心房纤颤患者血栓前状态及心房纤颤患者血栓前状态及心房电重构的实验研究心房电重构的实验研究在职博士研究生：孙燕淑在职博士研究生：孙燕淑导师：汪丽蕙教授导师：汪丽蕙教授 祁芸芸教授祁芸芸教授北京大学第一医院北京大学第一医院前前 言言前前 言言l心房纤颤是常见的心律失常心房纤颤是常见的心律失常 l房房颤颤并并发发的的以以缺缺血血性性脑脑卒卒中中为为主主的的血血栓栓栓塞严重危害人类健康和生命栓塞严重危害人类健康和生命l血血栓栓前前状状态态（PTSPTS）作作为为一一种种重重要要的的临临床床现象近年来受到国内外学者的广泛关注现象近年来受到国内外学者的广泛关注l及及时时识识别别PTSPTS，确确定定房房颤颤患患者者中中的的高高危危人人群群，将将有有助助于于预预防防和和减减少少栓栓塞塞事事件件的的发发生生本本研研究究提提出出房房颤颤患患者者的的PTS，并并通通过过检检测测房房颤颤患患血血浆浆中中PTS分分子子标标志志物物的的水水平平，探探讨讨房房颤颤患患者者PTS的的形形成成机机制制，寻寻找找评评估估房房颤颤患患者者栓栓塞塞危危险险性性的的新新手手段段，以指导抗凝治疗。以指导抗凝治疗。前前 言言l心心房房纤纤颤颤具具有有自自身身延延续续性性，慢慢性性房房颤颤的的发发生生与与维维持持似似乎乎与与房房颤颤本本身身有有关关。据据此此，Allessie等等提出了房颤引发房颤的观点。提出了房颤引发房颤的观点。l在在房房颤颤的的持持续续过过程程中中，房房颤颤本本身身可可导导致致心心房房电电生理学特性的变化，即心房电重构（生理学特性的变化，即心房电重构（AER。（。（l研研究究表表明明，在在AER中中心心房房肌肌细细胞胞内内钙钙超超负负荷荷起起了重要作用了重要作用l肌肌浆浆网网钙钙泵泵在在调调控控细细胞胞内内Ca2+浓浓度度方方面面起起决决定定作用作用前前 言言 本研究采用本研究采用RTRT-PCR-PCR方法，方法，通过在分通过在分子生物学水平测定心房肌细胞肌浆网子生物学水平测定心房肌细胞肌浆网CaCa2+-ATPase-ATPase的的mRNAmRNA表达，探讨房颤患者表达，探讨房颤患者AERAER的机制，以加深对房颤本质的认识，的机制，以加深对房颤本质的认识，从而使房颤预防和治疗的新的方法成为从而使房颤预防和治疗的新的方法成为可能。可能。 前前 言言第一部分第一部分房颤患者血浆中房颤患者血浆中PTS分子分子标志物的测定标志物的测定 材料与方法材料与方法一、研究对象及分组情况一、研究对象及分组情况1. 房颤组：共29例，男17例，女12例。年龄3978（62.410.5）岁，为我院住院或急诊留观的非瓣膜病Af患者。Af由多次ECG诊断。根据Af性质又分为：1.1 持续房颤组：18例。年龄3979（64.111.0）岁，Af发作持续时间均3个月。1.2 阵发房颤组：11例。年龄4274（59.69.5）岁，均在Af发作期，且发作时间均48小时。2. 对照组：共26例，男16例，女10例。年龄4585（60.911.8）岁，均为窦性心律者。（1） 房颤组与对照组的所有入选对象均除外心绞痛、心肌梗塞，心电图及Holter均未见缺血性改变。无明显高脂血症、无糖尿病、脑梗塞、心功能不全及肿瘤。房颤组有11人服抗凝药，为巴米尔0.1Qd或抵克利得0.25Qd，对照组均未服用抗凝药。一、研究对象及分组情况一、研究对象及分组情况（2）二、主要设备及制剂二、主要设备及制剂 （1 1）1.主要仪器、设备主要仪器、设备流式细胞仪流式细胞仪美国美国Becton-Dickinson公司公司酶标仪酶标仪美国美国光度计光度计美国美国恒温水浴箱恒温水浴箱上海医疗器械厂上海医疗器械厂水平混合器水平混合器江西医疗器械厂江西医疗器械厂50200l八通道加样器八通道加样器100200l，10、25、50、100、500l加样器加样器2.试剂试剂CD61抗体抗体 美国美国Becton-Dickinson公司公司PAC-1抗体抗体 美国美国Becton-Dickinson公司公司鼠鼠IgM 美国美国Becton-Dickinson公司公司FITC荧光染料荧光染料 美国美国Becton-Dickinson公司公司1%多聚甲醛多聚甲醛血栓调节蛋白血栓调节蛋白ELISA法试剂盒法试剂盒 美国美国ADI公司公司牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA） 美国美国Sigma公司公司0.5M H2SO4酶标酶标TAT微孔板微孔板 美国美国D-二聚体二聚体ELISA法测定试剂盒法测定试剂盒 美国美国 二、主要设备及制剂二、主要设备及制剂 （2）三、实验方法三、实验方法1.