植物学报植物学报 磷脂酶磷脂酶D参与植物的低温驯化过程参与植物的低温驯化过程 9/5/20241摘要摘要对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶D (PLD)基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后, 比较2种基因型植株的抗冻性。结果发现, 经低温驯化的PLD敲除突变体的抗冻性明显低于野生型, 而未经低温驯化的PLD敲除突变体与野生型的抗冻性没有显著差异, 表明PLD参与植物的低温驯化过程。对PLD的作用途径进行分析, 发现PLD在低温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节, 对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用, 但是参与低温信号转导物质ABA诱导抗冻性的过程。 关键词 低温驯化, 磷脂酶D, 信号转导 9/5/20242磷脂酶Ds(phospholipase Ds, PLDs)是在植物中广泛分布的酶类。它们能够水解磷脂产生磷脂酸(PA)和1个自由头基。在拟南芥中已经确认了12个PLD基因, 即PLD(3)、(2)、(3)、和PLD(2)。PLD在衰老叶片以及脱水、高盐等环境胁迫下有高的表达量。它的激活除了需要Ca 外, 还需要油酸, 激活后优先水解的底物磷脂是磷脂酰乙醇胺。9/5/20243近年来, 人们用突变体开展的研究揭示出PLD参与水分胁迫、氧化胁迫和冰冻伤害等多种反应过程。2001发现PLD及其产物PA参与脱水胁迫的信号转导。2003发现, PLD与其产物PA降低拟南芥中H2O2诱导的细胞程序化死亡, PLD基因敲除植株对胁迫更为敏感。2004发现PLD基因被敲除的拟南芥抗冻性下降, 而PLD超表达的拟南芥抗冻性则增强, 表明PLD对植物的抗冻性起正调节作用。9/5/20244研究还揭示出PLD在植物受胁迫后恢复过程中涉及大量的细胞骨架重组和膜运输过程, PLD与微管骨架结合, 它的激活是启动细胞骨架重组的关键步骤。2008还发现在冻害后的恢复阶段, PLD的激活减缓了质体与非质体中脂质的大量降解, 从而提高了植物的抗冻性。9/5/20245冻害是主要的环境胁迫因素之一。 低温驯化低温驯化是植物感受、传递低温信号, 引起低温适应性反应从而提高抗冻性的过程。低温驯化过程中植物体内发生许多生理与生化变化.渗透调节物质大量积累, 细胞渗透势降低, 以防止冻害胁迫下胞间结冰引起胞内失水从而对原生质造成脱水胁迫;抗氧化酶活性增强, 抗氧化物质含量增加, 以清除活性氧对生物膜系统的氧化胁迫, 增强细胞膜的稳定性。内源脱落酸水平增加, 参与植物的低温信号转导过程。9/5/20246低温驯化过程还包含复杂的基因表达变化。本研究证实PLD是参与植物低温驯化过程的基因, 并从抗氧化酶活性调节、渗透调节和ABA信号转导过程等角度探讨了PLD基因参与低温驯化过程的途径。9/5/202471 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料实验材料 实验材料为哥伦比亚生态型的拟南芥野生拟南芥野生型和型和PLD基因敲除的纯合突变体。基因敲除的纯合突变体。将拟南芥种子播于MS培养基中, 在4C条件下春化处理2天后, 放于光照培养箱中正常培养。9/5/202481.2 方法方法 1.2.1 低温驯化与冻害胁迫处理 将培养24天的拟南芥植株放于生长箱中进行低温驯化。驯化条件: 温度4C, 光照强度30 molm s , 培养3天。利用人工霜箱进行冻害胁迫处理,调查存活率。9/5/202491.2.2 离子渗漏率的测定离子渗漏率的测定 按照Welti等的方法测定离子渗漏率。在冻害胁迫处理后, 将植株取出, 置于4C下保存24小时。然后, 取其叶片, 加入去离子水, 在23C水浴中轻微振荡1小时, 测定初电导值。再将含有叶片的溶液在100C下煮沸10分钟, 冷却至23C, 测定总电导值。离子渗漏率初电导值/总电导值100%。 9/5/2024101.2.3 ABA处理与抗冻性鉴定处理与抗冻性鉴定 ABA处理采用根施方法。对培养22天的拟南芥野生型与突变体植株, 用30 molL 的ABA溶液浇透培养基质。处理4天后鉴定植株的抗冻性: 将处理与对照植株置于人工霜箱中, 快速降温至4C(10分钟内从室温降至4C), 再以3C/小时的速率降温至2C(保持3小时, 并喷少量的水防止出现过冷却状态)。然后以2C/小时的速率降温至8C、10C、12C、14C和16C, 并分别保持1小时。将不同温度下处理后的植株取出, 置于4C培养箱中解冻24小时后, 测定处理和对照植株的离子渗漏率。