siRNAsiRNAsiRNAsiRNA干预树突状细胞干预树突状细胞干预树突状细胞干预树突状细胞CD40CD40CD40CD40分子表达分子表达分子表达分子表达的实验研究的实验研究的实验研究的实验研究 AStudyofsiRNAoninhibitingtheExpressionofDendriticCellCD40吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 - - 消化内科消化内科 杨杨2012.042012.04IBDIBD的发病机制的发病机制实验内容实验内容实验结果实验结果讨论讨论结论结论吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院炎症性肠病炎症性肠病炎症性肠病炎症性肠病（InflammatorybowldiseaseInflammatorybowldisease IBD IBD）IBD是临床常见的肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative co1itis, UC）和克罗恩病（Crohn,s disease，CD）两大类。IBD的发病机制可以概括为：1、环境因素；2、遗传因素；3、感染因素；4、免疫耐受。IBD的治疗：1、常规治疗；2、免疫调节治疗；3、生物调控等。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院IBD的发病机制的发病机制IBDIBD的发病机制的发病机制- -环境因素环境因素随着社会的发展，全球IBD的发病率呈明显的上升趋势，首先出现在社会经济高度发达的北美、北欧，继而发生在西欧、南欧，最近才是日本、南美。这种变化产生的主要原因大都是环境因素的改变所导致，大量研究表明，许多看似无关的环境因素，诸如吸烟、饮食、药物、地理环境、社会地位、应激、肠道固有菌群、肠粘膜的渗透性和阑尾切除等这些因素在不同程度上与IBD息息相关。目前公认的假说认为：环境变得越来越清洁，导致儿童期肠道免疫系统接受的外源刺激减弱，由于早年形成的“免疫耐受”不完善，其对肠道抗原刺激发生的免疫反应的自身调节就容易发生障碍，故出现IBD发病率逐渐上升。 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 环境因素环境因素IBDIBD的发病机制的发病机制- -遗传因素遗传因素家族聚集性和种族差异性：IBD患者一级亲属发病率，明显高于普通人群。 基因：全基因组相关研究(GWAS)已展开，且成为IBD研究的主要手段。 阳性家族史：IBD遗传因素中遗传易感性最为重要，其中阳性家族史是最大的“危险因子”IBD不仅是多基因病，而且也是遗传异质性疾病，患者在一定的环境因素作用下因遗传易感而最终发病。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院遗传因素遗传因素 IBDIBD的发病机制的发病机制- -感染因素感染因素微生物致病性的观点认为IBD(特别是CD)针对自身正常肠道菌群丛的异常免疫反应引起的。其证据为：CD病变的部位在肠菌浓度最高的末回与结肠。CD患者粪便转流术使炎症减轻，复原后炎症加重。各种动物实验要有细菌定植才发生结肠炎症，隔离的肠攀导入细菌可出现早期IBD的表现。临床上应用抗生素和微生态制剂有一定的临床疗效。感染与IBD的关系：肠道感染可以与IBD类似。感染比IBD更常见。感染使IBD的病程变得更加复杂。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 感染因素感染因素IBDIBD的发病机制的发病机制- -免疫耐受免疫耐受免疫调节细胞 。人类防御素。抗原呈递细胞 。人类白细胞抗原 。自身抗体因素 。Chemerin和脂联素 。吉林大学第二临床医院吉林大学第二临床医院 免疫耐受免疫耐受IBDIBD的发病机制的发病机制- -免疫耐受免疫耐受肠道粘膜免疫反应的激活是导致IBD发生、发展和转归过程的直接原因。免疫调节T细胞，能够产生各种细胞因子，引起并逐步放大粘膜炎症，形成肉眼和镜下的IBD病理及临床表现。经典的“双信号模式”即免疫应答的启动、发展过程中，T细胞的活化需要两个信号。其中第二信号即协同刺激信号，它能够促进T细胞的克隆、细胞因子的分泌及产生效应。CD40/CD40L即第二信号，它属于 TNF-TNF受 体 超 家 族 ， 通 过 干 预 调 节CD40/CD40L会有助于IBD的治疗。 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 免疫耐受免疫耐受IBDIBD的发病机制的发病机制Sands概括了近10年IBD发病机制研究的标志性成果：(1)肠道免疫耐受控制着生理性炎症；(2)肠道菌群在IBD发病中起着关键作用；(3)用基因动物模型显示遗传免疫和黏膜屏障的多种紊乱形成IBD的各种亚型；(4)NOD2与CD的发生密切相关，且与天然免疫缺陷有关；(5)新生物技术快速发展，研制出多种新的生物治疗药物；(6)TNF单抗对CD与UC产生较好疗效。 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院IBD的发病机制IBDIBD的干预与治疗的干预与治疗常规治疗：1、支持治疗；2、常规药物治疗；3、手术治疗。