第五章 酶反应工程5.1 酶反应动力学l讨论酶催化反应速度问题，研究各种因素对反应速度的影响，提出从反应物到产物之间可能进行为历程。l它遵守化学反应动力学的一般规律，但又有其自身特点.l 酶催化反应体系很复杂，且影响酶反应的因素很多，包括底物浓度、酶浓度、产底物浓度、酶浓度、产物、物、pH、温度、抑制剂和激活剂等。、温度、抑制剂和激活剂等。 发展概况l1902年Henri和Brown分别提出了酶促反应中酶-底物络合物生成，并推出数学公式。l1913Michaelis和Menten推导出单底物动力学模型。l1925年Briggs和Haldane引入恒态概念，解释动力学性质。l1965年Monod,Wyman和changeus建立了变构酶动力学模型。一、单底物酶促反应动力学l1 Michaelis-Menten快速平衡学说三点假说 E+PEP(ES)这一逆反应忽略不计。当测量初速度时，底物S消耗很少，此时P0，所以可忽略k-2(通常认为底物浓度消耗5之内的速度为初速度)。 当SE，即底物浓度S显著超过酶浓度E时，则ES形成不会明显降低底物浓度S,底物浓度S以起始浓度计.酶E和底物S结合成ES的速度显著快于ES形成P+E的速度，也就是说在可逆反应初速度测定时间内，E+S ES已达到平衡。米氏方程1Ks=k-1/k1为ES的解离常数，Vm为最大速度2. Briggs-Haldane稳态学说l当k2k-1时快速平衡不一定能成立。l在反应进行一段时间后，在一定时间内尽管E、P不断交化，中间物也在不断生成与分解，但当中间物的生成、分解速度接近相等，它的浓度变化很小时，这种状态叫做稳态。米氏方程23 米氏方程的意义a.当v=1/2Vm时,1/2Vm=VmS/(Km+S)Km=SKm为反应速度为最大反应速度一半时的的底物浓度.单位为摩尔/升。b.Km值是酶的特征常数之一，在特定条件下只与酶的性质有关与酶的浓度无关。c.同一种酶底物不同Km也不同。Km最小的底物为最适底物或天然底物。d.Km值受pH,温度等条件影响。因此测定Km值时需指明测定的条件。e.Ks是ES的解离常数，用于表示酶与底物的亲和力，Ks越小与底物亲和力越大。Km通常也可表示与底物的亲和力1) Km的意义酶 底物 Km蔗糖酶 糖蔗 2.8X10-2蔗糖酶 棉子糖 35X10-2麦芽糖酶 麦芽糖 2.1X10-12)k2的意义(kcat,酶的转换数Turnover Noumber)lv=k2ES,当SE时底物与酶完全结合,ES=E0,反应速度达到最大，v=Vm，所以Vm=k2E0,k2=Vm/E0,单位1/sl反映了酶催化中间复合物转变为产物的能力。其值越大表示酶的催化效率越高。3）反映了反应速度与底物浓度的关系。lV=VmS/(Km+S) 当SKm时，V=Vm，达到最大反应速度。并与底物浓度无关。当SKm时v= Vm=k2E0,即v正比于酶的初始浓度。这可用于酶活测定。因此测定这可用于酶活测定。因此测定酶酶 活时底物浓度应过量。活时底物浓度应过量。4 Km与Vm的求取l1Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）l即：1/v=(Km/Vm)(1/S)+1/ Vm用1/v对1/S作图可得一条直线，截距为1/Vm，斜率为Km/Vm,即可求得Vm及Km.l缺点是误差较大，主要是因为在低底物浓度时取倒数误差较大。2、Langmuir作图法lS/v=Km/Vm+S/Vml以S/v对S作图得一直线，截距为Km/Vm,斜率为1/Vml优点数据分布均匀。二、温度对酶反应速度的影响。l1、温度升高反应速度通常开始增加，到一最大值后开始快速下降。有一最适温度。l2、反应速度升高的原因是反应物能量增加，单位时间内有效碰撞次数增加。l3、降低的原因是酶蛋白的变性。