第二章第二章 发酵工业常用微生物及培养发酵工业常用微生物及培养第二章第二章 发酵工业常用微生物及培养发酵工业常用微生物及培养. .菌种的分离菌种的分离. .菌种选育菌种选育. .菌种保藏及防止衰退的措施菌种保藏及防止衰退的措施 . .培养基的配制培养基的配制. .菌种的扩大培养菌种的扩大培养. 6 微生物的几种接种方法微生物的几种接种方法带图象分析系统的带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置微生物菌种显微观察装置 2. 1 菌种的分离菌种的分离一、发酵工业常用微生物的要求发酵工业常用微生物的要求二、菌种的来源二、菌种的来源三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤四、自然界中细菌的分离四、自然界中细菌的分离1.1.生产菌不是病原菌及其产物无毒性生产菌不是病原菌及其产物无毒性2.2.原料来源广、廉价，菌种大量高效地合成产物原料来源广、廉价，菌种大量高效地合成产物3.3.菌种纯，遗传性能稳定，不易感染噬菌体菌种纯，遗传性能稳定，不易感染噬菌体4.4.生长繁殖能力强，发酵周期短生长繁殖能力强，发酵周期短5.5.发酵中少产与产品相近的副产品发酵中少产与产品相近的副产品 一、发酵工业常用微生物的要求发酵工业常用微生物的要求二、菌种的来源二、菌种的来源根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或菌种保藏部门索取或购买；或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 定定方方案案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤 （一）采样一）采样1. 采样对象：以采集土壤为主，也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。2. 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3. 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约 10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋 中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。从自然界筛选从自然界筛选（二）增殖培养（二）增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）分离筛选（三）分离筛选尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（四）（四）发酵性能测定发酵性能测定生产性能：发酵周期、产品品种和产量等安全性能：自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。 据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。四、自然界中细菌的分离四、自然界中细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项1.采样时应尽可能保持相对无菌；2.所采集的样本必须具有某种代表性；3.采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理等；4.应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。采样和采集方法采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。1土样采集方法土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2 2水样采集方法水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。.菌种选育菌种选育 菌种的选育： 是运用生物遗传和变异原理，用人工方法造成变异，经过筛选，得到使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状的工业菌种的过程。1. 自然选育2. 诱变育种3. 其他育种菌种的选育方法：1. 自然选育定义：在生产过程中，不经过人工处理，利用 菌种的自然突变进行菌种筛选的过程。突变因素：1.多因素低剂量的诱变效应 2. 碱基配错效应 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。2 2 诱变育种诱变育种 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。一、诱变剂二、诱变育种流程一、诱变剂 物理诱变剂： 如紫外线、X射线、射线， 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。化学诱变剂化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。 二、诱变育种流程 出发菌株 取高产斜面（菌种保藏）单孢子悬液 转接斜面 诱变处理 摇瓶复筛稀释涂布平皿 高产菌株单菌落转接斜面 中试考查 摇瓶初筛 生产一、转一、转 化化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。二、转导二、转导利用噬菌体DNA作为载体将外源基因导入受体细胞的过程 。基因重组示意图 杂交育种杂交育种 两个不同基因型的菌株通过结合,遗传物质重新组合，在从中分离和筛选初具有新性状菌株的育种方法.原生质体融合原生质体融合原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。用脱壁酶除去细胞壁，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得异核体活重组子的技术。突变型菌株的筛选突变型菌株的筛选 .菌种保藏及防止衰退的措施菌种保藏及防止衰退的措施 在在发发酵酵生生产产中中，需需对对具具有有高高产产有有重重要要经经济济价值的微生物菌种的进行保存和长期保藏。