李莉李莉醋酸纤维薄膜电泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAMEhttp:/www.shsmu.edu.cn/讲课内容讲课内容 醋酸纤维素醋酸纤维素 1 醋酸纤维薄膜的特点醋酸纤维薄膜的特点 2 影响电泳结果的因素影响电泳结果的因素 3 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 4上海交通大学医学院上海交通大学医学院一、醋酸纤维素（一、醋酸纤维素（一、醋酸纤维素（一、醋酸纤维素（Cellulose acetateCellulose acetateCellulose acetateCellulose acetate ） 是是是是纤纤纤纤维维维维素素素素醋醋醋醋酸酸酸酸酯酯酯酯( ( ( (acetateacetateacetateacetate esteresteresterester of of of of cellulosecellulosecellulosecellulose )，由由由由纤纤纤纤维维维维素素素素的的的的羟羟羟羟基基基基进进进进行行行行乙乙乙乙酰酰酰酰化化化化后后后后制制制制得得得得，将将将将它它它它溶溶溶溶于于于于有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂涂涂涂涂抹抹抹抹成成成成均均均均匀匀匀匀的的的的薄薄薄薄膜膜膜膜，待待待待有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂挥挥挥挥发发发发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜 厚度：厚度：厚度：厚度：0.150.150.150.15mm mm mm mm 上海交通大学医学院上海交通大学医学院Magnification of Cellulose Acetate filter 上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 醋酸纤维素醋酸纤维素 1 醋酸纤维薄膜的特点醋酸纤维薄膜的特点 2 影响电泳结果的因素影响电泳结果的因素 3 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 4上海交通大学医学院上海交通大学医学院二、二、醋酸纤维薄膜的特点醋酸纤维薄膜的特点CharacteristicsCharacteristicsCharacteristicsCharacteristics of of Cellulose Acetate MembraneCellulose Acetate MembraneCellulose Acetate MembraneCellulose Acetate Membrane 1.1.1.1.吸附作用小吸附作用小2.电渗电渗( (electroosmosiselectroosmosis) )作用小作用小3.需加样量少需加样量少4.亲水性较小亲水性较小 上海交通大学医学院上海交通大学医学院血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点MolecularMolecularMolecularMolecular weight and weight and weight and weight and isoelectricisoelectricisoelectricisoelectric point of serum point of serum point of serum point of serum proteinsproteinsproteinsproteinsserumproteinserumproteinMWMW pIpIAlbAlb 1 1 2 2 66248662481300001300002000002000001300000130000015000001500000 4.864.865.025.025.025.025.125.126.86.87.37.3 上海交通大学医学院上海交通大学医学院Amido black 10B Amido black 10B 上海交通大学医学院上海交通大学医学院氨基黑氨基黑1010B B染色洗脱法结果染色洗脱法结果 蛋白组分蛋白组分蛋白组分蛋白组分 平均值平均值平均值平均值（% % % %） 参考范围参考范围参考范围参考范围 （% % % %）AlbAlbAlbAlb 1 1 1 1 2 2 2 2 65.5965.5965.5965.593.123.123.123.126.166.166.166.169.099.099.099.0917.4017.4017.4017.4057.4557.4557.4557.4571.7371.7371.7371.731.761.761.761.764.484.484.484.484.044.044.044.048.288.288.288.286.796.796.796.7911.3911.3911.3911.3911.8511.8511.8511.8522.9722.9722.9722.97上海交通大学医学院上海交通大学医学院Ponceau S Ponceau S 上海交通大学医学院上海交通大学医学院丽春红丽春红S S染色扫描法结果染色扫描法结果蛋白组分蛋白组分蛋白组分蛋白组分 g/Lg/Lg/Lg/L 占蛋白百分数占蛋白百分数占蛋白百分数占蛋白百分数（% % % %） AlbAlbAlbAlb 35353535525252525757575768686868 1 1 1 1 1.01.01.01.04.04.04.04.01.01.01.01.05.75.75.75.7 2 2 2 2 4.04.04.04.08.08.08.08.04.94.94.94.911.211.211.211.2 5.05.05.05.010.010.010.010.07.07.07.07.013131313 