三pH对反应速度的影响lpH可以改变酶的酶蛋白的空间构象，引起酶发生可逆或不可逆的变性而失活；lpH改变会影响底物分子,酶分子活性部位,中间产物ES的解离状态,总之都会影响ES的形成，从而降低酶活性；lpH的改变影响分子中另一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活性中心构象有关；四、抑制剂对酶反应速度的影响l凡能降低酶催化反应速度的物质都称为抑制剂。l抑制剂与酶的活性中心或辅基结合，影响其结构与性质从而影响酶反应速度。l对酶有一定的选择性，只能引起一类或几类酶的抑制，不包括使酶水解及变性的物质。分类l可逆抑制作用：可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合以解离平衡为基础，形成非共价结合，可通过物理方法除去酶抑制剂而使酶复活。l不可逆抑制作用：不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团形成共价键，一经结合就很难自行分解，不能用透析、超滤等物理方法去除。(一) 可逆抑制动力学p214-216竟争性: 抑制剂与底物竟争和酶 的结合非竟争性:抑制剂与底物和酶的结合互不干扰反竟争性:抑制剂只能与酶与底物络合物结合线性混合:非竟争性特例1 竟争性抑制作用动力学方程Ki为EI复合物的解离常数意义lKm比Km大,说明加了抑制剂后酶与底物的亲和力减小了.I愈大,Ki愈小抑制作用越强.竟争性抑制影响特点特点:反应速度下降但底反应速度下降但底物浓度足够大时都能达到物浓度足够大时都能达到相同的最大反应速度相同的最大反应速度2、非竟争性抑制作用l只影响只影响Vm而不影响而不影响Km。所用的抑制剂。所用的抑制剂越多，越多，Ki越小越小Vm下下降越多，对反应抑制降越多，对反应抑制程度越大。底物多少程度越大。底物多少并不影响抑制作用。并不影响抑制作用。l最大反应速度下降，最大反应速度下降，Km不变不变3 反竟争性抑制作用lKm与与Vm都下降都下降Vm,Km都变小三种可逆模式小结类型 Vmax Km无抑制剂 Vmax Km竟争性 不变 增大非竟争 变小 不变反竟争 变小 变小(二) 底物抑制底物抑制的可能机理l由于底物浓度过高时，2个或2个以上的底物分子分别占据了部分的活性位点，形成死端复合物。l过量的底物分子类似于反竞争性抑制。例:O2C | CH2 | CH2 |O2C琥珀酸脱氢酶 -O2C | CH | CH | -O2C当底物浓度过高时O2CCH2CH2CO2O2CCH2CH2CO2(三） 产物抑制l例:葡萄糖-6-磷酸对己糖激酶，ATP对丙酮酸激酶的抑制皆属此类。l在酶反应中，产物在释出之前可以和酶以复合物复合物(EP)的形式存在。l产物可占领酶分子上的特殊位点，导致酶的催化速度下降。类似于竞争性抑制和非竞争性抑制，I换成P。五、激活剂对酶反应速度的影响l 激活剂是指能加快某种酶反应速率的物质，它们的作用与抑制剂相反。其中大部分是离子或简单的有机化合物。离子的激活作用可能有以下三种机理：l (1)与酶分子肽链上的侧链基团相结合，稳定酶催化作用所需的构型。l (2)作为底物(或辅酶)与酶蛋白之间联系的桥梁。l (3)协助酶的催化作用。5.2 固定化酶反应动力学l大多数酶在固定化后反应速度有所下降。主要原因有：酶构象改变立体障碍微扰效应：载体的性质引起酶微环境变化分配效应: 产生浓度梯度扩散限制5.3 酶反应器酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量回本章目录5.3.1酶反应器的特点与类型型式操作方式均相酶反应器搅拌罐超滤膜反应器分批、半分批分批、半分批连续固定化酶搅拌罐固定床流化床膜反应器鼓泡塔分批、半分批 连续连续分批、连续连续分批、半分批连续一、游离酶反应器游离酶反应器 1搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器(stirred tank reactor，STR) ：其基本结：其基本结构由容器、搅拌器及保温装置组成。