细胞化学技术细胞化学技术 组织化学技术组织化学技术: : 应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信息。息。 细胞化学技术细胞化学技术: : 应用组织化学技术于游离细胞的样品应用组织化学技术于游离细胞的样品( (如细胞涂如细胞涂片片) )，则称细胞化学技术。，则称细胞化学技术。 一一 组织组织细胞细胞化学染色化学染色 组织组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下, , 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、生生理理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的意义。意义。 组织细胞染色的范围一般可分为组织细胞染色的范围一般可分为：蛋白质类蛋白质类（氨基氨基酸酸) )、核酸类、多糖类、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类脂类、盐类或金属类，采用的采用的方法通常为化学结合物理溶解显示及酶方法通常为化学结合物理溶解显示及酶- -底物反应。底物反应。 组织组织细胞化学染色方法分门别类有许多种细胞化学染色方法分门别类有许多种, ,结果的显结果的显示也不尽相同示也不尽相同, ,有时即使是检测同一物质有时即使是检测同一物质, ,因采取的方法因采取的方法不同不同, ,其结果有可能存在一定的偏差其结果有可能存在一定的偏差, ,另一些是由于方法另一些是由于方法学学上上本身的缺陷本身的缺陷, ,其结果也可能产生误差其结果也可能产生误差, ,所以我们应注所以我们应注意选择结果稳定意选择结果稳定、方法简便方法简便( (操作步骤越繁复操作步骤越繁复, ,结果出现结果出现误差的可能性就越多误差的可能性就越多),),阳性显示明显的细胞化学染色方阳性显示明显的细胞化学染色方法如果条件允许可与细胞免疫化学法如果条件允许可与细胞免疫化学、细胞遗传学、分子细胞遗传学、分子生物学等相结合生物学等相结合, ,使细胞化学染色发挥最大、最准确的使细胞化学染色发挥最大、最准确的作用。作用。常用组织细胞化学染色常用组织细胞化学染色过氧化物酶过氧化物酶 peroxidaseperoxidaseperoxidaseperoxidase ,(,(POPOPOPOX X X X) )1.1.原理原理 血细胞中的血细胞中的POXPOX能分解能分解H H2 2O O2 2而释放出新生态氧，后者而释放出新生态氧，后者可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。2.2.正常阳性细胞正常阳性细胞: : . . 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 . . 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。阳性。 . . 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。单核细胞呈单核细胞呈弥散弱阳性弥散弱阳性中性粒细胞呈中性粒细胞呈粗颗粒强阳性粗颗粒强阳性 过碘酸一雪夫反应 periodic acid Schiff reaction ,PASperiodic acid Schiff reaction ,PAS 此试验中能被过碘酸此试验中能被过碘酸- -雪夫反应呈阳性的多糖类物雪夫反应呈阳性的多糖类物质有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂、还包括一些磷脂质有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂、还包括一些磷脂类物质等，因此类物质等，因此PASPAS阳性不能简单地就表明有糖原的存阳性不能简单地就表明有糖原的存在，只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将在，只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将PASPAS阳性认同于糖原。阳性认同于糖原。 