脓毒症的功能基因组学与脓毒症的功能基因组学与系统生物学研究概述系统生物学研究概述1.脓毒症脓毒症（sepsissepsis）：）：指由感染引起的全身炎症反应综指由感染引起的全身炎症反应综合征（合征（SIRSSIRS），为严重感染、创伤、烧伤、休克、大手术后），为严重感染、创伤、烧伤、休克、大手术后的常见并发症，是的常见并发症，是ICUICU病人的首要死亡原因，死亡率高达病人的首要死亡原因，死亡率高达5050。主要原因：机制复杂（复杂体系）；研究方法局限。主要原因：机制复杂（复杂体系）；研究方法局限。2SIRSSIRS胰腺炎胰腺炎烧伤烧伤创伤创伤其他其他感染感染脓毒症脓毒症严重脓毒症严重脓毒症脓毒性脓毒性休克休克SIRS、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克、MODS之间的关系之间的关系3LPSLBPCD14 MAPK(ERK, JNK, p38)IKKI-BAP-1CREBNF-B胞浆胞浆MAPKKKMAPKKNF-IL6MyD88IRAKTRAF6 信号转导信号转导通路的活化通路的活化脓毒症时脓毒症时SIRSSIRS的发生机制的发生机制TLR4核膜核膜胞膜胞膜4皮质激素皮质激素内毒素抗体内毒素抗体TNF-aTNF-a抗体抗体、可溶性肿瘤坏死因子受体可溶性肿瘤坏死因子受体IL-1raIL-1ra布洛芬布洛芬免疫系统免疫系统TNF- TNF- LPSLPSIL-1IL-1花生四烯酸衍生物花生四烯酸衍生物传统的治疗传统的治疗脓毒症的治疗脓毒症的治疗5mortalitySepticshock53-63%20-53%Severesepsis750,0007-17%sepsis 2,000,000morbidityMorbidity and mortality in USA6 流行病学资料显示，脓毒症的流行病学资料显示，脓毒症的发生率和病死率呈上升趋势。全球发生率和病死率呈上升趋势。全球每年有每年有18001800万例严重脓毒症患者。万例严重脓毒症患者。据估计，我国每年脓毒症约据估计，我国每年脓毒症约300300万万例，死亡约例，死亡约100100万人。万人。7基因组基因组转录组转录组蛋白质组蛋白质组生理组生理组细胞细胞组织组织器官器官个体个体机体反应的复杂性机体反应的复杂性89一、脓毒症的功能基因组学一、脓毒症的功能基因组学（FUNCTIONAL GENOMICS）研究研究10基因组基因组(genome)指一种微生物（细菌和病毒）指一种微生物（细菌和病毒）或其它生物体细胞中总的或其它生物体细胞中总的DNADNA或或RNA(RNA(指逆转录指逆转录病毒病毒) )所含全部遗传物质。所含全部遗传物质。基因组学是研究基因组中的结构基因、调节基因组学是研究基因组中的结构基因、调节序列和非编码序列的科学。序列和非编码序列的科学。基因组学基因组学（genomics）11转录组学转录组学(TRANSCRIPTOMICS) 转录组转录组（transcriptome）即一个活的有机体（或即一个活的有机体（或器官）所能转录出来的所有器官）所能转录出来的所有mRNA，也称表达谱，也称表达谱，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。是研究细胞表型和功能的一个重要手段。 转录组学是研究转录组及其变化规律的科学。转录组学是研究转录组及其变化规律的科学。12缺血缺血- -再灌注心肌中基因表达谱的改变再灌注心肌中基因表达谱的改变13蛋白质组学蛋白质组学（PROTEOMICS）蛋白质组蛋白质组（proteome）是指一种基因组所表达的是指一种基因组所表达的全套蛋白质全套蛋白质, , 即一个有机体的全部蛋白质组成及即一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。其活动方式。