设计型实验设计型实验 酵母菌的分离及培养条酵母菌的分离及培养条件的优化件的优化一、目的要求一、目的要求1、掌握培养基的配置及灭菌方法，能够正确的配制 培养基并在高压灭菌锅内进行灭菌。2、熟知培养基成分的选择原则，能够对培养基的成分和配比进行优化设计。3、掌握固体斜面、平板的制备技术，能够通过划线、涂布等方法分离菌种。4、熟知影响酵母菌生长繁殖各种培养条件，能够对摇瓶培养条件进行优化设计。5、了解酵母菌培养过程的代谢变化规律。掌握酵母菌培养过程参数的测定和分析方法。二、基本原理二、基本原理酵母菌是单细胞真菌生物，具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离纯化菌种常用到的方法。在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件提供数据依据。三、实验材料三、实验材料（一）菌种：（一）菌种：从安琪酵母中分离的酵母菌（二）培养基（二）培养基基础培养基基础培养基YPD： 酵母浸粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖 2% 固体培养 基再加琼脂2%优化优化N源培养基：源培养基： 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NH4NO3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NH4NO3 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NaNO3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NaNO3 4% 葡萄糖 2% ；（三）仪器设备（三）仪器设备超净工作台，756型分光光度计，旋转式摇床，恒温培养箱，全自动灭菌锅，三角瓶、涂布器、移液管、平皿等玻璃仪器。 （四）试剂（四）试剂 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂 (NH4)2SO4 2%、 (NH4)2SO4 4%、 NH4NO3 2% NH4NO3 4%、 NaNO3 2%、 NaNO3 4%等；裴林试剂甲液、裴林试剂乙液； NaOH溶液、HCl等。四四 实验内容实验内容1、分离单菌落、分离单菌落 （1）实验物品灭菌）实验物品灭菌 仪器：包扎9个移液管、9个涂布器、9个装有9ml蒸馏水的试管、16个平板、 液体：3g酵母浸粉1%、6g蛋白胨2%、6g葡萄糖2%，配成300ml溶液，取240ml溶液平均分装两个三角瓶中，然后每个三角瓶放入2.4g琼脂，剩下60ml为液体培养基，然后将以上设备拿去灭菌（2）划线涂布）划线涂布超净台上：超净台上： 1、把240ml的培养基分别倒入15个平板，每个平板为1213ml，平板分别标10-210-10，还有倒一个斜面 2、取1ml的菌原液进行稀释梯度为10-310-10 3、划线涂布 划线为原液从10-210-7；涂布从10-310-10用对应的稀释梯度液，10-2用原液涂布2、种子培养挑取单菌落接至种子瓶，进行种子培养培养条件：将250ml三角瓶装培养基60ml放入摇床，将转速为180r/min,温度为30度培养时间:12月4号早上10:37到12月5号早上8:47十十个小时左右氮源的优化方案1.常见的有机氮源:(NH4)2SO4.NH4NO3.NaNO32.准备7个三角瓶分别装入以下培养基然后定容至50ml(1) 1.酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 2g 葡萄糖1g(2) 1.酵母浸液0.5g NH4NO3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g NH4NO3 2g 葡萄糖1g(3) 1.酵母浸液0.5g NaNO3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g NaNO3 2g 葡萄糖1g 3.对比试验:酵母浸液0.5g 蛋白胨1g 葡萄糖1g 4.配置完毕调PH值 PH等于5为准确 包三个移液管然后将以上培养基一起拿去灭菌接种培养将种子液按9%的接种量接种到以下发酵瓶中 （NH4）2SO42%+5ml种子液 （NH4）2SO44%+5ml种子液 NH4NO32%+5ml种子液 NH4NO34%+5ml种子液 NaNO32%+5ml种子液 NaNO34%+5ml种子液 蛋白胨+5ml种子液 培养培养时间 9：20条件180r/min 30的摇床测种子液的OD值将种子液稀释10倍，以YPD培养液为标准液测其OD值测得OD值17.2%T取样取样两小时后（两小时后（11：20）PH值均为6OD值: 稀释10倍 原液 (NH4)2SO4 2% 0.117A 1.018A (NH4)2SO4 4% 0.105A 0.863A NH4NO3 2% 0.097A 0.889A NH4NO3 4% 0.061A 0.830A NaNO3 2% 0.130A 0.845A NaNO3 4% 0.143A 0.836A 对照 0.178A 1.180A测发酵瓶的PH值OD值及残糖量一小时后（一小时后（12：30）PH值均为5 OD值 稀释 原液 （NH4）2SO4 2% 0.210A 1.066A （NH4）2SO4 4% 0.167A 0.939A NH4NO3 2% 0.192A 1.036ANH4NO3 4% 0.106A 0.833ANaNO3 2% 0.167A 1.092ANaNO3 4% 0.161A 1.102A对比 0.262A 1.328A残糖量残糖量空白费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+6ml标准葡萄糖样品费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+0.5ml样品测定结果 消耗标准葡萄糖 残糖量（NH4）2SO42% 7.08ml 1.744%（NH4）2SO44% 6.5ml 1.86% 对比 6.98ml 1.764%结论1、 经观察菌种生长发现稀释梯度为10-8、 10-9 的菌种进行涂布生长较好 2、 有机氮源比无机氮源效果好 (NH4)2SO4比NH4NO3、 NaNO3效果好（NH4）2SO4 2%比（NH4）2SO4 4%效果好一、实训要求一、实训要求1、YPT培养基：酵母菌1%，蛋白胨2%,葡萄糖2%；2、灭菌装料量60%；3、设定参数：PH=5，T=30，转速180r/min;4、接种与培养（接种量10%）注：（1 1）发酵罐是否正常运行、各参数；（2）随时间的延长适当调进气量、搅拌速度；（3）取样30min/次、镜检2h/次，样品进行两个平板培养。