6.06.06.06.013.013.013.013.09.89.89.89.818.218.218.218.2上海交通大学医学院上海交通大学医学院Schematic representation of a protein electrophoresis 上海交通大学医学院上海交通大学医学院几种疾病的蛋白电泳变化几种疾病的蛋白电泳变化几种疾病的蛋白电泳变化几种疾病的蛋白电泳变化AbnormalAbnormalAbnormalAbnormal serum protein electrophoresis serum protein electrophoresis serum protein electrophoresis serum protein electrophoresis 病名病名病名病名 AlbAlbAlbAlb 1 1 1 1 2 2 2 2 肾病肾病肾病肾病肝硬化肝硬化肝硬化肝硬化原发性肝癌原发性肝癌原发性肝癌原发性肝癌多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤慢性炎症慢性炎症慢性炎症慢性炎症无丙种球蛋白症无丙种球蛋白症无丙种球蛋白症无丙种球蛋白症双白蛋白血症双白蛋白血症双白蛋白血症双白蛋白血症 AFPAFPAFPAFP - - - - 桥桥桥桥 上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院 - - - - 桥桥桥桥上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院双白蛋白血症双白蛋白血症双白蛋白血症双白蛋白血症上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 醋酸纤维素醋酸纤维素 1 醋酸纤维薄膜的特点醋酸纤维薄膜的特点 2 影响电泳结果的因素影响电泳结果的因素 3 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 4上海交通大学医学院上海交通大学医学院三、影响电泳结果的因素三、影响电泳结果的因素 FactorsFactors affecting results affecting results1.1. 电泳图谱不齐电泳图谱不齐点样时血清点加不均匀点样时血清点加不均匀薄膜局部干燥薄膜局部干燥电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少缓冲液变质缓冲液变质电泳时薄膜位置不正电泳时薄膜位置不正, ,与电流方向不平行与电流方向不平行 上海交通大学医学院上海交通大学医学院2.2. 电泳图谱分离不清电泳图谱分离不清标本加量过多标本加量过多电流过低电流过低薄膜结构过分致密，透水性差薄膜结构过分致密，透水性差薄膜表面干燥薄膜表面干燥上海交通大学医学院上海交通大学医学院3.3. 电泳速度慢电泳速度慢电流过低电流过低供给薄膜的液量不足供给薄膜的液量不足电泳时温度过低电泳时温度过低缓冲液离子强度过高缓冲液离子强度过高薄膜中杂质多薄膜中杂质多上海交通大学医学院上海交通大学医学院4.4.4.4. 白蛋白（白蛋白（白蛋白（白蛋白（Albumin)Albumin)Albumin)Albumin)区带中间部分不着色，染色不足区带中间部分不着色，染色不足区带中间部分不着色，染色不足区带中间部分不着色，染色不足可能为染料使用过久或加血清可能为染料使用过久或加血清可能为染料使用过久或加血清可能为染料使用过久或加血清(Serum)(Serum)(Serum)(Serum)过多过多过多过多5.5.5.5.球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白( ( ( (-globin-globin-globin-globin) ) ) )向反方向移动向反方向移动向反方向移动向反方向移动主要因为电渗（主要因为电渗（主要因为电渗（主要因为电渗（ electro-osmosiselectro-osmosiselectro-osmosiselectro-osmosis）现象）现象）现象）现象可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 醋酸纤维素醋酸纤维素 1 醋酸纤维薄膜的特点醋酸纤维薄膜的特点 2 影响电泳结果的因素影响电泳结果的因素 3 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 4上海交通大学医学院上海交通大学医学院血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 Separate serum protein in cellulose Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresisacetate membrane electrophoresis http:/www.shsmu.edu.cn/ 原原原原理理理理 CAMECAMECAMECAME是是是是以以以以醋醋醋醋纤纤纤纤膜膜膜膜（CAMCAMCAMCAM）作作作作支支支支持持持持物物物物的的的的一一一一种种种种区区区区带电泳技术。带电泳技术。带电泳技术。带电泳技术。 将将将将血血血血清清清清样样样样品品品品点点点点样样样样于于于于醋醋醋醋纤纤纤纤膜膜膜膜上上上上，在在在在pH8.6pH8.6pH8.6pH8.6的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中电电电电泳泳泳泳时时时时，血血血血清清清清蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质均均均均带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷移移移移向向向向正正正正极极极极。