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质组分及其活蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质组分及其活动规律的科学。动规律的科学。 14代谢组学代谢组学（metabolomics 或或 metabonomics） 考察生物体系受刺激或干扰前后代谢产物考察生物体系受刺激或干扰前后代谢产物图谱及其动态变化，以揭示生物体系的代谢网图谱及其动态变化，以揭示生物体系的代谢网络的科学，研究对象主要是分子量络的科学，研究对象主要是分子量1,0001,000以下的以下的内源性小分子。内源性小分子。15代谢组学具有以下优点：代谢组学具有以下优点：(1)(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平 得到放大；得到放大；(2)(2)代谢组学的研究不需进行全基因组测序或建代谢组学的研究不需进行全基因组测序或建 立大量表达序列标签立大量表达序列标签(EST)(EST)的数据库；的数据库；(3)(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目；代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目；(4)(4)生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生 理和病理状态。理和病理状态。 16 广义的相互作用组广义的相互作用组（interactome）是是指一个系统内各种分子之间相互作用的总和，包括指一个系统内各种分子之间相互作用的总和，包括蛋白质与核酸、核酸与核酸、蛋白质与蛋白质、蛋蛋白质与核酸、核酸与核酸、蛋白质与蛋白质、蛋白质与生物小分子、核酸与生物小分子、生物小分白质与生物小分子、核酸与生物小分子、生物小分子与生物小分子之间复杂的相互作用网络。相互作子与生物小分子之间复杂的相互作用网络。相互作用组学则是对这个总和的研究。狭义的相互作用组用组学则是对这个总和的研究。狭义的相互作用组是指蛋白质与蛋白质之间的相互作用。是指蛋白质与蛋白质之间的相互作用。 相互作用组学相互作用组学（interactomics）17全基因组表达谱芯片全基因组表达谱芯片单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP）芯片芯片DNA甲基化芯片甲基化芯片microRNA芯片芯片Chip-on-chip ( (染色质免疫共沉淀与芯片结合）染色质免疫共沉淀与芯片结合）二维电泳与质谱分析二维电泳与质谱分析 高通量技术高通量技术（high-throughput technologies）1819脓毒症功能基因组学研究的主要领域脓毒症功能基因组学研究的主要领域1 1、病原体的基因组学研究、病原体的基因组学研究2 2、脓毒症易感性与基因多态性研究、脓毒症易感性与基因多态性研究3 3、脓毒症的转录组学研究、脓毒症的转录组学研究4 4、脓毒症的蛋白质组学研究、脓毒症的蛋白质组学研究5 5、脓毒症的相互作用组学研究、脓毒症的相互作用组学研究6 6、脓毒症的代谢组学研究、脓毒症的代谢组学研究201 1、病原体基因组学研究、病原体基因组学研究随着基因组测序技术的进步，许多病原体的基因组测序得以完成，随着基因组测序技术的进步，许多病原体的基因组测序得以完成，并建立了一系列的数据库，这对于揭示病原微生物的毒力因子及其致病并建立了一系列的数据库，这对于揭示病原微生物的毒力因子及其致病机制，揭示病原体与宿主的相互作用关系，具有重要意义。机制，揭示病原体与宿主的相互作用关系，具有重要意义。