二、配制二、配制1、配多少培养基 10L罐装料量60%：10X60%=6L 接种量10%：培养基5400ml(实际操作培养基5000ml)，种子液600ml2、配方用多少 6L:60g酵母浸粉1%,120gc120g葡萄糖2%； 150ml:1.5g酵母浸粉1%,3g酵母浸粉1%,3g葡萄糖2%.其中100ml加1g琼脂配成固体培养基用于倒平板；50g原液用于测OD时做标准液。3、所需器材包扎灭菌 4个装有9ml蒸馏水的试管，6个空试管，4个涂布器，4个移液管1ml，6个平板1、NB型空气过滤器消毒型空气过滤器消毒1.1在发酵罐空消前，必须对设备的NB型过滤器先进行消毒；1.2为防止蒸汽冷凝水进入NB型过滤器，消毒前必须先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水，时间控制不少于5min；1.3NB型过滤器的消毒温度控制在120-123之间，压力维持在0.11Mpa-0.12Mpa之间，时间确保在25min-30min之间；1.4消毒后，在关闭蒸汽阀的同时迅速打开过滤器的进气阀换气，并用压缩空气将过滤器吹干，吹干时间一般控制在25min-30min之间；1.5吹干后，必须对整个空气进气系统进行保压，压力维持在0.12Mpa-0.15Mpa之间。操作注意：空气流量计内不能通入蒸汽，NB过滤器消毒前必须将空气流量计出口阀关闭，以免造成设备损坏。2、设备空消2.1空消前，将控制系统退出自动运行状态，小心取出PH电极和DO电极，进行清洗、校检、备用，并装好电极堵头。2.2打开夹套排污阀，同时打开夹套蒸汽阀进汽，在同时向罐内排光冷凝水之后，关闭夹套蒸汽阀，直至空消结束。2.3缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀进汽，待压力升至0.01Mpa后，打开罐面排气阀进行排气。2.4调节罐面排气阀，保持罐压0.01Mpa,维持温度在120125之间，计时空消30min2.5空消完毕，关闭进气阀及底阀处的蒸汽阀，打开底阀开始排污。2.6开大罐面排气阀，卸去罐压后，打开罐盖上的进料口加入培养基。3 、加培养基、加培养基3.1 投料前，应校正并安装PH电极和OD电极。3.2 按工艺要求配置好培养基原液，加入发酵罐内。3.3 加水定容至60%-65%左右后，启动电机搅拌5min3.4 按工艺要求调整好PH后，拧紧进料口螺盖。操作注意；实消时蒸汽冷凝水约占培养基体积10%左右，固定容是必须扣除此容积。4 、培养基实消、培养基实消4.1 投料结束后，启动电机。慢速搅拌。4.2 微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.11mpa左右，待培养基预热达到95 以上时停搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。4.3 培养基温度达到95 后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内进气，待罐压升至0.11mpa后，打开罐面排气阀进行排气。4.4 调节罐面排气阀，保持罐压0.11mpa，维持温度121 -123 之间，计时实消20min。4.5 实消完毕，关闭底阀后关闭底阀处的蒸汽阀。4.6 在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开NB型过滤器的出气阀，进行换气，保持罐压0.05mpa-0.08mpa之间。4.7 关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀和夹套排污阀进行降温，当培养基温度降到90 左右时，开搅拌低速控制。4.8 当培养基温度达到发酵需要的温度后，关闭夹套手动进水阀，调整转速至正常转速，将控制系统切换至自动；运行状态，调整进风量、罐压，等待接种。操作注意；因为调压过滤器出口空气压力在0.12mpa-0.15mpa之间，所以必须在发酵罐压力降至0.1mpa以下时方可进行唤起操作，且必须先换气后降温，防止设备失压。5、接种、接种5.1准备好合格的摇床菌种，接种量根据工艺要求确定。5.2用75%酒精棉球擦洗进料口四周后，搁上接种火圈，并在接种火圈内围上酒精棉球，接种者双手也需用酒精棉球擦洗消毒。5.3减少进气量，控制罐压在0.02MPa左右后，点燃接种火圈内的酒精棉球。5.4 拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的培养皿中。5.5将接种瓶是瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。5.6旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球将进料口擦洗干净。5.7重新调整进风量，保持罐压在0.05MPa。注意事项：操作中动作要迅速，罐压不得跌零，否则会导致染菌。6、取样、取样6.1打开取样放料阀处的蒸汽阀，微开取样放料阀，保持10min后关闭两阀门。6.2打开底阀和取样放料阀，放出少量培养液后关闭取样放料阀。6.3用酒精火焰封取取样放料口，把无菌取样瓶口置于酒精火焰上拔去瓶盖，打开取样放料阀取好样后，立即盖上瓶盖同时关闭底阀。6.4再次打开取样处放料阀处的蒸汽阀，对取样放料阀口再灭菌，保持时间10min后关闭两阀。注意事项：若不需要取无菌样时，可不进行酒精火焰保护的操作。整个培养过程的总取样量一般不超过发酵液体积的10%，否则诸如氧传递速度等会受到影响。7、出料、出料7.1调小罐面排气阀，调节进气阀，将罐压升至0.05MPa0.1MPa之间。7.2打开底阀和放料阀，使发酵液通过放料管放到盛料容器或下一道工序。7.3如发酵失败，必须将发酵液灭活后方可排除。时间PH值原液OD稀释10倍OD残糖量09:1850、7350、10209:4860、8150、19910:1760、7990、14310:4760、8730、14411:1860、8570、13311:4760、8480、12712:1760、8360、15712:4760、8210、17501:1760、8700、16101:4760、9360、167