生物化学与分子生物学实验技术生物化学与分子生物学实验技术课程安排：课程安排：32学时学时讲课：三次讲课：三次(1117, 1124, 1201)实验：四个实验：四个/四组？四组？/加样器？加样器？/时间？时间？ 实例分析实例分析分子生物学技术的应用分子生物学技术的应用-以以interleukin 24为例为例二、基因功能研究二、基因功能研究 1.mRNA水平和蛋白质水平表达谱水平和蛋白质水平表达谱 2.体外生物学活性：细胞模型，调节表达水平体外生物学活性：细胞模型，调节表达水平 细胞活力、细胞增殖、细胞周期、抑瘤活性、等等细胞活力、细胞增殖、细胞周期、抑瘤活性、等等 3.体内生物学活性：抑瘤活性、成血管活性、等等体内生物学活性：抑瘤活性、成血管活性、等等内容内容一、基因的基本信息：发现、序列、染色体定位、表达调一、基因的基本信息：发现、序列、染色体定位、表达调控、同源性分子、修饰、降解、细胞内定位、空间结构等控、同源性分子、修饰、降解、细胞内定位、空间结构等等等 三、作用机制：信号转导途径和相互作用分子三、作用机制：信号转导途径和相互作用分子四、应用四、应用235 documents IF5.977.57.22.765.03.069.384.35.521.34.15.256.48Oncogene 1995, 11: 2477-2486Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37-干扰素密执霉素干扰素密执霉素(mezerein)人黑色素瘤细胞人黑色素瘤细胞HO-1 消减杂交消减杂交mda(melanoma differentiation associated gene) mda-5，mda-6 (p21)，mda-7/IL-24，mda-9/synteninSubtraction hybridization一、一、mda-7/IL-24Paul B. FisherColumbia Uni1.发现发现杂交产物的杂交产物的克隆、筛选克隆、筛选和测序和测序HO-1HO-1IFN-+ MEZ生长阻滞生长阻滞终末分化终末分化失去致瘤潜能失去致瘤潜能消减杂消减杂交探针交探针Biotin-21-UTP除去除去杂交体、杂交体、过量探针、过量探针、盐和小片段盐和小片段Cancer Biol Ther 2003;2:S23S372.提交序列提交序列NCBI/Genbank 3.染色体定位染色体定位Data base analysisCyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 3551IL-10 FamilyMol Med. 2001;7(4):271-282 基因基因 物种物种其他名称其他名称氨基酸序列同源性氨基酸序列同源性MDA-7Mob-5FISPhIL-24HumanMDA-7100%68%69%rIL-24RatMOB-5, C49A68%100%93%mIL-24 MouseFISP69%93%100%4.与与IL-24同源的分子同源的分子一致的一致的 (*)保守的保守的 (:)相似的相似的 (.)Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14:3551Immunology. 2005;114(2):166-70NCBI Blast, KEGG5.基因的表达调控基因的表达调控 J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46 基因组文库基因组文库IL-24cDNA探针探针PCR测序测序启动子：启动子：GCG 启动子搜索启动子搜索转录起始位点：引物延伸和作图转录起始位点：引物延伸和作图 转录水平转录水平启动子序列启动子序列J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46AP-1: PKC-activated TFC/EBP: growth arrest and terminal differentiation associated TFTBPTAF TF II H转录起始前复合物：真核生物转录起始前复合物：真核生物RNA聚合酶不与聚合酶不与DNA分子直分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。接结合，而需依靠众多的转录因子。转录前起始复合物转录前起始复合物拼板理论：一个真核生物基因的转录需要拼板理论：一个真核生物基因的转录需要3至至5个转录因子。个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。针对性地结合、转录相应的基因。RNA聚合酶保护法聚合酶保护法分析启动子结构分析启动子结构Luciferase assay systemJ Cell Physiol. 2000;185(1):36-46 NdeI-NheI是启动子转录活性的重要区域，是启动子转录活性的重要区域，C/EBP-b和和cJUN/AP-1提高转录活性。提高转录活性。重要区域重要区域nuclear lysatesarrow 1：C/EBP-barrow 2：AP-1 J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46EMSA C/EBP-b和和cJUN/AP-1结合在结合在mda-7/IL-24启动子上。启动子上。cell lysatesIFN-和和MEZ单独或联合处理单独或联合处理不能显著改变启动子活性不能显著改变启动子活性 Luciferase assay system, NB Oncogene. 2000;19(10):1362-8 3-UTR的的ARE调节该基因在终末分化过程中的调节该基因在终末分化过程中的mRNA水平水平ARE： AU-rich elements Luciferase assay systemOncogene. 2000;19(10):1362-8 dayNCI-H12997.分泌蛋白分泌蛋白Mol Ther. 2004;9(3):355-67 Overexpression, WBAd.IL-24 cell lysateAd.IL-24 supernatant分泌作用的抑制剂分泌作用的抑制剂Mol Ther. 2004;9(3):355-67 WBCytokine Growth Factor Rev 2003;14:3551二硫键二硫键糖基化位点糖基化位点CPNGase F: endoglycanase F endo-O: 内内-O糖苷酶糖苷酶6. 翻译后修饰翻译后修饰Overexpression, WBJ Biol Chem. 2002;277(9):7341-7 MDA-7/IL-24蛋白可被糖基化修饰蛋白可被糖基化修饰Mol Ther. 2004;9(3):355-67 glycopeptidase FL SN7.