PASPAS染色虽然不完全代表糖原，但在血液系统疾病特染色虽然不完全代表糖原，但在血液系统疾病特别在各类型急性白血病中却有相当大的应用价值。别在各类型急性白血病中却有相当大的应用价值。PASPAS染色若结合其他化学染色和细胞免疫表型检测可对部染色若结合其他化学染色和细胞免疫表型检测可对部分疾病的诊断和鉴别诊断提供一定的价值。分疾病的诊断和鉴别诊断提供一定的价值。1.原 理 过碘酸氧化多糖类中的乙二醇使之成为双醛基，后过碘酸氧化多糖类中的乙二醇使之成为双醛基，后者与无色品红结合形成紫红色化合物。定位于含多糖者与无色品红结合形成紫红色化合物。定位于含多糖类的细胞质内。多糖类物质含量决定了色泽的深浅。类的细胞质内。多糖类物质含量决定了色泽的深浅。2.参考范围:（正常阳性细胞） 粒细胞系粒细胞系原粒细胞多呈阴性原粒细胞多呈阴性, ,通常随细胞不断成通常随细胞不断成 熟阳性反应由弱渐强熟阳性反应由弱渐强, ,至细胞完全成熟后达到最大至细胞完全成熟后达到最大 强度。其中中性粒细胞呈胞浆内弥散状红色阳性强度。其中中性粒细胞呈胞浆内弥散状红色阳性, , 嗜酸粒细胞嗜酸粒细胞S S颗粒之间的胞浆呈红色阳性颗粒之间的胞浆呈红色阳性, ,嗜嗜碱碱粒粒 细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。 红细胞系红细胞系 幼红细胞及红细胞均呈阴性。幼红细胞及红细胞均呈阴性。 巨核细胞系巨核细胞系 从原始阶段到血小板均呈阳性。从原始阶段到血小板均呈阳性。 淋巴细胞系淋巴细胞系 大多数淋巴细胞呈阴性，小部分大多数淋巴细胞呈阴性，小部分 淋巴细胞成阳性。淋巴细胞成阳性。 单核细胞系单核细胞系 原始阶段呈阴性，幼稚阶段以后原始阶段呈阴性，幼稚阶段以后 可见浆内呈弥散细小颗粒状红色可见浆内呈弥散细小颗粒状红色阳阳性。性。 浆细胞系浆细胞系 大多数浆细胞呈阴性，小部分浆细大多数浆细胞呈阴性，小部分浆细 胞呈阳性。胞呈阳性。 中性粒细胞碱性磷酸酶neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)1.原理 细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚，使细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚，使之释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。之释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。定位于酶活性所在处。定位于酶活性所在处。2.参考范围 ： 中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2%2%56%, 56%, 积分积分 4 480 80 分分 /10/100 0个中性粒细胞个中性粒细胞NAP染色结果染色结果 (+) (+)(+) (+) 固紫固紫- - B二二 组织细胞免疫化学组织细胞免疫化学标记技术标记技术 组织细胞免疫化学是细胞化学吸收了免疫学的理论和技术而发展起来的一门重要方法学.在现代医学领域中被广泛应用.尤其在组织细胞学中该技术的应用是微观世界形态学研究从单一的形态学描述上升到结构、功能和代谢为一体的动态观察。并可对细胞的属性、分化阶段和变异进行鉴别，有助于临床疾病的诊断。 组织细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的时间，但其发展异常迅速，检测方法可多达20多种以上。其基本原理是将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异抗体产生抗原抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来，进行观察和分析。 目前实验室常用的方法有免疫荧光法，PAP法，ABC法、IGSS法等10大类。但由于各种方法均有其特性和检测适应范围，即某一种方法无法在所有的检测标本中被应用，我们应充分发挥各种方法上的特点。有选择性的将不同来源的组织和细胞标本并选用不同的方法来进行检测。使我们的检测结果更精确。一一免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微显示的精确性相结合。