绪论n生物化学与分子生物学定义n与其他学科关系n发展简史n实际应用 什么是生物化学？什么是生物化学？ 简单说，简单说，生物化学是生命的化学生物化学是生命的化学。生生物物化化学学是是用用化化学学的的理理论论和和方方法法作作为为主主要要手手段段，研研究究生生物物体体的的基基本本物物质质的的结结构构（如如Carbohydrates, Lipids, Proteins andNucleicacid)、性性质质及及其其生生命命活活动动的的变变化化规规律律（生生命命活活动动如如：生生长长、生生殖殖、代代谢谢、运运动等）动等）是研究生物体的是研究生物体的化学组成与性质（化学组成与性质（静态生静态生化，化，Static Biochemistry)，以及机体，以及机体内所进行的内所进行的化学变化化学变化(Dynamic Biochemistry)的科学。的科学。分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。分子生物学分子生物学( (molecular biologymolecular biology) )是生物化学的重是生物化学的重要组成部分。要组成部分。生物化学与分子生物学 同有关学科的关系n生物化学与分子生物学是生物学的最深层次；n生物化学与分子生物学是化学的最高层次；n生物化学与分子生物学为农学、医学和食品科学提供理论依据和研究手段；n物理学、信息科学和数学为生物化学与分子生物学提供研究手段。 与生物化学的关系与生物化学的关系与生物化学的关系与生物化学的关系最为密切最为密切最为密切最为密切研究方向的研究方向的研究方向的研究方向的侧重点侧重点侧重点侧重点研究方法研究方法研究方法研究方法分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学生物大分子的生物大分子的生物大分子的生物大分子的结构与功能、结构与功能、结构与功能、结构与功能、分子间信息传分子间信息传分子间信息传分子间信息传递递递递生物化学与遗生物化学与遗生物化学与遗生物化学与遗传学传学传学传学生物化学生物化学生物化学生物化学大分子的代谢大分子的代谢大分子的代谢大分子的代谢转化转化转化转化生物化学与化生物化学与化生物化学与化生物化学与化学以及生理学学以及生理学学以及生理学学以及生理学 但存在一定的但存在一定的但存在一定的但存在一定的差别差别差别差别分子生物学的三大原则分子生物学的三大原则1) 1) 构成生物大分子的单体是相同的构成生物大分子的单体是相同的共同的核酸语言共同的核酸语言 共同的蛋白质语言共同的蛋白质语言2) 生物遗传信息表达的中心法则相同生物遗传信息表达的中心法则相同 DNARNAproteincharacter3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 不同的高级结构不同的高级结构 不同的生物大分子之间的互作不同的生物大分子之间的互作不同的物种特性不同的物种特性准备和酝酿阶段准备和酝酿阶段n 时间：时间：19世纪后期到世纪后期到20世纪世纪50年代初。年代初。n两点重大突破：两点重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质；确定了蛋白质是生命的主要基础物质；确定了生物遗传的物质基础是确定了生物遗传的物质基础是DNA。 现代分子生物学的建立和发展阶段n时间：从时间：从50年代初到年代初到70年代初，年代初，n1953年年Watson和和Crick的的DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。作为现代分子生物学诞生的里程碑。n主要进展包括：主要进展包括：v遗传信息传递中心法则的建立遗传信息传递中心法则的建立v对蛋白质结构与功能的进一步认识对蛋白质结构与功能的进一步认识 初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段n时间：时间： 70年代后至今年代后至今n基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。生物化学中的关键技术生物化学中的关键技术n电泳（电泳（19231923） 生物大分子的分离、分析生物大分子的分离、分析n超离心（超离心（19251925）蛋白质、细胞亚器官的）蛋白质、细胞亚器官的 分离；分子量的确定分离；分子量的确定n同位素标记（同位素标记（19341934）物质代谢途径、生）物质代谢途径、生物大分子结构测定物大分子结构测定n层析（层析（1944 1944 ） 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化nX-X-光衍射、光衍射、NMRNMR：生物大分子结构测定生物大分子结构测定超速离心超速离心（1920S1920S）电泳电泳（1930S1930S）电镜（电镜（1930S1930S）同位素示踪同位素示踪 （1940S1940S）柱层析（柱层析（1940S1940S）X