细胞内定位细胞内定位Mol Ther. 2004;9(3):355-67IFCMol Ther. 2004;9(3):355-67SNLQuantitative receptor binding analysisJ Biol Chem. 2002;277(9):7341-7 AP: Human Placental Alkaline Phosphatase293TIL-20R2, IL-20R1/IL-20R2, IL-22R1/IL-20R2结合结合AP的活性高。的活性高。8.受体受体J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7 Cell surface staining assayRT-PCRExp Dermat. 2006; 15: 9911004Cancer Biol Ther. 2003;2:S23S37RT-PCRPC NCCytokine. 2008; 41: 1623FACSIL-22R1/IL-20R2IL-20R1/IL-20R2 Immunology. 2005;114(2):166-70 Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 35513.前列腺前列腺 4.睾丸睾丸 5.卵巢卵巢 6.小肠小肠 7.结肠结肠1. mRNA表达谱：分布在人的免疫系统表达谱：分布在人的免疫系统NB二、基因功能的研究二、基因功能的研究Oncogene 2001;20:70517063.1.脾脏脾脏 2.胸腺胸腺 8.外周血白细胞外周血白细胞Cyto Gro Fac Rev. 2003;14:3551：untreated +：IFN-+ MEZ , 24 hNBOncogene. 2001; 20: 7051 7063Real-time RT-PCR在黑色素瘤恶性发展过程中，在黑色素瘤恶性发展过程中，mda-7/IL-24的的mRNA表达水表达水平逐渐降低，直至完全丧失。平逐渐降低，直至完全丧失。Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628 Kaplan-Meier survival analysisCancer Cell Inter. 2010; 10:292.蛋白水平：蛋白水平：IHCCytokine. 2008; 41: 1623类风湿关节滑膜类风湿关节滑膜NCsublining mononuclear cellsendothelial cells of blood vesselsCytokine. 2008; 41: 1623ELISA免疫系统：脾、胸腺、外周血白细胞免疫系统：脾、胸腺、外周血白细胞特定细胞：黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、特定细胞：黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、 平滑肌细胞、平滑肌细胞、 皮肤成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、 皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞 肿瘤细胞：肿瘤细胞：50多种，无内源性多种，无内源性MDA-7/IL-24蛋白表达。蛋白表达。分布：局限性分布：局限性基因在靶细胞中的过表达基因在靶细胞中的过表达AdenovirusJ Cell Physiol. 2007;210(2):549-59 CAR检测检测(Coxsackie-adenovirus receptors)FACS, WB人正常卵巢上皮细胞人正常卵巢上皮细胞卵巢癌细胞卵巢癌细胞靶细胞中重组蛋白的检测靶细胞中重组蛋白的检测Western-blot卵巢癌细胞卵巢癌细胞Mol Cancer. 2007;6(1):11Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:2052157d3.细胞活力细胞活力Crystal violet stainingCancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 TRAIL：肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体：肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体Mol Med. 2001;7(4):271-282Trypan blue exclusion assayCancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215Trypan blue exclusion assayAd.mda7能够降低细胞活力。能够降低细胞活力。特异性抑制多种肿瘤细胞生长特异性抑制多种肿瘤细胞生长4.体外抑瘤活性：细胞增殖体外抑瘤活性：细胞增殖 Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 MTT3H-thymidine AssayMol Med. 2001;7(4):271-282Cancer Res. 2006; 66(16): 8182-8191 Colony formation缺失信号肽的突变体缺失信号肽的突变体(SP-mda-7)具有抗瘤活性具有抗瘤活性Cancer Res. 2004; 64:29882993.WB, MTTMatrigel Invasion Assay, Colony formationC8161C8161Cancer Res. 2004; 64:29882993.Xenograft tumors in nude mice5.体内抑瘤活性体内抑瘤活性SW620Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37SW620Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 Xenograft tumors in nude miceIHCNo Ab1IL-24Cancer Gene Ther. 2006; 13: 10111022Subcutaneous SW620 tumors抗瘤活性源自抗瘤活性源自MDA-7/IL-24蛋白的表达蛋白的表达Mol Cancer. 