有时也可在容器壁上装上挡构由容器、搅拌器及保温装置组成。有时也可在容器壁上装上挡板，以促进反应物的混合。其结构如下：板，以促进反应物的混合。其结构如下： l特点：结构简单适合小规模生产。可分批或半分批操作。操作方式分批：酶和底物一次装入，反应完后取出全部反应物。半分批：酶和底物分批装入，反应完后取出全部反应物。2 超滤膜反应器底物酶膜产物底物酶底物酶特点：连续操作，去除产物抑制，酶利用率高。要求底物和酶分子大于膜孔径，产物小于膜孔径。特点：连续操作，去除产物抑制，酶利用率高。要求底物和酶分子大于膜孔径，产物小于膜孔径。 超滤膜超滤膜(UF)的孔径尺寸为的孔径尺寸为llOOnm，可截留的相对分子质量范，可截留的相对分子质量范围为围为50010000，它对游离酶和固定化酶，它对游离酶和固定化酶(相对分子质量相对分子质量10000100000)都有较高的截流能力。都有较高的截流能力。 常用的超滤膜酶反应器的结构如图所示常用的超滤膜酶反应器的结构如图所示 ：3喷射式反应器喷射式反应器 喷射式反应器是利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混喷射式反应器是利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，是进行高温短时催化反应的一种反应器。如图所示：合，是进行高温短时催化反应的一种反应器。如图所示：4鼓泡式反应器鼓泡式反应器 鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor，BCR)是利用从反应是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器，它也是一种无搅拌装置的反底物和混合两种作用的一类反应器，它也是一种无搅拌装置的反应器。如图所示：应器。如图所示： 二、固定化酶反应器l1、搅拌罐反应器分批式（BSTR）与连续式（CSTR）特点：结构简单，温度和pH易控制，传质阻力低；但反应效率低，剪切力大，载体易被破坏，搅拌动力消耗大。CSTR在BSTR基础上加有截留酶系统。分批搅拌罐式反应器(batch stirred tank reactor，BSTR)和连续流搅拌罐式反应器(continuous flow stirred tank reactor，CSTR)。如图所示： 2、固定填充床式反应器特点有利于达到高的选择性和转化率。催化剂不易磨损。床层内流体流动平推流，较少量催化剂可获较大生产能力。传热较差，温度和pH难以控制。 床内的压力降较大，底物必须加压才能通过。3、流化床反应器(FBR) 装有较小颗粒的垂直塔式反应器装有较小颗粒的垂直塔式反应器( (形状为柱形、锥形等形状为柱形、锥形等) )。底物。底物以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在浮动状态下反应。以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在浮动状态下反应。底物底物底物产物底物 酶l优点: 具有良好的传热、传质性能 。pH、温度控制及气体的供给比较容易。不易堵塞，可适用于高粘液体。能处理粉末状底物。压力降低。l缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大。由于酶处于流动状态易破损，流化床空隙较大，酶的浓度不高。底物高速流动使酶冲出，降低了转化率。4膜型反应器膜型反应器 由膜状或板状固定化酶组装的反应器由膜状或板状固定化酶组装的反应器 (membrane reactor，MR)。 根据膜组件型式的不同，分为平板式、螺旋卷式、转盘式、根据膜组件型式的不同，分为平板式、螺旋卷式、转盘式、空心管式和中空纤维式酶膜反应器五种。空心管式和中空纤维式酶膜反应器五种。 