X射线衍射射线衍射（1950S1950S）氨基酸分析氨基酸分析与测序（与测序（1950S1950S）核酸杂交（核酸杂交（1960S1960S）核苷酸测序核苷酸测序（1970S1970S） 重组重组DNADNA技术技术（1970S1970S）DNADNA合成（合成（1980S1980S）单克隆抗体组织化学单克隆抗体组织化学（1980S1980S）聚合酶链式反应聚合酶链式反应（1980S1980S）分分子子生生物物学学常常用用技技术术1901-2012111111项生理医学诺贝尔奖中，项生理医学诺贝尔奖中，6969项（项（62%62%）颁给了生物化学与分子生物学领域颁给了生物化学与分子生物学领域发展历程发展历程分子生物学中重大成就与突破者分子生物学中重大成就与突破者Nobel Prize的获得者的获得者构成了分子生物学发展的主要内容构成了分子生物学发展的主要内容里程碑里程碑1910科赛尔Kossel（德）蛋白质、细胞及细胞核化学的蛋白质、细胞及细胞核化学的研究（研究（首先分离到首先分离到A、T和组氨酸和组氨酸） 1958 莱德伯格莱德伯格 Lederberg（美）（美） 噬菌体转导噬菌体转导比德尔比德尔Beadle &泰特姆泰特姆Tatum（美）（美）One gene-one enzyme红色面包霉突变体红色面包霉突变体Beadle TatumLederberg 1959 奥乔亚奥乔亚 Ochoa( (美籍西班牙裔美籍西班牙裔) ) 科恩伯格科恩伯格Kornberg（美）（美）Ochoa Kornberg 细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合 成了成了RNARNA，基因（，基因（DNADNA）RNARNA蛋白质蛋白质 实现了实现了DNADNA分子在试管内（细菌无细分子在试管内（细菌无细 胞提取液）的复制胞提取液）的复制 1962 Watson（美）（美） Crick（英）（英） Wilkins（新西兰）（新西兰）通过通过DNADNA分子的分子的X X射线衍射射线衍射研究证实研究证实 DNA Double Helix ModelDNADNA双螺旋发现的深刻意义双螺旋发现的深刻意义双螺旋发现的深刻意义双螺旋发现的深刻意义nn确立了核酸作为信息分子的结构基础确立了核酸作为信息分子的结构基础确立了核酸作为信息分子的结构基础确立了核酸作为信息分子的结构基础;nn提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；息传递的基本方式；息传递的基本方式；息传递的基本方式；nn最后确定了核酸是遗传的物质基础；最后确定了核酸是遗传的物质基础；最后确定了核酸是遗传的物质基础；最后确定了核酸是遗传的物质基础；nn为认识核酸与蛋白质的关系及其在生为认识核酸与蛋白质的关系及其在生为认识核酸与蛋白质的关系及其在生为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。命中的作用打下了最重要的基础。命中的作用打下了最重要的基础。命中的作用打下了最重要的基础。 1962 肯德鲁肯德鲁Kendrew 佩鲁茨佩鲁茨Perutz（英国）（英国）Kendrew Perutz 测定了肌红蛋白及血红蛋白的高级结构（三级）测定了肌红蛋白及血红蛋白的高级结构（三级） 成为研究生物大分子结构的先驱成为研究生物大分子结构的先驱 1965 雅各布雅各布Jacob 莫诺莫诺Monod （法国）（法国）Jacob Monod 提出并证实了提出并证实了Operon作为调节细菌细胞代谢的分子机制作为调节细菌细胞代谢的分子机制首次提出首次提出mRNAmRNA分子的存在分子的存在 1969 Nirenberg（美）（美） Holly Khorana尼伦伯格尼伦伯格Nirenberg克拉纳克拉纳Khorana 霍利霍利Holley 破译了遗传密码破译了遗传密码酵母酵母phetRNAphetRNA的的核苷酸序列并证核苷酸序列并证明了所有明了所有tRNAtRNA三三级结构的相似性级结构的相似性第一个合成了核第一个合成了核酸分子，并人工酸分子，并人工复制了酵母基因复制了酵母基因 1975 Temin，Baltimore( (美美) ) & Dulbecco特明特明Temin巴尔的摩巴尔的摩Baltimore发现了逆转录酶（以发现了逆转录酶（以RNARNA为模板，逆转录生成为模板，逆转录生成DNA RNADNA RNA肿瘤病毒）肿瘤病毒）杜尔贝克杜尔贝克 Dulbecco桑格桑格 Sanger吉尔伯特吉尔伯特 Gilbert伯格伯格 Berg 1980 Sanger （英） Gilbert & Berg（英）酶法核苷酸测酶法核苷酸测序的设计者序的设计者化学测序法的设计者化学测序法的设计者DNADNA重组，在细菌中表重组，在细菌中表达胰岛素达胰岛素DNADNA重组技术的元老重组技术的元老Sanger还由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得还由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 