用已知的抗体在不影响其免显微显示的精确性相结合。用已知的抗体在不影响其免疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测和鉴定。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以和鉴定。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITCFITC）、）、四乙基四乙基罗丹明（罗丹明（RB200RB200）、）、四甲基异硫氰酸罗丹明（四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITCTRITC）及）及藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）在流式细胞术（在流式细胞术（FCMFCM）中较常用。较为经中较常用。较为经典的方法有下列几种：典的方法有下列几种：（一）（一）直接法 是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制备大量特异性的荧光抗体。备大量特异性的荧光抗体。（二）间接法间接法 间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素标记抗抗体使之形成被检抗原抗体荧光素标记抗抗体标记抗抗体使之形成被检抗原抗体荧光素标记抗抗体复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光标志物，所以其敏感性比直接法要高。标志物，所以其敏感性比直接法要高。组织切片组织切片组织切片组织切片直直接接法法间间接接法法AbAb1 1- -荧光荧光AbAbAbAb1 1 1 1AbAb2 2- -荧光荧光免疫荧光法原理图（三）补体法（三）补体法 这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原抗体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原抗体抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易体抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。（四）双标记法（四）双标记法 运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，甚至可进行三重或多重标记法。甚至可进行三重或多重标记法。单色荧光染色双色荧光染色MAL 萤光标记萤光标记 ：黄（：黄（CD19 ）红（红（CD13）多色荧光染色二、 免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体反应的特异性与免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。选用的分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。选用的标记酶有辣根过氧化物酶标记酶有辣根过氧化物酶HRPHRP、 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）、）、葡葡萄糖氧化酶（萄糖氧化酶（GODGOD）、）、D D半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（D DGalGal）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且部分已制成试剂盒出售。目前已广泛地被临床和实验且部分已制成试剂盒出售。目前已广泛地被临床和实验室所应用室所应用 细 胞二步酶标法二步酶标法三步酶标法三步酶标法AbAb1 1- -酶基团酶基团AbAbAbAb1 1 1 1AbAb2 2- -酶基团酶基团免免 疫疫 酶酶 标标 法法 原原 理理 图图（一）（一）辣根过氧化酶免疫酶标记法辣根过氧化酶免疫酶标记法 辣辣根根过过氧氧化化酶酶是是从从辣辣根根中中提提取取的的一一种种糖糖蛋蛋白白，其其作作用用底底物物为为供供氢氢体体和和过过氧氧化化物物。