第二章第二章 细胞破碎与固液分离技术细胞破碎与固液分离技术获取目的物质的先期步骤概述概述生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法。发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，还有许多是存在于细胞内部。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。大多数情况下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。目的目的破碎目的是使产物最大限度的释放出来同时，细胞破碎需要考虑对后期分离的影响。材料和产物的特性、提纯要求是选择破碎方法的依据。选择的一般原则A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎方法的选择破碎方法的选择破碎过程中应注意的问题A、多种破碎方法相结合可产生很大优势B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物细胞结构与破碎细胞结构与破碎为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。细胞破碎技术细胞破碎技术机械法化学及生物化学法组织捣碎机、研钵、细菌磨高压匀浆、超声破碎、撞击法固体剪切作用液体剪切作用 自溶法 酶溶法 化学渗透法物理法反复冻融法、急热骤冷法、渗透破碎法破碎技术破碎技术1、机械法主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎 适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎 适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理破碎技术破碎技术2、物理法（1）反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。（2）急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。（3）渗透破碎法 利用细胞内外渗透压差使水分进入细胞而破碎。3、化学及生物化学法自溶法和酶溶法利用自身或制备酶对细胞进行破碎，需要进行适当处理。酶溶法适用性广、温和且可控。化学法利用有机试剂改变细胞壁或膜的通透性，也较温和，但效率低，易造成污染。比较比较 这些方法中，化学及生物化学法较温和，细胞破坏后产物多数不会发生不可逆的变性，规模也容易放大，生产中最常用。机械法剪切力破坏较大，产生热量，而且不容易规模放大，但设备较成熟，也常用；物理法处理量少，只用于实验室。破碎率的测定破碎率的测定1、直接测定法设备：显微镜、电子微粒计数器破碎前细胞数破碎后细胞数：用染色法排除释放物对计数的干扰。如：碎的G+可染色呈G-的颜色。G染色法受损酵母亮红色，未损酵母呈紫色。测定释放的蛋白质量或酶的活力。通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与所获得的标准数值直接比较。目的产物测定法目的产物测定法原理：细胞破碎后，大量带电荷的内含物释放到水相，电导率上升，而与破碎率的增加呈线性关系。先制定标准曲线：微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量在同等条件下测其电导率，计算破碎率。测定导电率测定导电率固液分离固液分离固液分离将两种不同状态的物质进行区分，以便于后续工作，是重要的基础环节。 动、植物组织、体液等 胞外产物 提取发酵液 预处理 c分离 c破碎 碎片分离 初步纯化 精制 制成品培养液 加 热 沉 淀 匀 化 离 心 沉 淀 分子筛 无菌过滤酶反应 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超 滤 絮 凝 过 滤 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻 干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干 憎 水 结 晶 电 泳生物分离工作的一般过程生物分离工作的一般过程利用一种能将固体微粒截留而让流体通过的多孔介质，将固体微粒从气体中或液体中分离出来。过滤过滤织物介质：最常用的过滤介质，工业上称为滤布(网)，由天然纤维、玻璃纤维、合成纤维或者金属丝编织而成。可截留的最小颗粒的直径为5-65微米。多孔固体介质：具有很多微细孔道的固体材料，如多孔陶瓷、多孔金属及多孔性塑料制成的管或板，能截留1-3 m的微小颗粒。堆积介质：由沙、木炭之类的固体颗粒堆积而成的床层，称作滤床，用作过滤介质使含少量悬浮物的液体澄清。多孔膜：用于膜过滤的各种有机分子膜和无机材料膜。过滤介质过滤介质 过滤推动力是指滤饼和过滤介质两侧的压力差。此压力差可以是重力或人为压差。增加过滤推动力的方法有： 1、增加悬浮液本身的液柱压力，一般不超过50KN/m2，称为重力过滤。 2、增加悬浮液液面的压力，一般可达500KN/m2称为加压过滤。 3、在过滤介质下面抽真空，通常不超过真空度86.6KN/m2，称为真空过滤。 此外，过滤推动力还可以用离心力来增大，称为离心过滤。 过滤推动力过滤推动力过滤阻力包括介质阻力和滤饼阻力。大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。过滤阻力过滤阻力Darcy定理定理 U = (1/A)(dQ/dt)为流体的速度 (in: m/s)， p = 压力差 (in: Pa)， l = 床层厚度 (in: m)， K = Darcys 渗透系数，与流体和床层的性质有关。过滤理论过滤理论 板框压滤机 转筒真空过滤机 带式真空过滤机 离心过滤机过滤设备过滤设备板框压滤机的构造 由许多块带凹凸纹路的滤板与滤框交替排列组装而构成。 滤板和滤框多做成正方形 ，角上均开有小孔，组合后即构成供滤浆和洗涤水流通的孔道。滤框的两侧覆以滤布，围成容纳滤浆及滤饼的空间。 板框压滤机板框压滤机实验用板框压滤机实验用板框压滤机工业用板框压滤机工业用板框压滤机啤酒过滤啤酒过滤 应用：大规模生物分离的主要过滤设备，用于较难分离的低黏度发酵液优点：、大规模，、自动化、操作简单，、滤布装卸容易、易保养维护。缺点：、占地大，单位体积利用率低，、周期性中断进料、滤布利用率低，、压力低，仅应用于低黏度发酵。转筒真空过滤器转筒真空过滤器 预涂层真空转鼓过滤机一般用于含粘性杂质物料的连续过滤，其优点是杂质分离彻底、过滤速度快、劳动强度低和工作区环境好，其缺点是需消耗硅藻土助滤剂。 