1984 Kohler（德）（德） Milstein（美）（美） Jerne（丹麦）（丹麦）科莱尔科莱尔Kohler米尔斯坦米尔斯坦Milstein杰尼杰尼Jerne发展了单克隆抗体发展了单克隆抗体(Monoclonal Antibodies McAb)(Monoclonal Antibodies McAb)技术，技术，完善了极微量蛋白质的检测技术完善了极微量蛋白质的检测技术 1988 麦克林托克麦克林托克 McClintock ( (美美) )可移动的遗传因子可移动的遗传因子（jumping gene or mobile element）McClintock5050年代初发现年代初发现8888年获奖年获奖 1989 奥尔特曼奥尔特曼 Altman （加）（加） 切赫切赫Cech（美）（美）核酶即核糖核酸质酶核酶即核糖核酸质酶（Ribozyme）的发现者（即某些的发现者（即某些RNARNA具有具有酶的功能）酶的功能）SidneyAltman ThomasR.Cech 1989 BishopVarmus（美）（美） 正常细胞同样带有原癌基因正常细胞同样带有原癌基因 1993 Roberts Sharp（美）（美） 断裂基因断裂基因（splitting gene） Mullis（美）（美） PCR仪的发明者仪的发明者 Smith 基因定点突变基因定点突变 1994 Gilman Rodbell 发现发现G G蛋白在细胞信号传导中的作用蛋白在细胞信号传导中的作用 1995 Lewis（美）、（美）、NussleinVolhard（德）、（德）、Wieschaus（美）（美） 2020世纪世纪40407070年代先后独立年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因鉴定了控制果蝇体节发育基因n1990.101990.10：被誉为生命科学：被誉为生命科学“阿波罗登月计划阿波罗登月计划” 的人类基因组计划（的人类基因组计划（HGPHGP） 启动。启动。n1998.51998.5：美国科学家：美国科学家克里格克里格 文特文特创建的塞莱拉遗传公司，目标是投入创建的塞莱拉遗传公司，目标是投入亿美元，到年绘制出完整的人体基因组图谱，与国际亿美元，到年绘制出完整的人体基因组图谱，与国际HGPHGP展开竞展开竞争。争。n1999.12.11999.12.1：国际：国际HGPHGP联合研究小组宣布，他们完整地破译出人体联合研究小组宣布，他们完整地破译出人体第第2222对染对染色体的遗传密码色体的遗传密码。n2000.3.142000.3.14：当时的美国总统克林顿和英国首相布莱尔发表联合声明，呼：当时的美国总统克林顿和英国首相布莱尔发表联合声明，呼吁将人类基因组研究成果公开，以便世界各国科学家都能自由地使用这些吁将人类基因组研究成果公开，以便世界各国科学家都能自由地使用这些成果。成果。n2000.52000.5：国际：国际HGPHGP完成时间预计从原定的完成时间预计从原定的20032003年年6 6月提前至月提前至20012001年年6 6月。月。n2000.6.262000.6.26：科学家公布人类基因组：科学家公布人类基因组“工作框架图工作框架图”。n2001.22001.2：国际：国际HGPHGP( (美、英、日、德、法和中国美、英、日、德、法和中国) )的科学家和美国塞莱拉公的科学家和美国塞莱拉公司分别宣布司分别宣布完成绘制人类基因组测序草图完成绘制人类基因组测序草图。分别在。分别在1515日出版的日出版的NatureNature和和1616日的日的ScienceScience公布公布。人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划( (Human Genome Project)Human Genome Project)“WhatsHumanGenomeProject?”“OnebaseOnedollar!”-byataxidriver(andataxpayer)humanArabidopsis拟南芥拟南芥Thermotoga maritimaEscherichia coli大肠杆菌大肠杆菌Buchnerasp. APSRickettsia prowazekiiUreaplasma urealyticumBacillus subtilisDrosophila melanogasterThermoplasma acidophilumPlasmodium falciparumHelicobacter pylori mouseCaenorhabitis elegansratBorrelia burgorferiBorrelia burgorferiAquifex aeolicusNeisseria meningitidis Z2491Mycobacterium tuberculosis 全基因组已经测序的一些生物全基因组已经测序的一些生物生物化学与分子生物学的意义生物化学与分子生物学的意义 1.