2007;6(1):11 MDAH2774 tumor-bearing animal对增殖无影响对增殖无影响影响细胞增殖影响细胞增殖Mammary epithelial cells (HuMEC)Prostate epithelial cells (HuPEC)Melanocytes (NHuMel)Bronchial epithelial cells (HNBE)Fetal astrocytes (PHFA)Skin fibroblasts (MJ90)Skin fibroblasts (HF)Lung fibroblasts (NHLF)Endothelial cells (HuVEC)Renal epithelial cellsMesothelial cellsBreast carcinomaProstate carcinomaMelanomaLung cancerGlioblastoma multiformeOsteosarcomaColon carcinomaNasopharyngeal carcinomaPancreatic carcinomaCervical carcinomaOvarian carcinomaPharmacol Ther. 2006;111(3):596-628 特异性抑制多种肿瘤细胞生长特异性抑制多种肿瘤细胞生长MDA-MB453 Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215HUVECOncogene. 2002 ;21(29):4558-66 5.细胞周期分析细胞周期分析FACS使肿瘤细胞使肿瘤细胞G2/M期阻滞期阻滞Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215WB6.细胞凋亡细胞凋亡Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 FACS analysisPI stainingAnnexin V staining Mol Med. 2001; 7(4): 271282FO-1 cellsSB203580：p38MARK的抑制剂的抑制剂DNA Ladder PNAS. 2002;99:1005410059.TUNELPBSIL-24Cancer Gene Ther. 2006; 13: 10111022Subcutaneous SW620 tumors H1299 tumor-bearing animal Oncogene. 2002; 21: 4558 4566IHC, TUNEL PCR, RT-PCRIHC, TUNELTUNELMCF7Mol Med. 2001;7(4):271-282Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215Caspase3 analysisMDA-MB453人正常卵巢上皮细胞人正常卵巢上皮细胞卵巢癌细胞卵巢癌细胞caspase-3、caspase-8和和 PARP被切割被切割Mol Cancer. 2007;6(1):11 腺病毒感染结直肠癌细胞腺病毒感染结直肠癌细胞48h后后Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 肺癌细胞肺癌细胞J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59 具有剂量依赖效应具有剂量依赖效应Z-VAD.fmk: Caspase的广谱抑制剂的广谱抑制剂Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22 保护细胞免受凋亡保护细胞免受凋亡与与Bcl-2家族基因相关家族基因相关Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22刺激特定细胞凋亡刺激特定细胞凋亡参与参与caspase9活化和自切割活化和自切割腺病毒感染结直肠癌细胞腺病毒感染结直肠癌细胞48hHUVEC+Ad.mda7Positive controlNegative controlHUVEC+Ad.mda7+MatrigelOncogene. 2002 ;21(29):4558-66 Tube formation7.抗血管形成作用：抗血管形成作用：抑制内皮细胞形成管状结构抑制内皮细胞形成管状结构Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66血管内皮细胞标志物表达降低血管内皮细胞标志物表达降低H1299 tumor-bearing animals1. p38MAPK途径途径三、作用机制三、作用机制Mol Cancer. 2007;6(1):11 卵巢癌细胞卵巢癌细胞人正常卵巢上皮细胞人正常卵巢上皮细胞卵巢癌细胞卵巢癌细胞WBPKR: double-stranded RNA-activated protein kinasePNAS. 2002;99(15):10054-9 SB：p38MARK抑制剂抑制剂p38DN：p38负显性突变体负显性突变体黑色素瘤细胞黑色素瘤细胞FO-1PNAS. 2002;99(15):10054-9 NB， WBGADD：生长阻滞和：生长阻滞和DNA损伤诱导的基因损伤诱导的基因 NB， WB3dPNAS. 2002;99(15):10054-9 Antisense, MTTPNAS. 2002;99(15):10054-9 Ad.vec (white bars) Ad.mda-7 (black bars)p38 MAPK途径和途径和GADD家族成员的关系家族成员的关系PNAS. 2002;99(15):10054-92. PI3K信号途径信号途径 Mol Ther. 2003;8(2):207-19H1299/Ad.mda-7+2400 cDNA Microarray con Ad-luc Ad-mda7 H1299 con Ad-luc Ad-mda7 HUVECMol Ther. 2003;8(2):207-19WBH1299Trypan blue exclusion assayMol Ther. 2003;8(2):207-19Biotechniques. 2002; Suppl: 30 39.3.选择性诱导肿瘤细胞凋亡具有多种机制选择性诱导肿瘤细胞凋亡具有多种机制Cancer Res. 2004;64:29882993.Cancer Res. 2003;63(23):81388144.MDA-7蛋白诱导前列腺癌细胞凋亡的可能机制蛋白诱导前列腺癌细胞凋亡的可能机制Cancer Res. 2005; 65(22): 10128-10138AdMDA-7/IL-24免疫细胞免疫细胞ES/MDA-7/IL-24mAb-MDA-7/IL-24四、临床应用研究四、临床应用研究Cancer Res. 2005; 65(22): 10128-10138Cycle1 Day30期临床试验证明期临床试验证明mda-7/IL-24使用安全、有临床疗效。