精密度试验数据表葛根素精密度试验数据表 结果表明：精密度试验RSD=0.349%，该方法精密度较高。（3） 五味子醇甲五味子醇甲 表表6 五味子醇甲精密度试验数据表五味子醇甲精密度试验数据表 结果表明：精密度试验RSD=0.349%，该方法精密度较高。重现性试验重现性试验（1） 芍药苷芍药苷 表表7 芍药苷重现性试验数据表芍药苷重现性试验数据表 结果表明：重现性试验的RSD=0.308%，该方法的重现性较好。（2） 葛根素葛根素 表表8 葛根素重现性试验数据表葛根素重现性试验数据表 结果表明：重现性试验的RSD=0.206%，该方法的重现性较好。（3） 五味子醇甲五味子醇甲 表表9 五味子醇甲重现性试验数据表五味子醇甲重现性试验数据表 结果表明：重现性试验的RSD=0.150%，该方法的重现性较好。 准确度试验准确度试验（1） 芍药苷芍药苷 表表10 芍药苷准确度试验数据表芍药苷准确度试验数据表（2） 葛根素葛根素 表表11 葛根素准确度试验数据表葛根素准确度试验数据表（3） 五味子醇甲五味子醇甲 表表12 五味子醇甲准确度试验数据表五味子醇甲准确度试验数据表三、三、 实验结论实验结论 紫外分光光度法对测定原药材和成品标志性成分具有简便、快速、准确等优点。此方法用于白芍提取液的测定时，相对标准偏差为0.566，加标回收率95.7%102.0%，RSD=2.57%；用于葛根提取液的测定时，相对标准偏差为0.497，加标回收率98.06%98.88%，RSD=0.34%；用于五味子提取液的测定时，相对标准偏差0.623，加标回收率97.89%99.47%，RSD=0.67%。测定每100g成品中含800mg芍药苷，含800mg葛根素，含300mg五味子醇甲。 感谢指导教师张凤清老师，牛春颖学姐和实验室同学的大力帮助，使得实验顺利完成。在张凤清老师的悉心指导下，让我理清了整个实验的流程，使得理论与实践得到了完美的结合。同时也特别感解丛林老师给我们实验所提供的仪器，对我们实验的大力支持，还有牛春颖学姐，学姐一直指导我们实验完成，在学姐的身上我们学到了很多知识，养成了更好的实验室习惯。 向参加本论文评阅、答辩并提出宝贵意见的老师表示深深地谢意！ 谢谢 谢谢