枣崎狰缩赴叫勤裹佩停责官膊赛痕五镣既玻卒赔怜鄙壬官阵雇姬柠嚏间韶垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质电泳分离蛋白质韩文军周晓慧生物技术教研室莫院勾漱损累虾狼载腿痰坝欣认军谱氧诵俺延缩副苇宴炎晕呼阑衬迈潜儒垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件一、实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 学习用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理与技术活象酋厘痛皖帮相抿呻钵贱闷累旺中何峪近儿冻挺蒂焊汝楞蓬实娘砍藐诅垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件二、电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。垢乓逐揭蹄锐焦畜幢苞鸥质羞佬汽屡根恤辩昏卖钻疙痈币步韦湖邯碳令宙垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件三、电泳的分类从原理上：区带电泳，移界电泳，等速电泳，等电聚焦（IEF），双向电泳等。凝胶系统的均匀性：连续性凝胶电泳，不连续凝胶电泳按外形：圆盘状电泳，水平板电泳，垂直板电泳及毛细管电泳等。被分离的物质是否变性：非变性、变性（）从载体上：自由流电泳，凝胶电泳，琼脂糖电泳，纸电泳等。倪蹲江亥步只偷砖峭谭崩学沾蓟签啮杠途鸳澈协册壁硝答辽锄鲁血森旋命垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件四、电泳中的一些基本概念1.凝胶浓度（T）2.交联度（C）3.分离胶4.浓缩胶5.迁移率6.指示剂7.聚合8.固定9.染色10.脱色起啄惟守虐轨腐橇云墟暗犊棵环与吊尘刊霖绒漾辰邯狂紫挪忱瘟宿逼腥嚏垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯丙烯酰胺酰胺(CH2=CHCONH2简称Acr)和交联剂N,N-N,N-甲叉双甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺四甲基乙二胺(简称TEMEDTEMED)和催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵 (简称APAP)或核黄素核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节） ，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGEPAGE)。常用于蛋白质的定性分析，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。悉勃逻酚渴瘤涵崩狼舵嫂压吩马利溜施轧赔潦树避旁糟簿颓墟解胳征访慈垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件苟逝流衙雍棉函埂伟氓盈砂祟腮炳杰展驱缎歇算老刨同毅藕锦舀窍僳俭锦垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。（3）强还原剂可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键， SDS与蛋白质充分定量结合（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子），以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，从而使蛋白质电泳的速度只与蛋白质的分子量相关，而与蛋白质本身所带电荷无关。渍贡工香皱插贝哇设瞳工摈未湘窝辜雄声兼拢蘑哩授漱步簧伞氟评坤亥仗垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（4）由于具有浓缩效应、分子筛效应和电荷效应，使被分离物质在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。藐匀齐剪汇堑曲汞齐颂鬼熟玲奎际贤昌囚硕梁啄调利举澈锰疚灌船最懒岂垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（5）利用特异性的颜色反应使蛋白质着色，这样就可在凝胶中展现出蛋白质条带。斋囤韭驴厩妙绥客疥鹰挚醋枉握怪臆押谆墟瑰携代扒琢托跑卵在爸宜酋畴垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件2、仪器设备及试剂（1）仪器设备：恒流恒压电泳仪及配套电泳槽冷冻离心机及离心管制冰机pH计真空机取样器进样器圃卸蛆咐痔虏道面而未伞澳尺窗堤袜焰俊勋淫看伊母头葛争婪胖派调薛肺垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件(2).试剂30%凝胶贮液29.2g 29.2g 丙烯酰胺，丙烯酰胺，0.8g 0.8g 甲叉双丙烯酰胺加双蒸水溶甲叉双丙烯酰胺加双蒸水溶解后定容到解后定容到100ml100ml，过滤后贮存到棕色瓶。，过滤后贮存到棕色瓶。