免疫调节治疗。生物调控：1、免疫调控-抗TNF-抗体英夫利昔(Infliximab) 、胸腺肽；2、RNAi干预治疗。阻断CD40途径用于IBD的治疗及展望 。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 IBD的治疗实验材料与方法实验材料与方法siRNA的设计与合成pHL-CD40真核表达载体的构建 感受态细胞的制备 重组质粒的提取免疫磁珠分离DCs 总RNA的提取、cDNA的逆转录 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验内容实验内容实验材料与方法实验材料与方法磷酸钙法瞬时转染CD40分子 “Western blot、PCR”法检测树突状细胞CD40蛋白质及mRNA的表达统计学分析 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验内容实验内容实验研究的目的及意义实验研究的目的及意义实验研究的目的及意义实验研究的目的及意义阐明CD40在IBD中的作用确定siRNA的高效性通过RNAi干预CD40分子的表达治疗IBD的动物实验与临床研究奠定了理论基础。从而为IBD的治疗提供新的途径吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院实验内容实验内容实验结果实验结果实验结果实验结果吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果实验结果1 (se n se）： 5 -G A TCCG CTG TG A A G A TCA G A A G CTTTCA A G A G A A G C T T C T G A T C T T C A C A G C T T A - 3；(antisense)： 5- AGCTTAAGCTGTGAAGATCAGAAGCT TCTCTTGAA A G C T T C T G A T C T T C A C A G C G - 3;2 (sen se)： 5-GATCC GATCCTGTGGAGATAGAAG TTCAAGAGA C T T C T A T C T C C A C A G G A T C T T A - 3；(antisense)： 5- AGCTT AAGATCCTGTGGAGATAGAAG TCTCTTGAA C T C T AT C T C C AC AGGAT C G- 3。 CD40基因的siRNA cDNA序列 1根据GenBank提供的大鼠CD40基因序列(NM134360)，按照siRNA的设计原则，利用Ambion公司提供的网上在线设计工具(wwwambioncom/techlib/misc/psilencercon-verterhtm1)2根据RNA干涉载体pSilencer4.1-CMV neo的要求分别于上、下游引入BamH I和Hid酶切位点。构建siRNA表达质粒，合成正义、反义RNA片段各两条，每段各设计一对55个碱基的序列 。经北京华大基因测序成功高效干涉载体双酶切鉴定高效干涉载体双酶切鉴定 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析Marker ：DL20001.双酶切鉴定重组表达高效载体pSilencer及干涉片段siCD40-1的构建情况2.空白组3.双酶切鉴定重组表达高效载体pSilencer及干涉片段siCD40-2的构建情况 图1高效干涉载体双酶切鉴定吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析pHL-CD40pHL-CD40真核表达载体的构建真核表达载体的构建根据大鼠CD40基因的编码区序列设计引物，并在上、下游引物中分别引入Bgl和EcoRI限制性内切酶酶切位点。上、下游引物序列分别为： 5-CCGAATTCATGAACGGAAGAGTG-3 5-CGGATCCTCAAGTTGTCTTAGTC-3以大鼠cDNA文库为模板，通过进行PCR扩增。所得PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。 CD40CD40CD40CD40基因的钓取基因的钓取基因的钓取基因的钓取 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析M：DL2000Marker1.目的片段扩增的CD40的cDNA图2PCR产物的电泳检测pHLpHLpHLpHL真核表达载体的制备真核表达载体的制备真核表达载体的制备真核表达载体的制备 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析M：HindMarker1.酶切pHL片段2.pHL载体图3 CD40 cDNA的pHL质粒的电泳检测将本实验室保存的pHL质粒转化感受态大肠杆菌DH5，提取质粒，并进行酶切鉴定pHL-CD40pHL-CD40重组表达载体的构建重组表达载体的构建 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析图4 pHL-CD40重组质粒酶切鉴定M：DL2000Marker1.2.pHL-CD40重组质粒用Bgl和EcoRI双酶切将pHL载体及CD40的PCR产物cDNA片段分别用Bgl和EcoRI进行双酶切，回收CD40片段及pHL酶切片段，进行连接并转化大肠杆菌DH5，提取质粒进行重组质粒的酶切鉴定。 