特点l 膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似生物膜的环境中高效发挥作用.l反应产物及时从反应区域移出,消除了不利动力学和热力学.l可实现对流传质代替自由扩散,强化了传质速率,提高了反应速率.l膜作为相分离器和相接触器,避免了乳化和破乳等问题,也摆脱了液泛的限制.l易于连续化和自动控制l设备费和操作费均低.5鼓泡式反应器鼓泡式反应器 使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称三相流化床式反应器存在固、液、气三相，又称三相流化床式反应器。高径比大的反高径比大的反应器称为塔，也称鼓泡塔反应器。应器称为塔，也称鼓泡塔反应器。 特点l塔内充液体,气体从塔底部通入，分散成气泡，沿着液层向升，从塔顶排走。鼓泡塔的优点是结构结构简单、造价低、易控制和维修，防腐问题易于解决，用于高压操作也无甚困难但鼓泡塔中 液体返混大，气泡容易聚并，使得效率下降。l适用于有气体参加或有气体产生的反应。5.3.2 酶反应器的选择l必须考虑的因素:酶的形状大小及机械强度;底物的性质;反应器的操作要求;反应动力学及传质传热特性;酶的稳定性及再生及更换;反应器的制造成本、运行成本及应用的可塑性。1、酶的形状大小及机械强度l反应器形状大致可根据酶的形状来确定。酶形状反应器粒状酶搅拌罐、固定床、流化床，鼓泡塔膜状酶膜式反应器2、底物的性质l可分为溶解性物质、颗粒物质与胶体物质。l颗粒物质与胶体物质会堵塞填充床因此不适用于此类型反应器。3、酶的稳定性l固定化酶催化活性损失可能原因：酶的失效酶从载体上脱落载体的损坏。5.3.3 酶反应器的操作l注意事项：控制酶反应器中流动状态维持酶反应器的恒定生产能力保持酶反应器的稳定性防止酶反应器的污染酶反应器的微生物污染l不必在完全无菌条件下操作l注意卫生条件符合标准酶反应器的发展酶反应器的发展 一、含有辅助因子再生的酶反应器一、含有辅助因子再生的酶反应器 许多酶反应需辅因子（如辅酶、辅基、能量供给体等）的协许多酶反应需辅因子（如辅酶、辅基、能量供给体等）的协助，辅因子的价格较贵，采用简单的添加方法，经济上不合算。助，辅因子的价格较贵，采用简单的添加方法，经济上不合算。因此，发展了含有辅因子再生的酶反应器，辅因子能反复使用，因此，发展了含有辅因子再生的酶反应器，辅因子能反复使用，降低生产成本。降低生产成本。 利用固定化脱氢酶，将固定化利用固定化脱氢酶，将固定化NADH再生为固定化再生为固定化NAD。依靠半透膜，将固定化依靠半透膜，将固定化NAD保留在反应器内。在反应过程中，固保留在反应器内。在反应过程中，固定化定化NAD不断变成固定化不断变成固定化NADH，又不断再生为固定化，又不断再生为固定化NAD，满，满足反应所需。足反应所需。 麻省理工学院设计的麻省理工学院设计的ATP再生酶反应器等。再生酶反应器等。二、两相二、两相/多相反应器多相反应器 许多底物不溶或微溶于水，如脂肪、类脂肪或极性较低的物许多底物不溶或微溶于水，如脂肪、类脂肪或极性较低的物质，进行酶转化时，水相中有浓度低、反应体积大、分离困难、质，进行酶转化时，水相中有浓度低、反应体积大、分离困难、能耗大。能耗大。 酶反应在水酶反应在水-有机相中进行，可大大增加反应时的底物浓度。有机相中进行，可大大增加反应时的底物浓度。在两相或多相体系中反应，还可减少底物、特别是产物对酶的抑在两相或多相体系中反应，还可减少底物、特别是产物对酶的抑制作用，使酶反应进行到底及酶的操作稳定性延长。制作用，使酶反应进行到底及酶的操作稳定性延长。 两相反应：将酶或固定化酶置于水相中，而底物溶于有机相两相反应：将酶或固定化酶置于水相中，而底物溶于有机相中，在搅拌或乳化条件下反应。有机相一般使用碳氧化合物及芳中，在搅拌或乳化条件下反应。有机相一般使用碳氧化合物及芳香族化合物，让有机相对酶活的影响减少到最小。香族化合物，让有机相对酶活的影响减少到最小。