血血浆浆血血小小板板膜膜糖糖蛋蛋白白(GPIIb/IIIa)水水平平的的测测定定 全血法流式细胞术全血法流式细胞术v标本制备：粗针头取空腹静脉血2.7ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。对照管及测定管各加血5l， 然后各加CD6110l。测定管中加PAC-1 10l，对照管加鼠IgM10l，混匀。避光20分钟。1%多聚甲醛1ml固定。 v测定：用流式细胞仪检测样本。检测结果用特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率，即GPIIb/IIIa阳性血小板的百分数表示。2.血血浆浆血血栓栓调调节节蛋蛋白白（TM）水水平平的的测测定定 ELISA法法 3.血浆凝血酶血浆凝血酶-抗凝血酶抗凝血酶III复合物（复合物（TAT）的测定的测定ELISA法法4.血浆二聚体血浆二聚体D（D-dimer）的测定的测定ELISA法法三、实验方法三、实验方法TM标准曲线标准曲线Y=0.55+0.64lnXTAT标准曲线标准曲线Y=0.18+0.02XD-dimer标准曲线标准曲线Y=0.175+0.002X统计学处理统计学处理 应应用用SPSSForWindows8.0软软件件，数数据据以以均均数数标标准准差差表表示示，各各组组数数据据分分别别进进行行独独立立样样本本t检检验验，方方差差分分析析，单单变变量量相相关关分分析析，回回归归分分析析等等统统计计学学方方法法。取取0.05对照组对照组房颤组房颤组年龄男/女（总计）收缩压(mmHg)舒张压（mmHg） 60.9211.79 16/10（26） 123.2712.24 71.548.69 62.4110.52* 17/12（29） 127.2413.47* 74.489.39*入选者的一般情况入选者的一般情况v 房颤组房颤组GPIIb/IIIa测得值明显高于对照组，差测得值明显高于对照组，差 别具有高度统计学意义别具有高度统计学意义(P0.01)房颤患者血浆房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化的变化对照组对照组(n=26)房颤组房颤组(n=29) GPIIb/IIIa（%）8.356.2923.9814.61*表2. 房颤组与对照组GPIIb/IIIa比较*房颤组与对照组相比P0.01 房颤组与对照组血浆房颤组与对照组血浆GPIIb/IIIa比较比较v持续房颤组的持续房颤组的GPIIb/IIIa水平明显高于阵发房颤水平明显高于阵发房颤组，差别有高度显著性组，差别有高度显著性(P0.01)，房颤患者血浆房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化的变化阵发房颤组阵发房颤组(n=11)持续房颤组持续房颤组(n=18)GPIIb/IIIa（ %）14.228.5129.9514.48*表3. 持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较 *持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01 持续房颤组与阵发房颤组持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较比较各组之间各组之间GPIIb/IIIa比较比较房颤时间与房颤时间与GPIIb/IIIa水平的相关性水平的相关性房颤患者血浆房颤患者血浆TM水平的变化水平的变化 对照组（对照组（n=26）房颤组（房颤组（n=29）TM(ng/ml)）1.050.211.410.32*表4. 房颤组与对照组血浆TM水平比较 *房颤组与对照组相比P0.01与对照组相比，房颤组的血浆TM水平显著升高，两者差别有统计学意义(P0.01) 房颤组与对照组血浆房颤组与对照组血浆TM水平比较水平比较房颤患者血浆房颤患者血浆TM水平的变化水平的变化 对照组（对照组（n=11）阵发房颤组阵发房颤组（n=18）TM(ng/ml)）1.220.201.530.32*表5. 