价值的微生物菌种的进行保存和长期保藏。一、菌种保藏技术一、菌种保藏技术二、微生物活力和稳定性测定二、微生物活力和稳定性测定 三、防止菌种衰退的措施三、防止菌种衰退的措施保藏原理：根据菌株生理生化特性，人工创造条件（低温、干燥、真空）使菌体的代谢活动休眠期状态。目的要求：经长期保藏后菌种存活健在，保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力。一、菌种保藏技术一、菌种保藏技术(1)冷冻保藏；(2)干燥保藏； (3)传代保藏； (4)矿物油中浸没保藏 (5)载体吸附于燥保藏。 冷冻保藏冷冻保藏 冷冻保藏（-20以下）：是保藏微生物菌种的最简单而有效的方法，将菌种加入菌种保护剂（甘油或）通过冷冻，使微生物代谢活动停止。冷冻温度愈低，效果愈好。冷冻深藏的缺点运输较困难。主要冷冻保藏方法普通冷冻保藏技术(-20)超低温冷冻保藏技术(-60-80)液氮冷冻保藏技术 （ -130-150 ） 普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)保保藏藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种加入菌种保护剂，密封于试管内，贮藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20)中。保藏期限：保藏期限：12年注意事项：经次解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60(-60-80)-80)保藏方法：取对数生长中期至后期的微生物细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；混匀后分装入冷冻管中，于-60超低温冰箱中保藏。保藏期限：5年注意事项：冷冻速度控制在1-2min 液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术保藏方法：斜面用10甘油制备悬液或培养液体物用20%甘油制备悬液，混匀，取0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，酒精喷灯封口；先于5冰箱中3min，后置于金属容器，以1-2/min控速冷冻至细胞冻结点(通常为-30)，再以1/min控速冷冻至-50；迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 气相(-156)中保存。复苏方法：从液氮罐中取出所需的安瓿，立即冰浴10min；再迅速将安瓿置于37-40水浴中，轻摇融解；取0.1-0.2ml 转接入琼脂斜面上。保藏期限：10年以上注意事项：保护剂最终浓度为10无菌甘油或5无菌二甲亚砜。甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌。 冻干保藏冻干保藏 保保藏藏方法：将混有保护剂冰冻至-60菌种迅速转移至-40时启动真空泵，使真空度减压到2.674.00Pa条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使菌种干燥成粉，分装密封安瓿，低于5下保藏。是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。保藏期限：保藏期限： 10年以上注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖，冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。(3)(3)传代保藏传代保藏保保藏藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面基本培养基上传代， 5以下保藏保藏期限：保藏期限： 1-31-3月月注意事项：此法简单和经济，可用于实验室中若干菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。 （4 4）矿物油中浸没保藏）矿物油中浸没保藏保保藏藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入无菌矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏保藏期限：保藏期限： 1-31-3年年注意事项：以液体石蜡保藏时，应对菌株预先作石蜡培养试验，保藏株23年也应做一次存活试验。(5)载体吸附于燥保藏常用载体：沙土、麸皮、硅胶、滤纸等二、二、 微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。三、防止菌种衰退的措施三、防止菌种衰退的措施原因：保藏不妥 、条件不能满足菌种衰退：经过保藏，由于自发突变引起的某菌种衰退：经过保藏，由于自发突变引起的某 些优良特征的变偌或消失的现象些优良特征的变偌或消失的现象防止菌种衰退的措施：防止菌种衰退的措施：1. 减少传代次数减少传代次数2. 选择合适的培养条件选择合适的培养条件3. 利用不同类型的细胞进行传代利用不同类型的细胞进行传代3. 选择合适的保藏方法选择合适的保藏方法.培养基的配制培养基的配制1 1 概述概述2 2 培养基的成分培养基的成分3 3 培养基的种类与选择培养基的种类与选择4 4 培养基的设计培养基的设计1 概述培培养养基基：供供微微生生物物生生长长繁繁殖殖和和生生物物合合成成各各种种代代谢谢产产物物所所需需要要的的按按一一定定比比例例配配制制的多种营养物质混合物。的多种营养物质混合物。 满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：2 培养基的成分碳源氮源无机盐和微量元素水生长因子前体和抑制剂、促进剂1. 碳源 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质，是发酵的主要原料之一一般占干物质50% ，为生命活动提供能源包括糖类，脂肪，有机酸，醇，碳氢化合物糖 类 单糖 葡萄糖 双糖 蔗糖，乳糖，麦芽糖多糖 糊精，淀粉及其水解液，玉米淀粉， 马铃薯淀粉，小麦淀粉，木薯淀粉，脂 肪:可作碳源，还有消泡作用有机酸:可作碳源，还有调节pH值的作用醇: 乙醇， 甘油，山梨醇 碳氢化合物 石油产物，甲烷，乙烷，丁烷，十六烷烃2. 