目目前前常常用用的的供供氢氢体体为为二二氨氨基基联联苯苯胺胺（DABDAB）。在在酶酶反反应应过过程程中中DABDAB不不断断供供给给复复发发物物电电子子，使使其其成成为为在在光光镜镜下下能能观观察察到到的的不不溶溶性性深深棕棕色色多多聚聚合合物物。定定位与酶活力处即抗原抗体反应部分。位与酶活力处即抗原抗体反应部分。 现现常常用用的的方方法法有有-直直接接法法; ;间间接接法法; ;抗抗体体桥桥联联法法; ;过过氧氧化化酶酶抗抗过过氧氧化化酶酶复复合合物物法法（PAPPAP）; ;亲亲和和素素生生物物素素过过氧氧化化酶酶复复合合物物法法（ABCABC）等等。在在组组织织细细胞胞相相关关抗抗原原检检测中通常使用测中通常使用PAPPAP法和法和ABCABC法这两种。法这两种。（二）免疫碱性磷酸酶标记法 碱碱性性磷磷酸酸酶酶是是一一种种磷磷酸酸酯酯的的水水解解酶酶。从从大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取的的此此酶酶最最适适PHPH为为8.08.0左左右右。其其作作用用的的底底物物有有磷磷酸酸萘萘酚酚ASASMXMX和和磷磷酸酸萘萘酚酚ASASBIBI，显显色色的的偶偶联联剂剂可可采采用用固固红红-GBC-GBC和和固固蓝蓝-BB-BB等等。免免疫疫碱碱性性磷磷酸酸酶酶染染色色方方法法很很多多，有有直直接接法法；间间接接法法；APAAPAPAAP法法；ABCABCAPAP法法；但但APAAPAPAAP法法和和ABCABCAPAP法法二二种种，较较为为常常用用，且且这这二二种种方方法法其敏感性和特异性均较满意。其敏感性和特异性均较满意。细胞细胞 Ab-1（Mo）Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）免疫酶桥联(APAAP)法染色原理 Ab-1 细胞细胞生物素化二抗 ABC复合物复合物生物素化生物素化Biotion（HRP/AP）ABC法染色 原理图卵白素卵白素（Avidin）三、多聚螯合物法三、多聚螯合物法(ELPS)(ELPS)（一）多聚螯合物法的特点（一）多聚螯合物法的特点 多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术，其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广泛应用。泛应用。 该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶分子连接在第二抗体上。分子连接在第二抗体上。细胞细胞Ab-1酶酶基团（基团（HRP/AP）聚合物支架聚合物支架ELPSELPS法染色原理法染色原理( (一步法一步法) )细胞细胞Ab-1Ab-2酶酶基团（基团（HRP/AP）聚合物支架聚合物支架ELPSELPS法染色原理法染色原理( (二步法二步法) )在被检细胞周在被检细胞周围围( (或细胞内或细胞内) )见到红色沉淀见到红色沉淀物，即为阳性物，即为阳性反应反应 CD13+组织细胞免疫化学组织细胞免疫化学操作方法要点操作方法要点1 1固固 定：定： 涂片固定应根据各种标本的不同而进行。涂片固定应根据各种标本的不同而进行。2 2预处理：预处理： 封闭非特异性位点和阻断内源性酶。封闭非特异性位点和阻断内源性酶。3 3加单抗：加单抗： 添加工作浓度一抗置室温添加工作浓度一抗置室温(25)(25) 通常通常30306060分钟左右。分钟左右。 4 4加二抗：加二抗： 添加工作浓度二抗置室温（添加工作浓度二抗置室温（2525） 通常通常30306060分钟左右。分钟左右。 5 5显显 色：色： 添加相应荧光剂或酶底显色剂添加相应荧光剂或酶底显色剂5 510 min10 min。6 6观观 察：察： 荧光法应采用荧光显微镜选取相应波长进行观察荧光法应采用荧光显微镜选取相应波长进行观察. . 酶标法经复染后用普通显微镜观察即可酶标法经复染后用普通显微镜观察即可. .三、复合免疫组织细胞化学染色三、复合免疫组织细胞化学染色 随随着着免免疫疫组组织织细细胞胞化化学学技技术术广广泛泛地地被被采采用用的的同同时时，在在技技术术方方法法上上的的要要求求，也也日日趋趋提提高高。