病原体基因组数据库及其网址病原体基因组数据库及其网址21http:/www.nmpdr.org22Gene name and/or descriptionFold increase or decrease and P valuea in:BloodCerebrospinal fluidEpithelial cell contactFold changPFold changePFold changPblpU3.1 3E-07cps4A2.2 2E-03cps4C3.9 2E-12pspA3.4 2E-0450.3 1E-084.0 1E-04cbpJ3.6 9E-07cbpF2.3 2E-03blpK2.5 3E-06blpYNA NA-16.8 8E-13NA NAprtA15.5 7E-069.8 8E-133.3 1E-02lmb3.4 2E-05 5.2 1E-09pln5.6 5E-069.8 3E-03lytA7.6 9E-13chpDNA NA12.0 2E-12htrANA NA8.2 4E-05DNADNA芯片分析肺炎球菌的毒力因子在宿主不同部位的差异表达芯片分析肺炎球菌的毒力因子在宿主不同部位的差异表达 （Orihuela CJ, Infect Immun. 2004.）232 2、脓毒症易感性与基因多态性、脓毒症易感性与基因多态性(polymorphism)单个核苷酸多态性单个核苷酸多态性 (SNPs) ：是指在基因组水平上由单个核苷是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的酸的变异所引起的DNADNA序列多态性，在人群中出现的频率序列多态性，在人群中出现的频率1%1%24TNF启动子区启动子区-308位位GASNP与脓毒性休克的发与脓毒性休克的发生及其严重性有关生及其严重性有关（ Mira JP，JAMA，1999 ）polymorphism frequenciescontrol18%Septic shock39%Death group with Septic shock52%Survival group with Septic shock24%251.1.模式识别受体及其相关蛋白模式识别受体及其相关蛋白 (1). CD14(1). CD14：-159 C/T-159 C/T位点，位点，-159 T-159 T等位基因与等位基因与脓毒症的易感性、病死率、毒症的易感性、病死率、 TNFTNF和和IL-6IL-6水平升高及水平升高及IL-10IL-10水平降低有关（水平降低有关（Shock, 2007Shock, 2007，28(2):148-153)28(2):148-153) (2). MD-2: -1625 CG (2). MD-2: -1625 CG与与严重重创伤患者并患者并发脓毒症和毒症和MOFMOF密切相关（密切相关（Ann Ann Surg, 2007, 246(1): 151-8)Surg, 2007, 246(1): 151-8) (3). Toll (3). Toll样受体（受体（TLRTLR）家族：）家族：TLR4TLR4，+896AG+896AG，+1196C T+1196C T等位基因人群患等位基因人群患G G- -菌菌脓毒症和毒症和脓毒性休克的毒性休克的风险性升高（性升高（Clin Med Res, 2006, 4(4): 250-Clin Med Res, 2006, 4(4): 250-5)5)2.2.细胞因子及其受体细胞因子及其受体 (1). TNF: -308G A(1). TNF: -308G A (2). IL-1: -889C/T (2). IL-1: -889C/T ，等位基因，等位基因C C与与IL-1IL-1高表达相关高表达相关 (3). IL-1(3). IL-1受体相关激受体相关激酶（IRAL-1IRAL-1）的）的SNPSNP可以影响可以影响脓毒症的毒症的预后后（Am J Respir Crit Care Med. 2006. 