由由由由于于于于血血血血清清清清中中中中各各各各蛋蛋蛋蛋白白白白组组组组分分分分等等等等电电电电点点点点不不不不同同同同而而而而致致致致表表表表面面面面净净净净电电电电荷荷荷荷量量量量不不不不等等等等，加加加加之之之之分分分分子子子子大大大大小小小小和和和和形形形形状状状状各各各各异异异异，因因因因而而而而电电电电泳泳泳泳迁移率不同，彼此得以分离。迁移率不同，彼此得以分离。迁移率不同，彼此得以分离。迁移率不同，彼此得以分离。 Ions Ions Ions Ions have have have have different different different different migration migration migration migration rates rates rates rates depending depending depending depending on on on on their their their their total total total total charge, charge, charge, charge, size, size, size, size, and and and and shape, and can therefore be separated.shape, and can therefore be separated.shape, and can therefore be separated.shape, and can therefore be separated. 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 EQ EQ EQ EQ V = V = V = V = 6 6 6 6 r r r r 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 器材和试剂器材和试剂器材和试剂器材和试剂 1.1.1.1.器材器材器材器材（1 1 1 1）醋酸纤维薄膜（醋酸纤维薄膜（醋酸纤维薄膜（醋酸纤维薄膜（8 8 8 8 2 2 2 2mmmmmmmm）（2 2 2 2）点样器点样器点样器点样器（3 3 3 3）染色皿，漂洗器，镊子染色皿，漂洗器，镊子染色皿，漂洗器，镊子染色皿，漂洗器，镊子（4 4 4 4）722722722722型分光光度计型分光光度计型分光光度计型分光光度计（5 5 5 5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽2.2.2.2.试剂试剂试剂试剂（1 1 1 1）巴比妥缓冲液（）巴比妥缓冲液（）巴比妥缓冲液（）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06pH8.6 I=0.06pH8.6 I=0.06pH8.6 I=0.06）（2 2 2 2）氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑10101010B B B B染色液染色液染色液染色液（3 3 3 3）漂洗液：）漂洗液：）漂洗液：）漂洗液：95%95%95%95%乙醇、冰醋酸、乙醇、冰醋酸、乙醇、冰醋酸、乙醇、冰醋酸、H H H H2 2 2 2O O O O（4 4 4 4）洗脱液：洗脱液：洗脱液：洗脱液：0.40.40.40.4mol/L mol/L mol/L mol/L NaOHNaOHNaOHNaOH上海交通大学医学院上海交通大学医学院 操作操作操作操作 1.1.1.1.将将将将电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽置置置置于于于于水水水水平平平平平平平平台台台台上上上上。将将将将缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液注注注注入入入入电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽中两边的电极槽缓冲液的中两边的电极槽缓冲液的中两边的电极槽缓冲液的中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上高度要在同一点平面上高度要在同一点平面上高度要在同一点平面上2.2.2.2.在在在在醋醋醋醋纤纤纤纤膜膜膜膜一一一一端端端端欲欲欲欲点点点点样样样样处处处处作作作作好好好好标标标标记记记记，然然然然后后后后将将将将薄薄薄薄膜膜膜膜放放放放进进进进缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中，湿湿湿湿润润润润速速速速度度度度按按按按膜膜膜膜吸吸吸吸收收收收缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的快快快快慢慢慢慢而而而而定，应让其定，应让其定，应让其定，应让其自然浸润自然浸润自然浸润自然浸润3 3 3 3. . . .将将将将充充充充分分分分浸浸浸浸透透透透（指指指指膜膜膜膜上上上上没没没没有有有有白白白白色色色色斑斑斑斑痕痕痕痕）的的的的薄薄薄薄膜膜膜膜取取取取出出出出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液用滤纸吸去膜上过多的缓冲液用滤纸吸去膜上过多的缓冲液用滤纸吸去膜上过多的缓冲液4 4 4 4. . . .