有有时时单单一一的的免免疫疫组组织织细细胞胞化化学学技技术术已已不不能能满满足足临临床床的的要要求求，这这时时就就可可采采用用二二种种或或二二种种以以上上的的免免疫疫组组织织细细胞胞组组织织化化学学技技术术。如如为为能能检检出出细细胞胞内内的的微微量量抗抗原原，可可采采用用重重复复强强化化技技术术和和桥桥联联- -亲亲和和素素技技术术，若若需需检检测测同同一一组组织织或或细细胞胞上上不不同同的的抗抗原原，可可采采用用双双重重或或三三重重染染色色技技术术，以以此此来来提提高高检检测的准确性。为疾病的诊断提供更重要的依据。测的准确性。为疾病的诊断提供更重要的依据。( (一一)PAP)PAP和和ABC-HRPABC-HRP PAPPAP和和ABC-HRPABC-HRP均属免疫酶标记技术，且都带有辣根过氧化酶基均属免疫酶标记技术，且都带有辣根过氧化酶基因。将这两种技术连续应用于一张涂片上因。将这两种技术连续应用于一张涂片上, ,可提高检测的敏感性和可提高检测的敏感性和微量抗原的检出率。其基本原理先进行微量抗原的检出率。其基本原理先进行PAPPAP技术，再用生物素化二技术，再用生物素化二抗与其结合，最后连接抗与其结合，最后连接ABCABC复合物。经过这两次技术可使微弱的原复合物。经过这两次技术可使微弱的原始信号得到比应用一种技术更大的放大效果。始信号得到比应用一种技术更大的放大效果。( (二二) )免疫荧光技术和免疫荧光技术免疫荧光技术和免疫荧光技术 利用不同荧光素在激发光下呈现不同颜色这一特点利用不同荧光素在激发光下呈现不同颜色这一特点, ,如异硫氰酸如异硫氰酸呈黄绿色，异硫氰四甲基罗达明显红色。若将这二种荧光素采用呈黄绿色，异硫氰四甲基罗达明显红色。若将这二种荧光素采用不同的方法同时标记在同一细胞上，用荧光显微镜换茬时，调节不同的方法同时标记在同一细胞上，用荧光显微镜换茬时，调节不同荧光素所需的特定波长的光波，就可以检测不同的抗原成不同荧光素所需的特定波长的光波，就可以检测不同的抗原成分。分。（三）免疫荧光技术-免疫酶标记技术 将这二种技术联合应用，有其独特的一个方面就是对双重或三将这二种技术联合应用，有其独特的一个方面就是对双重或三重染色结果观察较为清晰。目前双重染色有时采用免疫酶标记和重染色结果观察较为清晰。目前双重染色有时采用免疫酶标记和免疫酶标记技术，虽然免疫酶标记技术所携带的标记酶类有许多免疫酶标记技术，虽然免疫酶标记技术所携带的标记酶类有许多种，酶反应所需的底物基质液和偶联剂品种也很丰富。在双重标种，酶反应所需的底物基质液和偶联剂品种也很丰富。在双重标记技术中可选用一些显示色差异较明显的显色系统。但往往由于记技术中可选用一些显示色差异较明显的显色系统。但往往由于颜色间相互重叠而产生观察结果时的困难，再由于反复多次地进颜色间相互重叠而产生观察结果时的困难，再由于反复多次地进行酶底物显色，造成背景染色偏深且存有一些难以去除的杂质，行酶底物显色，造成背景染色偏深且存有一些难以去除的杂质，影响结果的观察，而免疫荧光技术影响结果的观察，而免疫荧光技术- -免疫酶标记技术若只作二重染免疫酶标记技术若只作二重染色，那只有一次酶底显示，其背景相对要清晰，更有意思的是观色，那只有一次酶底显示，其背景相对要清晰，更有意思的是观察同一细胞上有否二种抗原同时存在，只需调节光源即可，打开察同一细胞上有否二种抗原同时存在，只需调节光源即可，打开普通光观察免疫酶标结果，同样打开荧光光源可观察免疫荧光的普通光观察免疫酶标结果，同样打开荧光光源可观察免疫荧光的结果，无需使用移动尺。结果，无需使用移动尺。 （四）免疫酶技术（四）免疫酶技术- -免疫酶技术免疫酶技术 由由于于用用做做标标记记物物的的酶酶有有多多种种，他他们们又又各各自自有有许许多多不不同同的的酶酶底底物物。即即使使同同一一酶酶底底物物也也可可以以显显示示多多种种不不同同的的颜颜色色。反反应应的的显显色色沉沉淀淀物物相相对对较较稳稳定定。所所以以双双/ /多多量量免免疫疫酶酶染染色色可可挑挑选选的的余余地地相相当当大大。在在双双/ /多多重重免免疫疫酶酶标标记记染染色色中中选选择择同同一一种种酶酶体体系系的的称称单单酶酶双双/ /多多重重标标记记染染色色。而而选选择择二二种种酶酶体体系系的的称称双双酶酶双双/ /多多重重标标记记染染色色。单单酶酶和和双双酶酶双双/ /多多重重免免疫疫染染色色，这这二二种种方方法法的的选选用用，各各自自实实验验室可根据其检测的项目和试剂来源而加以选择。室可根据其检测的项目和试剂来源而加以选择。