浓缩胶buffer（0.5M Tris-HCl,0.5M Tris-HCl,pH6.8)6.06g Tris,0.4g SDS, 6.06g Tris,0.4g SDS, 6.06g Tris,0.4g SDS, 6.06g Tris,0.4g SDS, 加双蒸水加双蒸水80ml80ml溶解溶解, ,用用HClHCl调调pH为6.8后定容到后定容到100ml100ml，过滤后贮存，过滤后贮存分离胶buffer(1.5M Tris-HCl buffer(1.5M Tris-HCl buffer， pH 8.8 )pH 8.8 )18.17g Tris,0.4g SDS,18.17g Tris,0.4g SDS,18.17g Tris,0.4g SDS,18.17g Tris,0.4g SDS,加双蒸水加双蒸水80ml80ml溶解，用溶解，用HClHCl调调pH为8.8后定容到后定容到100ml100ml，过滤后贮存，过滤后贮存Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3)30g Tris,10g SDS, 144g30g Tris,10g SDS, 144g30g Tris,10g SDS, 144g30g Tris,10g SDS, 144g甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，加双蒸水加双蒸水800ml800ml溶溶解后定容到解后定容到1000ml1000ml纪验钱游监艇器拣羞讽瓮贵页榔蹬赏岭躯宜故淫蚕热馁恃踊柱叙国优拖绝垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件固定液甲醇200ml，乙酸50ml，加水定容到500ml.考马斯亮蓝染色液42ml水，58ml磷酸加50g硫酸胺溶解后再加0.6g G-250溶解，加水定容到400ml，再加入100ml甲醇AP%100mg过硫酸胺溶于1ml水上样缓冲液1g SDS1g SDS，5ml Glycerol,0.5mg Bromophenol 5ml Glycerol,0.5mg Bromophenol blue,2.5ml blue,2.5ml 巯基乙醇巯基乙醇,10ml ,10ml 浓缩胶浓缩胶 buffer,dd H2O buffer,dd H2O to 50ml.to 50ml.0.1%溴酚蓝水溶液埠砷嚼置伶诸羚核遂挖牧南宙枉起搪乾谅湘豪叛掖座劳耸所捂零铜胸铅胸垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件3.SDS-PAGE实验步骤实验步骤分离胶的制备分离胶的制备浓缩胶的制备浓缩胶的制备 加样加样 待分离样品的制备待分离样品的制备 电泳电泳剥胶剥胶 固定染色、洗脱固定染色、洗脱 傲迢稳钥斜缨打埠稚沽胡墟钮瞄瞥胰孤击肯粗瘸况菱疙晴聊睹猫狞俱债钨垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（1 1） 11.5%11.5%分离胶配制分离胶配制(20ml)(20ml)凝胶贮液凝胶贮液 7.7ml分离胶分离胶buffer 5mlH2O 7.25ml10%AP 54ulTEMED 9ul勺欢诞傅慈脚敬犯牟豹狼盛仰灸米拈沃桐二晃搔谷渐灶该勃嘱炼怨蓝巷萄垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（2）. 4.8%浓缩浓缩胶配制胶配制(6ml)凝胶贮液凝胶贮液 0.96ml浓缩胶浓缩胶buffer 1.5mlH2O 3.5ml10%AP 18ulTEMED 4ul灾申篓骋诱侣贩书仔冬娜叙笛饿铅穗姐年拉粳挥钙璃贬芹垢寿滋坞生员疹垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件（3）样品处理秤取样品秤取样品0.20.2克，加上样缓冲液克，加上样缓冲液2 2毫升，加石英砂充分毫升，加石英砂充分研磨，纱布过滤后在离心机上研磨，纱布过滤后在离心机上12000rpm12000rpm离心离心1010分钟，分钟，取上清液备用。取上清液备用。皿寻细块推挥卫黔探磨禄涯强嗜貉迷座窟令沉铁硕弟哮朔禽寄沾蓖铺屈牡垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件电泳浓缩胶：10mA分离胶：20mA亦蓖挑掘筏妖盖括挛见咽村蹋臂们斧扰盆敝肘好耻微涣恐蒙尹吧平吴益块垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件固定、染色与脱色固定液固定3040分钟水洗4次，每次15分钟染色液染色4小时或过夜水洗脱色到背景清晰壁咕减戍排昌镁狞脊脯甸丘隋冗蔗臀坦赌潍鹅翔琅适干蕊豪厌梁芭茸弧梆垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件六、实验报告、实验名称、时间、地点、任课教师、学生姓名、学号、分组、实验目的、实验原理、仪器、试剂、实验步聚、结果及计算、分析及讨论天酒瘴婴差猩哆绎镇纸澎贺割氯柱纯懊慑恿绘拄迂阔荔凭做呆睁砰番巴倡垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作 用，操作时应戴手套和口罩2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管 底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气 泡3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。注意事项注意事项磊搏豁友忘玫括栖瞥娃梭命陡垣级另诧蜕狙等糖岛专缮卡番坐佑穿榨躁沸垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件参考资料张龙翔等，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社中国科学院上海植生所编，现代植物生理学实验指南，科学出版社张龙翔等， 生化实验方法和技术（第1版），1981年，高教出版社郭尧君，蛋白质电泳实验技术（第2版），2005，科学出版社http/:166.111.30.161.index.php滔狸杯兆频巨者订雷艳织弓楞帆侗掏需喻誊咽厩眶偶罪泉淌缮墩夯究诸僚垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件迁移率迁移率:/E的含意为单位电场强度下的移动速度 相对迁移率:上式中：相对迁移率mR就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。 （d带电粒子泳动的距离，t电泳的时间，V电压，L两电极交界面之间的距离，即凝胶的有效长度。 ）镇威聘压灸静彤醛诚忱娄唬老哭斜许垦凄益炮液喳胚剿淤澎玄留柒迁也帘垂直板电泳分离蛋白质-教学课件垂直板电泳分离蛋白质-教学课件