用户因根据物料状况、生产规模及产品档次等诸多因素来综合考虑是采用预涂层真空转鼓过滤机还是板框压滤机。淀粉糖行业一般将其用于糖化液过滤以除去其中的不溶性蛋白。转筒真空过滤器转筒真空过滤器连续水平真空带式过滤机是一种自动化程度高的新型过滤设备，该机以过滤布或滤网为介质，使料浆水平布置于过滤介质之上，充分利用料浆重力和真空吸力实现固液分离。连续水平真空带式过滤机可适用于多种浓度条件下的物料，过滤效率高，因而被诸多工业部门优先采用。带式真空过滤器带式真空过滤器如何选择过滤器？如何选择过滤器？过滤媒介 过滤器类型其它要求1、滤液的澄清度2、颗粒大小的分布3、发酵液的黏度4、固体颗粒的浓度5、滤饼的干燥度6、滤饼的洗涤7、生产能力离心分离技术离心分离技术借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一与哪些因素有关？颗粒的沉降速度与其自身质量、大小和密度相关。介质分子也会影响沉降速度，尤其针对小颗粒和作用力强的物质。离心时受力情况离心时受力情况固定角度水平重力同离心力相比可以忽略离心加速度： Stocks Force(粘滞力)：离心沉降速度：分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值：意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类离心分离原理离心分离原理 从Stokes公式 可看出沉降速度与影响因素的关系： (1) 密度差（S- l)越大，离心沉降速度越快; (2) 在密度差（S- l)存在下, 固体颗粒尺寸越大, 越容易离心; (3) 液体黏度l越大，越不容易离心。 (4) 离心力(r2)的大小对固液分离很有影响，细胞悬浮液或细胞匀浆中的颗粒尺寸都不大，与液相的密度差也不大，而且液体黏度常常较大，所以要通过增大离心力来提高分离效率。 由于离心机半径 (r) 过大会造成不平衡和振动，一般高速离心机都采用增加转速来增大分离能力。影响沉降的因素影响沉降的因素沉降系数沉降系数沉降系数为颗粒在单位离心力作用下的沉降速度。物理意义是颗粒在离心力作用下，从静止状态到达极限速度所经过的时间。相对离心力相对离心力相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数。RCF=1.118*10-5R(rpm)2沉降时间沉降时间指在某一介质中使一种球形颗粒从液体的弯月面沉降到离心管底部所需要的离心时间。离心时间由实验要求和分离物质的特性决定。离心机的分类离心机的分类按速度和离心力：低速离心机 最大转速6000rpm(r/min)，相对离心力(RCF)104g以下，用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；高速（冷冻）离心机 11042.5104rpm，相对离心力104105g，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；超速离心机 转速2.58104rpm，相对离心力5105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。分离形式平衡允许误差应用离心分离法离心分离法差速离心： 差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 速度区带离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。 梯度介质：为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度560%，密度范围1.021.30 g/cm3。不连续密度梯度制备：移液管由浓到稀；注射器由稀到浓。连续密度梯度制备：控制各节点流速的混合制备法。离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。等密度梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。双水相萃取技术双水相萃取技术双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。因使用的溶剂是水，因此称为双水相。在这两相中水分都占很大比例，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。双水相萃取双水相萃取双水相萃取是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。双水相萃取双水相萃取在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。具有特殊的物理性质分相时间短易于连续操作杂蛋白和细胞碎片去除方便具有生物适应性双水相萃取的特点双水相萃取的特点基本原理基本原理两种聚合物溶液混合时，熵的增加和分子间作用力决定其是否分相。前者与分子数量有关，后者与基团互作有关。大分子溶液中分子间作用力常占主导作用存在空间排斥力的两种混合物更容易分相，形成双水相体系。聚合物的不相溶性聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和。 me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。lnm=lnme+lnmh+lnml类型类型形成上相的聚合物形成上相的聚合物形成下相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/ 非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/ 低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/ 无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵典型的双水相系统典型的双水相系统常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran) 体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等；PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶。这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。