四 影响免疫细胞化学技术的因素 免疫细胞化学技术中所应用的方法较多，反应原理免疫细胞化学技术中所应用的方法较多，反应原理和所选用试剂也不尽相同。从各种标本的制备、抗体的和所选用试剂也不尽相同。从各种标本的制备、抗体的稀释、孵育的时间、结果的观察等许多方面均有其特定稀释、孵育的时间、结果的观察等许多方面均有其特定的操作要求和顺序。其中无论哪一环节处理不当，就可的操作要求和顺序。其中无论哪一环节处理不当，就可使测定的结果发生误差。使测定的结果发生误差。 （一）免疫荧光细胞化学技术（一）免疫荧光细胞化学技术 1 1准准备备 整整个个操操作作过过程程中中所所使使用用的的器器皿皿如如载载玻玻片片、试试管管、盖盖玻玻片片等等必必须须清清洁洁光光滑滑，不不含含自自发发荧荧光光，且且载载玻玻片片以以薄薄为为好好，应应小小于于1.2mm1.2mm，否否则则厚厚玻玻片片能能吸吸收收较较多多光光源，激发光可主动在被检标本上聚集。源，激发光可主动在被检标本上聚集。 2 2观察部位选择观察部位选择 若要在载玻片上标出标本所在区若要在载玻片上标出标本所在区域，可用域，可用DaKoDaKo标记笔圈出。如用荧光型效果更好，此法标记笔圈出。如用荧光型效果更好，此法即可表明细胞所在位置，便于观察，又可防止试剂外即可表明细胞所在位置，便于观察，又可防止试剂外溢，节约成本。溢，节约成本。 3 3封片封片 封片剂需选用无色透明，无自发荧光，且封片剂需选用无色透明，无自发荧光，且在在pH8.5pH8.59.59.5时有较强荧光亮度。时有较强荧光亮度。 4 4细胞涂片细胞涂片 细胞涂片最理想的是采用离心涂片机细胞涂片最理想的是采用离心涂片机进行涂片，并调整好细胞悬液浓度，可使细胞分布均进行涂片，并调整好细胞悬液浓度，可使细胞分布均匀。若采取手工涂片要控制好涂片厚薄，不宜太厚，以匀。若采取手工涂片要控制好涂片厚薄，不宜太厚，以免细胞过分重叠，影响结果观察。免细胞过分重叠，影响结果观察。 5 5显微镜摄影显微镜摄影 用荧光显微镜浸油镜观察细胞时，所用荧光显微镜浸油镜观察细胞时，所采用的油应同样无自发荧光。若需同时作显微镜摄影，采用的油应同样无自发荧光。若需同时作显微镜摄影，最好选用显微摄影专用油，以免图像清晰程度受影响。最好选用显微摄影专用油，以免图像清晰程度受影响。 6 6荧光灯的使用荧光灯的使用 荧光显微镜每次使用时间不宜太荧光显微镜每次使用时间不宜太长，以长，以1 1小时以内，超过小时以内，超过90min90min，高压氘灯的发光强度下，高压氘灯的发光强度下降，荧光减弱，影响结果观察。另标本经紫外线照射降，荧光减弱，影响结果观察。另标本经紫外线照射15min15min后，荧光亦明显减弱。后，荧光亦明显减弱。7 7标本的保存标本的保存 由于荧光素很易衰退，染色标本应及由于荧光素很易衰退，染色标本应及时观察。若不能马上观察，可将标本放在聚乙烯塑料袋时观察。若不能马上观察，可将标本放在聚乙烯塑料袋中中44保存，可延缓荧光减弱时间并可防止封片干燥。保存，可延缓荧光减弱时间并可防止封片干燥。 8 8对照的选择对照的选择 免疫荧光染色每次均应该设对照染免疫荧光染色每次均应该设对照染色。如阴性对照、阳性对照、染色抑制试验、自发荧光色。如阴性对照、阳性对照、染色抑制试验、自发荧光对照、直接法时尚需作与特异性抗体同种属源性正常血对照、直接法时尚需作与特异性抗体同种属源性正常血清对照。清对照。 9 9非特异性荧光的区别非特异性荧光的区别 观察结果时应区别特异性观察结果时应区别特异性荧光和非特异性荧光，因免疫荧光染色有时还出现一些荧光和非特异性荧光，因免疫荧光染色有时还出现一些与抗原反应无关的荧光，造成非特异性荧光的原因很与抗原反应无关的荧光，造成非特异性荧光的原因很多，如抗体不纯、荧光素质量差、标本洗涤时间不够、多，如抗体不纯、荧光素质量差、标本洗涤时间不够、未结合的游离抗体未清洁干净等。届时应结合产生非特未结合的游离抗体未清洁干净等。届时应结合产生非特异性荧光的具体原因加以去除。异性荧光的具体原因加以去除。（二）（二）免疫酶细胞化学技术 1 1标本选择的特点标本选择的特点 免疫酶标法可选择组织切片或骨免疫酶标法可选择组织切片或骨髓涂片也可抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取出髓涂片也可抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取出单个核细胞。