Western blotWestern blotWestern blotWestern blot检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞CD40CD40CD40CD40分子蛋白表达的影响分子蛋白表达的影响分子蛋白表达的影响分子蛋白表达的影响1.制备细胞裂解液2.SDS-PAGE电泳分离及电转移:siRNA转染DC40配置48h后，经12SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶粉的杂交袋中，37.0，封闭1小时，一抗(兔抗鼠CD40多克隆抗体1：1000)4孵育过夜，TBST洗膜10min3次，二抗(HRP-羊抗鼠IgG 1：5000)室温孵育1h，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，扫描并计算光密度值。进行发光检测。每组样本各重复实验3次，计算平均值和标准差。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果实验结果Western blotWestern blotWestern blotWestern blot检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞CD40CD40CD40CD40分分分分子蛋白表达的影响子蛋白表达的影响子蛋白表达的影响子蛋白表达的影响 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析图5 免疫印迹法检测转染后的树突状细胞CD40分子的蛋白表达水平 A.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pHL-CD40，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为内参。 B.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pSilencer-CD40-1，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为内参。C.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pSilencer-CD40-2，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为内参。PCRPCRPCRPCR检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞CD40CD40CD40CD40分子分子分子分子mRNAmRNAmRNAmRNA表达的影响表达的影响表达的影响表达的影响1.收集处对数长期细胞，提取各组细胞总RNA，反转录为cDNA。2.具备PCR反应条件。3.PCR产物通过电泳鉴定，使用凝胶成像分析系统分析，来描述mRNA相对的表达量。每组样本各重复实验3次，计算平均值和标准差。 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院结果与分析实验结果与分析实验PCRPCRPCRPCR检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞检测树突状细胞CD40CD40CD40CD40分子分子分子分子mRNAmRNAmRNAmRNA表达的影响表达的影响表达的影响表达的影响 吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 实验结果与分析实验结果与分析图6 PCR检测过表达重组质粒pHL-CD40和干涉重组质粒pSilencer-CD40-1的转染对树突状细胞CD40分子mRNA表达的影响1.树突状细胞转染过表达重组质粒pHL-CD40，提取总RNA，逆转录成cDNA后PCR检测CD40分子mRNA表达情况。2.没进行转染的空白对照组。3.树突状细胞转染干涉重组质粒pSilencer-CD40-1，提取总RNA，逆转录成cDNA后PCR检测CD40分子mRNA表达情况。GAPDH为内参。讨论讨论讨论讨论1.如 何 成 功 构 建 了 RNA干 涉 表 达 载 体pSilencer-CD40及RNAi的技术特点。2.阐述CD40分子在IBD中的作用。吉林工程技术师范学院 讨论讨论结论结论结论结论通过本实验证实RNAi干预技术能够有效的干预大鼠树突状细胞CD40分子的表达。试验组较对照组CD40分子的mRNA表达量下调了57.21%。蛋白表达亦明显降低，抑制率为60%（P0.05），差异有统计学意义。这一结果为IBD RNA干预治疗的动物实验及临床应用奠定了实验基础 。吉林工程技术师范学院吉林工程技术师范学院 结论结论谢 谢！