持续房颤组与阵发房颤组血浆TM比较 *持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01持续房颤组的TM水平高于阵发房颤组，差异有显著性(P0.01) 持续房颤组与阵发房颤组持续房颤组与阵发房颤组TM比较比较房颤患者血浆房颤患者血浆TM水平的变化水平的变化 对照组（对照组（n=26）阵发房颤组阵发房颤组（n=11）TM(ng/ml(1.050.211.220.20*表6. 阵发房颤组与对照组血浆TM水平比较 *持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01阵发房颤组的TM水平较对照组高，差别有统计学意义(P0.05) 各组之间血浆各组之间血浆TM水平比较水平比较对照组（对照组（n=26）房颤组房颤组（n=29）TAT（g/L） 8.623.7112.466.66*表7. 房颤组与对照组血浆TAT水平比较 *房颤组与对照组比P0.05房颤患者的血浆TAT水平比对照组有所升高，二者差别有显著性(P0.05持续房颤组与阵发房颤组比较，其TAT值无显著差异(P0.05) 房颤患者血浆房颤患者血浆TAT水平的变化水平的变化对照组对照组(n=26)阵发房颤组阵发房颤组(n=11)TAT（g/L） 8.623.7111.355.21*表9. 阵发房颤组与对照组TAT水平比较*阵发房颤组与对照组比P0.05 阵发房颤组与对照组相比，血浆TAT水平高于对照组，但差异无显著性(P0.05) 房颤患者血浆房颤患者血浆TAT水平的变化水平的变化各组之间血浆各组之间血浆TAT水平比较水平比较# &*# P0.05& P0.05房颤组与对照组相比，血浆D-dimer水平升高，但二者差异无统计学意义(P=0.06)房颤患者血浆房颤患者血浆D-dimer的变化的变化房颤组与对照组血浆房颤组与对照组血浆D-dimer比较比较* P0.05对照组对照组(n=16)持续房颤组持续房颤组(n=17)D-dimer(mg/L)142.44113.10246.44155.74*表11. 持续房颤组与对照组血浆D-dimer水平比较*持续房颤组与对照组相比P0.05持续房颤组血浆D-dimer水平比对照组明显升高，差别具有显著性（P0.05#持续房颤组与阵发房颤组相比P0.05持续房颤组的D-dimer水平较阵发房颤组高，但差别无显著性(P0.05)；阵发房颤组的血浆D-dimer水平较对照组高，但差别亦无显著性(P0.05) 房颤患者血浆房颤患者血浆D-dimer的变化的变化各组之间血浆各组之间血浆D-dimer水平比较水平比较房颤患者心房心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase mRNA的基因表达第二部分材料和方法材料和方法入选者均为我院及安贞医院心外科行换瓣术和冠脉搭桥术的病人，共28例。标本于术中取材于心房或心耳组织。根据有无房颤分为：1. 房颤组：15人，其中男9人，女6人。年龄3567(48.138.07)岁，均为持续房颤患者，且房颤持续时间均3个月。2. 对照组：13人，其中男8人，女5人。年龄3467(51.0811.89)岁，均为窦性心律者，且既往无心律失常病史。两组之间年龄、性别无显著差异（P0.05）。病人来源及分组病人来源及分组高速恒温离心机RC5C 德国Dupont 公司低温离心机J6-B 美国Beckman 公司UV-2100紫外分光光度计 日本岛津公司PE2400 PCR仪 美国激光图像分析仪 瑞典Pharmacia 公司电泳仪 北京科普仪器厂10l、20l、200l及1000l加样器主要设备主要设备异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate） GiBCO公司十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl） 美国Sigma公司-巯基乙醇 美国Sigma公司重蒸酚 岳泰公司逆转录酶（M-MLV） 美国Promega公司dNTPs 美国Promega公司随机引物 美国Promega公司焦碳酸二乙酯（DEPC） 美国Sigma公司Taq聚合酶 华美公司Taq(Buffer E ) 华美公司其余均为国产分析纯试剂、药品试剂、药品实验方法实验方法RT-PCR实验步骤实验步骤反应过程：RNA2g随机引物2l70反应5分钟后立即将管取出并置于冰浴中，加入以下试剂：5转录酶缓冲液5ldNTP(10mM)1.25lM-MLV(200u/l)1l加DEPC水至总体积25l混匀后于37逆转录反应1小时。