之后, 置于正常生长条件下培养, 10天后照相记录。 9/5/2024111.2.4 渗透调节物质的测定渗透调节物质的测定 脯氨酸含量的测定采用酸性水合茚三酮比色法; 用蒽酮比色法测定可溶性糖含量。 9/5/2024121.2.5 抗氧化酶活性的测定抗氧化酶活性的测定 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的测定分别采用氮蓝四唑法、比色法和愈创木酚法。9/5/2024132 结果与讨论结果与讨论 2.1 PLD参与植物的低温驯化过程参与植物的低温驯化过程 在4C下驯化3天后进行冻害胁迫处理, PLD基因敲除植株的抗冻性明显低于野生型(图1A)。而未经低温驯化的PLD基因敲除植株与野生型之间抗冻性没有显著差异(图2)。PLD基因的缺失影响了拟南芥植株的低温驯化, 表明PLD参与植物的低温驯化过程。离子渗漏率是反映细胞膜稳定性的重要指标。低温驯化后进行冻害胁迫处理, PLD基因敲除植株与野生型之间离子渗漏率没有显著差异(图1B), 因此推测PLD在低温驯化中可能不参与细胞膜稳定性的调节。9/5/2024149/5/2024159/5/2024162.2 PLD不参与低温驯化过程中抗氧化酶活性不参与低温驯化过程中抗氧化酶活性的调节的调节 经低温驯化后PLD敲除植株的SOD、CAT和POD 3种抗氧化酶的活性与野生型相比没有明显差异(图3AC), 表明PLD在低温驯化过程中没有参与抗氧化系统的调节。膜保护酶的活性与细胞膜稳定性密切相关, 逆境胁迫下抗氧化酶活性越高, 膜稳定性越好。PLD不参与抗氧化酶活性的调节, 这一结果支持PLD不参与膜稳定性调节的推测。 9/5/2024179/5/2024182.3 PLD在低温驯化过程中负调节脯氨酸与可在低温驯化过程中负调节脯氨酸与可溶性糖的积累溶性糖的积累 低温驯化过程中, 植物大量积累脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质以降低细胞渗透势。然而, 在低温驯化3天后, PLD基因敲除植株的脯氨酸和可溶性糖含量却高于野生型, 且分别达到极显著和显著水平(图4A, B)。结果表明, PLD基因不是通过调控脯氨酸和可溶性糖2种渗透调节物质的积累这一途径来参与植物低温驯化过程的。9/5/2024199/5/2024202.4 PLD参与参与ABA诱导植物抗冻性诱导植物抗冻性的过程的过程 植物经过低温驯化, 内源内源ABAABA水平水平明显增加（吴耀荣和谢旗，2006）, 一些低温诱导基因表达增强, 抗冻性大幅度提高。外源ABA处理能在常温下诱导许多低温诱导基因的表达, 提高植物的抗冻性。另外, ABA合成缺陷突变体(aba-1)与ABA不敏感突变体(abi-1)经低温驯化, 都不能提高抗冻性。这些研究结果证明, ABA作为信号物质参与植物的低温驯化过程。本研究证明本研究证明PLDPLD也参与植物的低温驯化过程也参与植物的低温驯化过程, , 那那么么PLDPLD是否参与是否参与ABAABA诱导植物抗冻性的过程呢？诱导植物抗冻性的过程呢？9/5/202421 用ABA处理拟南芥后再进行冻害胁迫处理, PLD基因敲除植株的抗冻性明显低于野生型(图5A)。因为ABA处理能够在常温下提高植物的抗冻性, 这种差异说明PLD基因的缺失影响了ABA诱导植株抗冻性的过程, 即表明PLD参与ABA诱导植株抗冻性的信号转导过程。 用ABA处理后PLD基因敲除植株和野生型之间离子渗漏率亦无显著差异(图5B)。9/5/2024229/5/202423 PLD参与植物的低温驯化过程, 而且参与低温胁迫下ABA信号的转导过程。近期的实验还揭示了PLD家族的其它成员在植物低温胁迫反应中的作用。PLD也参与低温驯化过程, 但是与PLD不同, 它不参与ABA信号转导过程冻性。9/5/202424如前所述, 低温驯化涉及多种复杂的细胞过程, 包括渗透调节、受抗氧化系统活性和细胞膜脂质组成变化影响的细胞膜稳定性的调节、以及内源ABA参与的低温信号转导过程等。然而, PLD在低温驯化过程中既不参与渗透调节, 也不参与调控抗氧化酶活性和细胞膜磷脂组成, 即不参与细胞膜稳定性的调节。但是PLD参与ABA诱导抗冻性的信号转导过程。Zhang等(2004)的研究揭示了PLD介导ABA诱导气孔关闭的作用机制, PLD通过产物PA与下游靶物ABI1(一种磷酸酶2c)相互作用调控气孔的关闭。9/5/202425在低温胁迫下, PLD可能通过产物PA参与ABA诱导抗冻性的过程, 但是尚不清楚PLD-PA的下游靶物。因此查明ABA介导的低温信号转导途径中PLD-PA的下游靶物, 对于揭示低温信号转导途径和低温驯化机制有重要意义。9/5/2024269/5/202427