用用用用加加加加样样样样器器器器蘸蘸蘸蘸取取取取血血血血清清清清（约约约约5 5 5 5ulululul）, , , ,垂垂垂垂直直直直印印印印在在在在CAMCAMCAMCAM粗粗粗粗糙糙糙糙面面面面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器上海交通大学医学院上海交通大学医学院醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图上海交通大学医学院上海交通大学医学院5 5 5 5电泳电泳电泳电泳( ( ( (Electrophoresis)Electrophoresis)Electrophoresis)Electrophoresis)（1 1 1 1）加加加加样样样样后后后后，将将将将薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条架架架架于于于于支支支支架架架架两两两两端端端端，无无无无光光光光泽泽泽泽面面面面朝朝朝朝下下下下（点点点点样样样样面面面面），点点点点样样样样侧侧侧侧置置置置于于于于阴阴阴阴极极极极端端端端，膜膜膜膜两两两两侧侧侧侧分分分分别别别别塔塔塔塔上上上上纱纱纱纱布布布布，纱纱纱纱布布布布一一一一端端端端垂垂垂垂入入入入缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中。薄薄薄薄膜膜膜膜应应应应位位位位正正正正，平直无弯曲，加上槽盖平衡平直无弯曲，加上槽盖平衡平直无弯曲，加上槽盖平衡平直无弯曲，加上槽盖平衡5 5 5 5分钟后通电电泳分钟后通电电泳分钟后通电电泳分钟后通电电泳（2 2 2 2）正正正正确确确确连连连连接接接接电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽与与与与整整整整流流流流器器器器对对对对应应应应的的的的正正正正负负负负极极极极。开开开开启启启启电电电电源源源源通通通通电电电电。电电电电压压压压10101010 15151515V/cmV/cmV/cmV/cm膜膜膜膜总总总总宽宽宽宽。电电电电泳泳泳泳40404040 60606060分分分分钟，泳动距离约达钟，泳动距离约达钟，泳动距离约达钟，泳动距离约达3.53.53.53.5 4 4 4 4cmcmcmcm时即可断电时即可断电时即可断电时即可断电上海交通大学医学院上海交通大学医学院醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图上海交通大学医学院上海交通大学医学院6.6.6.6.染色染色染色染色(Stain)(Stain)(Stain)(Stain) 电电电电泳泳泳泳完完完完毕毕毕毕后后后后断断断断电电电电，用用用用镊镊镊镊子子子子取取取取出出出出薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条投投投投入入入入染染染染液液液液5 5 5 5 10101010分分分分钟钟钟钟，染染染染色色色色过过过过程程程程中中中中不不不不时时时时轻轻轻轻轻轻轻轻晃晃晃晃动动动动染染染染色色色色皿皿皿皿，使使使使染色充分染色充分染色充分染色充分7 7 7 7漂洗漂洗漂洗漂洗(Wash)(Wash)(Wash)(Wash) 从从从从染染染染液液液液中中中中取取取取出出出出薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条并并并并尽尽尽尽量量量量沥沥沥沥去去去去染染染染液液液液，投投投投入入入入漂漂漂漂洗洗洗洗皿皿皿皿中中中中反反反反复复复复漂漂漂漂洗洗洗洗，直直直直至至至至背背背背景景景景漂漂漂漂尽尽尽尽为为为为止止止止。此此此此时时时时清清清清晰晰晰晰可见可见可见可见5 5 5 5条色带，待干条色带，待干条色带，待干条色带，待干 上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院8.8.8.8.定量定量定量定量( ( ( (QuantifyQuantifyQuantifyQuantify) ) ) )（1 1 1 1）洗洗洗洗脱脱脱脱比比比比色色色色：将将将将各各各各蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质区区区区带带带带仔仔仔仔细细细细剪剪剪剪下下下下，分分分分置置置置各各各各试试试试管管管管中中中中，另另另另从从从从空空空空白白白白背背背背景景景景剪剪剪剪块块块块平平平平均均均均大大大大小小小小的的的的膜膜膜膜条条条条置置置置于于于于空空空空白白白白管管管管中中中中。各各各各管管管管加加加加入入入入0.40.40.40.4mol/l mol/l mol/l mol/l NaOHNaOHNaOHNaOH 4ml,4ml,4ml,4ml,于于于于37373737水水水水浴浴浴浴20202020分分分分钟钟钟钟（不不不不时时时时振振振振荡荡荡荡），待待待待颜颜颜颜色色色色脱脱脱脱净净净净即即即即用用用用波波波波长长长长620620620620nmnmnmnm比色，以空白管调零读取各管吸光度。比色，以空白管调零读取各管吸光度。比色，以空白管调零读取各管吸光度。比色，以空白管调零读取各管吸光度。（2 2 2 2）计算）计算）计算）计算 吸光度总和（吸光度总和（吸光度总和（吸光度总和（T T T T） =A+ =A+ =A+ =A+1 1 1 1+2 2 2 2+（吸光度）吸光度）吸光度）吸光度） 上海交通大学医学院上海交通大学医学院 血清蛋白组分的相对百分数：血清蛋白组分的相对百分数：血清蛋白组分的相对百分数：血清蛋白组分的相对百分数：A%=A/TA%=A/TA%=A/TA%=A/T 100% 100% 100% 100% 1 1 1 1%=%=%=%=1 1 1 1/T/T/T/T 100% 100% 100% 100% 2 2 2 2%=%=%=%=2 2 2 2/T/T/T/T 100%100%100%100%=/T%=/T%=/T%=/T 100% 100% 100% 100% %=/T%=/T%=/T%=/T 100%100%100%100%上海交通大学医学院上海交通大学医学院思思 考考 题题v问答题问答题问答题问答题1.1.1.1.CAMECAMECAMECAME的基本原理是什么？的基本原理是什么？的基本原理是什么？的基本原理是什么？2.2.2.2.CAMECAMECAMECAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？上海交通大学医学院上海交通大学医学院