75反应10分钟使酶灭活。v一步法提取总一步法提取总RNAvRNA逆转录逆转录PCR（1）v引物序列引物序列肌浆网肌浆网Ca2+-ATPase：正义链正义链5TTGCATTGCAGTCTGGATCA反义链反义链5TCCAAAGCAGAGTCATTACA合成片段长度为合成片段长度为477bp-actin（对照）：对照）：正义连正义连5ATCTGGCACCACACCTTC反义链反义链5GCCAGGTCCAGACGCA合成片段长度合成片段长度288bpPCR（2）1.反应体系（反应体系（50l）10聚合酶缓冲液聚合酶缓冲液5ldNTP(10mM)1l引物（引物（-actin、Ca2+-ATPase）上游上游12.5pmol下游下游12.5pmolDNA1lTaq酶酶(3u/l)0.5l加水至总体积加水至总体积50lPCR（3）v反应条件及循环参数反应条件及循环参数945min9430s5730s7245s727min30cyclesvPCR产产物物行行电电泳泳及及染染色色后后采采用用激激光光图图像像分分析析仪仪测测定定条条带积分光密度（带积分光密度（IOD）统计学分析统计学分析 采用SPSS For Windows 8.0统计学软件，数据均以均数标准差表示，各组数据按样本性质分别进行t检验，方差分析等，取P0.05两组一般情况比较两组一般情况比较 对照组（对照组（n=13）房颤组房颤组（n=15）ODCa-ATPase/OD-actin6.633.693.582.16*与对照组相比P0.05 (P=0.13)不同取材部位的标本不同取材部位的标本Ca2+_ATPasemRNA表达量的比较表达量的比较 男性（男性（n=17）女性（女性（n=11）ODCa-ATPase/OD-actin4.913.775.132.56*两组相比P0.05 (P=0.86)不同性别的标本不同性别的标本Ca2+-ATPasemRNA表达量的比较表达量的比较 房颤组与对照组肌浆网房颤组与对照组肌浆网Ca2+ -ATP酶酶mRNA表达量比较表达量比较讨讨 论论 讨讨 论论（1）l房颤患者血浆房颤患者血浆GPIIb/IIIa水平的变化水平的变化l房颤患者血浆房颤患者血浆TM水平的变化水平的变化l房颤患者血浆房颤患者血浆TAT及及D-dimer水平的变化水平的变化l检测房颤患者血浆中检测房颤患者血浆中PTS分子标志物的意义分子标志物的意义讨讨 论论（2）l细胞内细胞内Ca2+超负荷与心房电重构（超负荷与心房电重构（AER）l房颤患者肌浆网房颤患者肌浆网Ca2+-ATP酶酶mRNA水平变化水平变化与细胞内与细胞内Ca2+超负荷的关系超负荷的关系l房颤的离子通道重构及其分子机制房颤的离子通道重构及其分子机制l细胞内细胞内Ca2+超负荷对房颤离子通道重构的影响超负荷对房颤离子通道重构的影响结结 论论结结 论论（1）l房颤可引起内皮细胞功能的损伤和血小板激活，血小房颤可引起内皮细胞功能的损伤和血小板激活，血小板激活程度与房颤的持续时间呈正相关板激活程度与房颤的持续时间呈正相关l房颤可激活全身凝血系统，并引起继发纤溶亢进房颤可激活全身凝血系统，并引起继发纤溶亢进l房颤患者处于血栓前状态（房颤患者处于血栓前状态（PTS）l检测房颤患者血浆中检测房颤患者血浆中PTS分子标志物水平可成为评估分子标志物水平可成为评估房颤患者栓塞危险性的手段之一。这对指导抗凝治疗，房颤患者栓塞危险性的手段之一。这对指导抗凝治疗，减少栓塞事件的发生有重要意义减少栓塞事件的发生有重要意义结结 论论（2）l持续房颤患者心房心肌细胞肌浆网持续房颤患者心房心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase的的mRNA表达下调，导致肌浆网钙泵对表达下调，导致肌浆网钙泵对Ca2+的摄取减少。的摄取减少。这加重了房颤患者细胞内这加重了房颤患者细胞内Ca2+超负荷超负荷 l细胞内细胞内Ca2+超负荷及与其相关的膜离子通道重构是心超负荷及与其相关的膜离子通道重构是心房电重构（房电重构（AER）的主要机制的主要机制 致 谢