173:1335） 与脓毒症风险性密切关联的基因多态性位点与脓毒症风险性密切关联的基因多态性位点263 3、脓毒症的转录组学（基因表达谱）研究、脓毒症的转录组学（基因表达谱）研究 采用采用DNADNA芯片分析芯片分析大鼠盲大鼠盲 肠结扎穿刺的脓毒症模型肠结扎穿刺的脓毒症模型 中各组织的基因表达。中各组织的基因表达。（Am J Pathol 2001, 159:1199）2728脓毒症猩猩肺组织的基因表达谱研究。通脓毒症猩猩肺组织的基因表达谱研究。通过比较不同时间点肺组织基因表达谱的改过比较不同时间点肺组织基因表达谱的改变，发现一些与天然免疫、凋亡相关的基变，发现一些与天然免疫、凋亡相关的基因在因在2 2小时就增高达峰值；而具有激活单小时就增高达峰值；而具有激活单核细胞、自然杀伤细胞和核细胞、自然杀伤细胞和T T细胞作用的基细胞作用的基因多在因多在8 8小时达峰值；与细胞粘附相关的小时达峰值；与细胞粘附相关的基因上调较晚基因上调较晚 ，多在，多在2424小时达高峰。小时达高峰。 （BMC Genomics. 2007BMC Genomics. 2007，8 8：5858 ）294 4、脓毒症的蛋白质组学研究、脓毒症的蛋白质组学研究（1 1）组织器官蛋白质组研究）组织器官蛋白质组研究（2 2）尿液蛋白质组研究）尿液蛋白质组研究（3 3）血清蛋白质组研究）血清蛋白质组研究30烧伤合并脓毒症的小鼠骨烧伤合并脓毒症的小鼠骨骼肌蛋白质组研究发现了骼肌蛋白质组研究发现了1717个差异蛋白点，主要集个差异蛋白点，主要集中在伴侣蛋白和能量代谢中在伴侣蛋白和能量代谢蛋白蛋白（Biochem J，2006, 397: 149）31内毒素血症小鼠肝脏线粒体蛋白质组研究发现内毒素血症小鼠肝脏线粒体蛋白质组研究发现ATPATP合酶合酶链和超氧化物链和超氧化物岐化酶表达增高，提示内毒素血症时线粒体存在代偿反应。绿色的点岐化酶表达增高，提示内毒素血症时线粒体存在代偿反应。绿色的点代表代表LPSLPS处理组，红色的代表对照组，黄色为绿色与红色中间的过渡色。处理组，红色的代表对照组，黄色为绿色与红色中间的过渡色。 （FEBS Lett. 2006, 580: 1257）32脓毒症（脓毒症（CLPCLP）所致急性）所致急性肾衰大鼠尿液蛋白质组肾衰大鼠尿液蛋白质组研究发现，研究发现，ARFARF组尿液中组尿液中白蛋白升高，氨基肽酶白蛋白升高，氨基肽酶升高，丝氨酸蛋白酶抑升高，丝氨酸蛋白酶抑制物下降。这些蛋白质制物下降。这些蛋白质可作为脓毒症急性肾损可作为脓毒症急性肾损伤的生物标志物。红色伤的生物标志物。红色代表在代表在ARFARF中增多的蛋白，中增多的蛋白，绿色代表减少的蛋白，绿色代表减少的蛋白，黄色代表未发生改变的黄色代表未发生改变的蛋白。蛋白。（Kidney Int，2006, 70: 496）33脓毒症患者死亡与存活组血清蛋脓毒症患者死亡与存活组血清蛋白质组存在差异，发现白质组存在差异，发现6 6个差异蛋个差异蛋白质点。白质点。 （Annesth Analg. 2006, 103: Annesth Analg. 2006, 103: 15221522）34未去除清蛋白未去除清蛋白去除清蛋白去除清蛋白4hSham4hCLP24hCLP24hSham2 24 4h h S Sh ha am m2 24 4h h C CL LP PWithoutPNGaseWithPNGaseCLPCLP小鼠血清蛋白质组研究发现小鼠血清蛋白质组研究发现3030个差异表达蛋白点，利用个差异表达蛋白点，利用N-N-糖酰胺酶糖酰胺酶F F去除去除N-N-连接寡连接寡糖后发现脓毒症时蛋白质的糖后发现脓毒症时蛋白质的N-N-糖基化发生改变。糖基化发生改变。