生物化学是各门生物科学的基础，也是揭开生生物化学是各门生物科学的基础，也是揭开生命奥秘的重要基础。命奥秘的重要基础。2.生物化学在工业上广泛应用生物化学在工业上广泛应用例如： 食品工业中的酱油 大豆蛋白 曲霉水解 氨基酸 美拉德反应 酱油啤酒生产：啤酒生产： 大麦芽大麦芽+ +大米大米 麦芽糖、葡萄糖麦芽糖、葡萄糖+ +氨基酸氨基酸 啤酒酵母（啤酒酵母（7 7天）天） 乙醇、糖、乙醇、糖、双乙酰双乙酰 低温发酵（低温发酵（2020天）天） 啤酒啤酒生物有效物质的提取生物有效物质的提取制药工业： 链激酶、 尿激酶、 氨基酸、 核甘酸（所谓基因营养物）、SOD、 紫杉醇等。生物制品： 疫苗 皮革工业： 角质酶脱毛 生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并为其技术改造创造了条件为其技术改造创造了条件与农业方面有密切联系与农业方面有密切联系 举例举例n作物病理研究作物病理研究 a.a.玉米大斑病（每年损失玉米大斑病（每年损失20-40%20-40%产量）产量）抗病蛋白抗病蛋白 b.b.水稻白叶枯病（损失水稻白叶枯病（损失20-30%20-30%产量）产量）n奶牛产奶量与营养的关系奶牛产奶量与营养的关系 中国奶牛中国奶牛 一般一般4-54-5吨吨/ /年产年产 国外奶牛国外奶牛 8-108-10吨吨/ /年产年产 食量自动化，营养个体化食量自动化，营养个体化重组重组DNA技术的应用技术的应用1 2 1 2野生型转基因抗真菌病的转基因草坪草抗真菌病的转基因草坪草抗棉铃虫棉花抗棉铃虫棉花抗虫水稻抗虫水稻全球转基因农作物销售额及预测生物工程生物工程n作物防虫（转基因棉花、转基因西红柿）n生物制药 （转基因动物-人血白蛋白）n作物育种（转基因水稻-抗除草剂）A tobacco plant expressing the gene for firefly luciferase. Lightwasproducedaftertheplantwaswateredwithasolutioncontainingluciferin,thesubstrateforthelight-producingluciferaseenzyme(seeBox132).Dontexpectglow-in-the-darkornamentalplantsatyourlocalplantnurseryanytimesoon.Thelightisactuallyquiteweak;thisphotographrequireda24-hourexposure.Therealpointthatthistechnologyallowstheintroductionofnewtraitsintoplantsisneverthelesselegantlymade.烟草表达萤火虫烟草表达萤火虫荧光素基因荧光素基因表达抗虫基因的西表达抗虫基因的西红柿红柿Glyphosate-resistant soybean plants. ThephotographsshowtwoareasofasoybeanfieldinWisconsin.(a)Withoutglyphosatetreatment,thispartofthefieldisoverrunwithweeds.(b) Glyphosateresistantsoybeanplantsthriveintheglyphosate-treatedsectionofthefield.Glyphosatebreaksdownrapidlyintheenvironment.Agriculturaluseofengineeredplantssuchastheseproceedsonlyafterconsiderabledeliberation,balancingtheextraordinarypromiseofthetechnologywiththeneedtoselectnewtraitswithcare.Bothscienceandsocietyasawholehaveastakeinensuringthattheuseoftheresultantplantshasnoadverseimpactontheenvironmentoronhumanhealth.转草甘膦基因大豆Cloning in mice. Thegeneforhumangrowthhormonewasintroducedintothegenomeofthemouseontheright.Expressionofthegeneresultedintheunusuallylargesizeofthismouse.表达人生长激素表达人生长激素的老鼠的老鼠喷洒工程菌清除石油污染美国美国 GE GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。生化与司法鉴定生化与司法鉴定司法鉴定是健全法制中的一个必需的工作环节，它包含了法律上要鉴定的一切事、屋和人。