采用涂片机涂片。单个核细胞。采用涂片机涂片。 2 2标本的保管标本的保管 标本采集后至结果观察完毕以前，应标本采集后至结果观察完毕以前，应尽可能避免接触与实验无关的化学物品。特别是苯、二尽可能避免接触与实验无关的化学物品。特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水、醛等实验室常用试剂。使细甲苯、醚、乙醇、双氧水、醛等实验室常用试剂。使细胞表面的分化抗原减少，甚至失去，造成假阴性。胞表面的分化抗原减少，甚至失去，造成假阴性。 3 3试剂的准备试剂的准备 各种试剂购进后，特别是单克隆抗各种试剂购进后，特别是单克隆抗体，除参考产品说明书，选定最佳稀释速，即调整一体，除参考产品说明书，选定最佳稀释速，即调整一抗、二抗、三抗等之间的浓度，以求获得最佳染色效抗、二抗、三抗等之间的浓度，以求获得最佳染色效果，同时均需设置阳性和阴性的对照。果，同时均需设置阳性和阴性的对照。4 4 非特异性结合的防止非特异性结合的防止 抗体和组织成分的非特异性结抗体和组织成分的非特异性结合（合（FcFc受体），也可引起非特异性染色。另外，由于电受体），也可引起非特异性染色。另外，由于电荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带阳电荷的蛋白质发荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带阳电荷的蛋白质发生非特异性粘附，此时可加入与二抗同一种属源性的血生非特异性粘附，此时可加入与二抗同一种属源性的血清加以封闭。清加以封闭。5 5抗体孵育操作不当抗体孵育操作不当 可造成的背景吸附及阳性细胞呈可造成的背景吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果产生假阳性和假阴性。局限状产生，使结果产生假阳性和假阴性。6 6结果观察结果观察 结果观察要及时，酶标法虽然可保存较结果观察要及时，酶标法虽然可保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳，易观察。长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳，易观察。7 7阳性反应的了解阳性反应的了解 在检测前应明确被检细胞的分化在检测前应明确被检细胞的分化抗原所在的部位，以免造成假阴性或阳性结果的误抗原所在的部位，以免造成假阴性或阳性结果的误判、漏判。判、漏判。8 8结果的比较结果的比较 结果观察的同时，必须对同一标本的结果观察的同时，必须对同一标本的普通染色片（瑞氏染色或普通染色片（瑞氏染色或H-EH-E染色）和细胞化学染色结染色）和细胞化学染色结果进行观察和比较，进一步确定具有临床意义的病理果进行观察和比较，进一步确定具有临床意义的病理性细胞和其免疫标记的阳性情况，尽可能减少误诊和性细胞和其免疫标记的阳性情况，尽可能减少误诊和漏诊。漏诊。原位杂交组织化学原位杂交组织化学 原位杂交组织化学是应用已知碱基顺序并带有标记原位杂交组织化学是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针（如物的核酸探针（如DNADNA，RNARNA和寡聚核苷酸）与组织细和寡聚核苷酸）与组织细胞中待测的核酸胞中待测的核酸(DNA,RNA)(DNA,RNA)按碱基配对的原则进行特异按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再与标记物相应的检测系性结合，形成杂交体，然后再与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法，在核酸原有统，通过组织化学或免疫组织化学方法，在核酸原有的位置上将其显示出来。的位置上将其显示出来。 原位杂交组织化学程序的主要步骤包括：组织细胞原位杂交组织化学程序的主要步骤包括：组织细胞样本的制备样本的制备样本预处理样本预处理杂交杂交杂交后洗涤杂交后洗涤免疫免疫组织化学方法显示杂交体。组织化学方法显示杂交体。UUUGGCUAGAAGCGAUCCCGUCCGACGRNA探针待测mRNA酶标抗体酶标抗体标记物标记物原位杂交组织化学原理