（J Proteome Res. 2007, 6:2812）35365 5、脓毒症的相互作用组学研究、脓毒症的相互作用组学研究（1 1）人类、果蝇、线虫蛋白质相互作用组研究）人类、果蝇、线虫蛋白质相互作用组研究（2 2）LPSLPS所致炎症反应的相互作用组研究所致炎症反应的相互作用组研究37（Science. 302, 2003）果蝇蛋白家族与人果蝇蛋白家族与人类疾病相关直系同类疾病相关直系同源蛋白网络图源蛋白网络图（Science. 302：5651, 2003）38蛋白质相互作用的亚蛋白质相互作用的亚细胞定位。细胞定位。（Science，2003, 302: 5651）39秀丽线虫蛋白质秀丽线虫蛋白质相互作用网络图相互作用网络图（ Science，2004 , 303: 5657）40采用采用LPSLPS刺激人巨噬细胞，收集其转录组、转录因子的表达、启动子结构三部分信息并对三部分信刺激人巨噬细胞，收集其转录组、转录因子的表达、启动子结构三部分信息并对三部分信息进行整合，绘制了巨噬细胞受息进行整合，绘制了巨噬细胞受LPSLPS刺激后活化机制的相互作用网络图，找出刺激后活化机制的相互作用网络图，找出4 4个关键的转录因子个关键的转录因子（Nrf-2Nrf-2，Atf-3Atf-3，Ets-1, Irf-1)Ets-1, Irf-1)；并对整体网络进行分割，整合前人的实验结果及数据库资料按；并对整体网络进行分割，整合前人的实验结果及数据库资料按刺激时间的先后绘制出刺激时间的先后绘制出2020个个“subnetworksubnetwork”（Cell Immunol 244:105, 2006；Genomics 88:133, 2006）41二、脓毒症的系统生物学二、脓毒症的系统生物学（SYSTEMS BIOLOGY）研究研究42物理学物理学 物理现象的观测物理现象的观测生命现象的观测生命现象的观测数学的描数学的描述述？物理学的物理学的描述描述数学的描述数学的描述FmaE=MC2生命科学生命科学生物学的生物学的描述描述经经验验阶阶段段理理性性阶阶段段经经验验阶阶段段理理性性阶阶段段43系统生物学概念系统生物学概念系统生物学系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、分（基因、mRNAmRNA、蛋白质等）的、蛋白质等）的构成构成及其在特定条及其在特定条件下的件下的相互关系相互关系的科学。它不同于以往的实验生物的科学。它不同于以往的实验生物学学仅关心个别的基因和蛋白质，而要研究所有基仅关心个别的基因和蛋白质，而要研究所有基因、所有蛋白质、所有组分间的所有相互关系。系因、所有蛋白质、所有组分间的所有相互关系。系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。 Leroy Hood ，200144系统生物学的灵魂系统生物学的灵魂整合整合 1. 1. 系统内不同性质的构成要素（基因、系统内不同性质的构成要素（基因、mRNAmRNA、蛋白质、蛋白质、 生物小分子等）的整合；生物小分子等）的整合； 2. 2. 从基因到细胞、组织、个体的各个层次的整合；从基因到细胞、组织、个体的各个层次的整合； 3. 3. 研究思路和方法的整合。研究思路和方法的整合。 系统生物学的基础系统生物学的基础信息信息系统生物学的钥匙系统生物学的钥匙干涉干涉 1.1.干涉要有系统性；干涉要有系统性； 2.2.干涉能力需要高通量。干涉能力需要高通量。系统生物学三要素系统生物学三要素45基因组学基因组学转录组学转录组学蛋白质组学蛋白质组学代谢组学代谢组学为疾病的诊治提供新思路，新方法为疾病的诊治提供新思路，新方法系统生物学系统生物学相互作用组学相互作用组学46Nature. Vol 437:1032, 2005系统生物学研究举例：接受内毒素注射的志愿者白细胞系统生物学研究举例：接受内毒素注射的志愿者白细胞基因表达的时程改变及其相互作用网络基因表达的时程改变及其相互作用网络CalvanoCalvano等采用基因芯片检测接受内毒等采用基因芯片检测接受内毒素注射的志愿者白细胞基因表达的时素注射的志愿者白细胞基因表达的时程改变，并从中选择代表性基因。