氮源构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质，可补充碳源，是发酵的主要原料之一有机氮源 黄豆饼粉，玉米浆，棉籽饼粉，蛋白胨，酵母粉，鱼粉，菌丝体，酒糟无机氮源 氨水，硫酸铵，氯化铵，硝酸盐，具有调节pH值的作用3. 3. 无机盐和微量元素无机盐和微量元素磷，硫，磷，硫，铁铁，镁，钙，镁，钙，锌，钴锌，钴，钾，钠，钾，钠，锰锰, ,铜铜, ,氯等，氯等， 其中许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度有关，其中许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度有关，低浓度往往具有刺激作用，高浓度具有抑制作用低浓度往往具有刺激作用，高浓度具有抑制作用磷磷 是构成核酸，蛋白质等细胞物质的组成成分，是许多是构成核酸，蛋白质等细胞物质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化的必需元素辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化的必需元素铁铁 是菌体的细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化物酶的是菌体的细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动的必需元素之一组成元素，是菌体生命活动的必需元素之一镁，锌，钴镁，锌，钴 是某些酶的辅酶，是某些酶的辅酶，钾 影响细胞膜的通透性钠 具有维持细胞的渗透压的钙 调节细胞的透性的作用，调节培养液中磷酸盐的含量4. 水 是培养基的主要组成成分，既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质的传递介质。生长因子维生素，生物素，5. 前体，促进剂，抑制剂产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著变化的物质青霉素发酵培养基的苯乙酸和苯乙酰胺3 培养基的种类与选择按培养基物理性质分液体培养基，固体培养基，半固体培养基 按筛选菌种的作用分选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等按化学组成作用分天然培养基，合成培养基，复合培养基按发酵生产用途分孢子培养基，种子培养基，发酵培养基 组成培养基天然培养基 化学成分不明或不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质制成的(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)合成培养基 已知组成成分的各种营养物质组合的培养基，用于科学研究复合培养基 由组成成分不完全明确的天然产物与无机盐组合的培养基（半合成培养基），用于工业生产 生产用途孢子培养基 利于孢子的发芽和迅速生长，形成大量优质孢子，稍低的基质浓度种子培养基 用于孢子发芽和菌体生长繁殖，形成发酵种子的培养基发酵培养基 供菌体生长繁殖和合成大量产物的培养基培养基的组成必需满足菌体细胞的生长发繁殖培养基的组成必需满足菌体细胞的生长发繁殖和合成代谢产物的元素需求，还要提供维持细和合成代谢产物的元素需求，还要提供维持细胞生命活动和合成代谢所需要的能量胞生命活动和合成代谢所需要的能量设计要求设计要求1. 1. 培养基各组分浓度适合，配比恰当培养基各组分浓度适合，配比恰当2. 2. 有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期，有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期， 3. 3. 避免副产物的形成，便于产物分离纯化避免副产物的形成，便于产物分离纯化4. 4. 原料价廉易得，质量稳定，成本低原料价廉易得，质量稳定，成本低4. 培养基的设计培养基的设计定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 . 菌种的扩大培养菌种的扩大培养1. 种子必须具备的条件2. 种子制备过程3. 接种龄和接种量4. 种子罐级数的确定1. 种子必须具备的条件 菌种细胞的生长活力强，接种后在 发酵罐中能迅速生长 菌体总量和浓度能满足大容量发酵 罐的要求 无杂菌污染 生产能力稳定 2. 2. 种子制备过程种子制备过程实验室种子制备阶段：在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面并至摇瓶。生产车间种子制备阶段：实验室制备的摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境 3.接种龄和接种量接种龄 从一个级的种子罐中培养的菌体到移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积4. 种子罐级数的确定 种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数 对于生长快的细胞，种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少 . 6 微生物的几种接种方法微生物的几种接种方法1.培养基的配制方法培养基的配制方法配制斜面培养基配制平皿培养基2.几种接种方法 配制斜面培养基的一般操作步骤：称量 溶解 调pH值 加琼脂 分装 加棉塞 包扎 灭菌 摆斜面 无菌检查。配制平皿培养基的一般操作步骤：称量 溶解 调pH值 加琼脂 灭菌 倒平皿 凝固 无菌检查液体菌倒平板法液体菌倒平板法 平板划线分离操作法示意图菌种的选育、自然选育、诱变育种、转化、转导、培养基、菌种的扩大培养、接种龄、接种量 菌种保藏的各种方法及原理防止菌种衰退的措施培养基的种类配制斜面培养基的一般操作步骤发酵工业常用微生物的要求新种分离与筛选的步骤习题：习题：