使用安全、有临床疗效。 1.INGN241(重组腺病毒重组腺病毒): Introgen公司公司, 期：期：28例例; 期：进行中期：进行中INGN 241 (Ad.mda-7) treatment of a melanoma metastasis in a right supraclavicular lymph node.Mol Ther. 2005；11, 1491592.Ad.mda-7/IL-24与化疗药物联合使用与化疗药物联合使用高表达：高表达：2530% 原发乳腺癌和原发乳腺癌和811% 宫颈癌宫颈癌相关性强：肿瘤的发生、发展和不良预后相关性强：肿瘤的发生、发展和不良预后抗体：抗体：4D5, trastuzumab , HerceptinHer-2: human epidermal growth factor receptor-2Her-2+转移乳腺癌转移乳腺癌30% Her-2 +有效有效 Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 FACS Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 Trypan blue exclusion stainingL=Ad-luc Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 Ad.mda-7/IL24 + Herceptin Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 Herceptin (1 and 2 mg/ml)Trypan blue exclusion stainingMCF7MDA-MB-453MDA-MB-453 Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 与与Herceptin联合使用，抗瘤效果更好，并扩大抗瘤谱。联合使用，抗瘤效果更好，并扩大抗瘤谱。 Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68 MCF-7-Her-18: Her-2-overexpressing EGFR: epidermal growth factor-receptor(EGFR-Wild type)Ad.mda-7 GefJ Cell Physiol. 2007;210(2):549-59 MTTGefitinib: an orally active selective reversible inhibitor of the EGFR tyrosine kinase.J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59 delE746-A750L858R+T790MEGFR-Wild type与与gefitinib联合使用，抗瘤效果提高。联合使用，抗瘤效果提高。J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59 sMDA-7/IL-24(1) 抑制血管内皮细胞成管能力抑制血管内皮细胞成管能力Cancer Res. 2003;63(16):5105-13 3.基因工程重组基因工程重组MDA-7/IL-24蛋白药物蛋白药物Cancer Res. 2003;63(16):5105-13 Cancer Res. 2003;63(16):5105-13 Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37裸鼠裸鼠Cancer Res. 2003;63(16):5105-13Mol Ther. 2005;11(5):724-33 MDA-MB4543Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15 具有体内抑瘤活性具有体内抑瘤活性Cancer Res. 2003;63(16):5105-13 sMDA-7/IL-24的抗瘤活性与其受体相关的抗瘤活性与其受体相关Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15 sMDA-7/IL-24能够抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导凋亡能够抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导凋亡Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15 小结：小结：Subtraction hybridizationData base analysisLuciferase assay systemEMSANB RT-PCROverexpression WBIFCAnnexin V staining MTTFACSXenograft tumors in nude mice1. 核酸的分离纯化和鉴定核酸的分离纯化和鉴定: 基因组基因组DNA、总、总RNA、质粒、质粒2. 基因的克隆与鉴定方法基因的克隆与鉴定方法3. 外源基因转移技术和表达体系外源基因转移技术和表达体系4. 检测方法：电泳技术：检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术、基因芯片技术 序列测定：序列测定：DNA、蛋白质、蛋白质 生物信息学分析生物信息学分析5. 基因功能研究的方法基因功能研究的方法6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学组学研究技术：基因组学、蛋白质组学分子生物学常用技术分子生物学常用技术1.对于一个分子生物学的关键词对于一个分子生物学的关键词/术语，你有哪些想法？术语，你有哪些想法？2.你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？3.你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反两方面说明。两方面说明。4.在分子生物学实验技术中，你掌握得最好的有哪些？最不了在分子生物学实验技术中，你掌握得最好的有哪些？最不了解的呢？最想知道的呢？请各列出三个。解的呢？最想知道的呢？请各列出三个。5.就这次课的内容，你认为还可以从哪些角度进行就这次课的内容，你认为还可以从哪些角度进行mda-7/IL-24的研究？请说明原因。的研究？请说明原因。思考题：思考题：