程改变，并从中选择代表性基因。47 根据前人的研究结果和各种蛋白质数据库、相互作用数根据前人的研究结果和各种蛋白质数据库、相互作用数据库，把人白细胞受据库，把人白细胞受LPSLPS刺激后表达发生改变的基因以及这些基刺激后表达发生改变的基因以及这些基因的相互作用进行汇总，从本实验中选择出因的相互作用进行汇总，从本实验中选择出292292个代表性基因，个代表性基因，并根据数据库存在的与这些基因有关的相互作用，构建了一个并根据数据库存在的与这些基因有关的相互作用，构建了一个典型的典型的“代表性基因和相互作用网络代表性基因和相互作用网络”支撑的炎症细胞模型，支撑的炎症细胞模型，同时按时间先后绘制出具有不同表达改变的同时按时间先后绘制出具有不同表达改变的“时间网络模型时间网络模型”。 Nature，437: 1032, 200548 随后根据数据库和芯片结果选择与内毒素血症相关并且彼此间具有相互作用的随后根据数据库和芯片结果选择与内毒素血症相关并且彼此间具有相互作用的12141214个基因个基因绘制了大的炎症网络，并从中选择绘制了大的炎症网络，并从中选择342342个具有高密度相互作用的基因进行功能亚群分类，绘制了个具有高密度相互作用的基因进行功能亚群分类，绘制了9 9个个“细胞功能基因网络模块细胞功能基因网络模块”，从而能更直观以网络的形式宏观地观察内毒素血症过程中基因功能的，从而能更直观以网络的形式宏观地观察内毒素血症过程中基因功能的改变及相互之间的关系。比如框改变及相互之间的关系。比如框1-91-9分别代表线粒体呼吸链复合体分别代表线粒体呼吸链复合体I I基因群、线粒体呼吸链复合体基因群、线粒体呼吸链复合体IIII基因群、基因群、ATPATP合酶复合体基因群、丙酮酸脱氢酶复合体基因群、线粒体通透孔复合体基因群、延伸合酶复合体基因群、丙酮酸脱氢酶复合体基因群、线粒体通透孔复合体基因群、延伸起始因子复合体基因群、核糖体蛋白基因群、起始因子复合体基因群、核糖体蛋白基因群、COP9COP9信使体基因群和蛋白酶体基因群。信使体基因群和蛋白酶体基因群。 Nature. Vol 437:1032, 200549脓毒症发生机制及治疗的系统生物学研究脓毒症发生机制及治疗的系统生物学研究动物模型临床病人生理参数血清白细胞蛋白质组基因组microRNA组转录因子谱系统生物学分析从系统水平揭示脓毒症的发生机制多靶点干预方案设计50 功能基因组学的研究拓宽了脓毒症的研究思路，功能基因组学的研究拓宽了脓毒症的研究思路，革新了脓毒症的研究策略，使之从革新了脓毒症的研究策略，使之从对个别基因或蛋白对个别基因或蛋白质的质的“垂直型研究垂直型研究”发展到同时研究成千上万个基因发展到同时研究成千上万个基因或蛋白的或蛋白的“水平型研究水平型研究”。但是所获海量信息并不能。但是所获海量信息并不能完全揭示脓毒症发病学的核心和本质完全揭示脓毒症发病学的核心和本质； 采用功能基因组学和系统生物学方法相结合有助采用功能基因组学和系统生物学方法相结合有助于进一步阐明脓毒症的发生机制；于进一步阐明脓毒症的发生机制； 目前蛋白质组学技术相对落后，相互作用组研究目前蛋白质组学技术相对落后，相互作用组研究具有较多假阳性，相互作用、路径、代谢组数据库尚具有较多假阳性，相互作用、路径、代谢组数据库尚不够完善，系统生物学研究软件仍然缺乏，脓毒症的不够完善，系统生物学研究软件仍然缺乏，脓毒症的系统生物学研究刚刚起步，许多问题有待生物医学家、系统生物学研究刚刚起步，许多问题有待生物医学家、数学家和计算机科学家去进一步探索。数学家和计算机科学家去进一步探索。结束语结束语5152THANKS!53