n受伤与死亡现象中的生化 a. DNA含量随死亡时间而下降 b.心肌丁二酸脱氢酶、细胞色素氧化酶 随死亡时间而上升 c.精子DNADNA指纹技术的应用指纹技术的应用JJ亲子鉴定亲子鉴定亲子鉴定亲子鉴定（VNTRVNTR） 亲子鉴定风行意亲子鉴定风行意大利（大利（几十万）几十万）现代家庭现代家庭“情流感情流感”J 犯罪分析犯罪分析 血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、精液和其他出现在犯精液和其他出现在犯精液和其他出现在犯精液和其他出现在犯罪现场的样品成为嫌罪现场的样品成为嫌罪现场的样品成为嫌罪现场的样品成为嫌疑犯被监禁或释放强疑犯被监禁或释放强疑犯被监禁或释放强疑犯被监禁或释放强有力的证据有力的证据有力的证据有力的证据 误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之一以下，结果非常精一以下，结果非常精一以下，结果非常精一以下，结果非常精一以下，结果非常精一以下，结果非常精确。确。确。确。确。确。 JJ DNA DNA DNA DNA身份证身份证身份证身份证 DNA DNA DNA DNA DNA DNA 指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个人识别身份证。人识别身份证。人识别身份证。人识别身份证。人识别身份证。人识别身份证。 个个人人D DN NA A基基因因身身份份证证第一章：生物大分子的第一章：生物大分子的提取、沉淀和离心分离提取、沉淀和离心分离第一节 生物大分子的提取生物大分子的提取 蛋白质（包括酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段： 一.选择材料和预处理 二.细胞的破碎及细胞组分的分离 三.提取和纯化 四.浓缩，干燥和保存 一一. .选择材料及预处理选择材料及预处理 动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。 有效成份有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。 1.动物组织： 选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。 脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。 保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。 a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：10的冰箱内； 长期保存：70低温冰箱内。 b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备 用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。 2.植物材料： 选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。 a.a.提取核提取核DNADNA：选用黄化苗（生长710天小麦，水稻），防止叶绿体DNA的干扰 b.b.提取提取RNARNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。 保存：冷冻采样后尽快放于420冰箱内。 DNA,RNA 采样后，N2速冻，至70冰箱。对RNA样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。3.微生物： 选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： a.a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存 b.b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4保存数月。 3.二二. .确定测定方法确定测定方法 在效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高的过程，因此，提取和分离的每个步骤均要测定有效成分的含量。 测定方法要专一、准确、灵敏和简便。 使用较多的测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。三三. .细胞的破碎细胞的破碎1. 机械破碎：(1) 研磨法： 剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。(2) 组织捣碎器法： 用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。但是在捣碎期间必须保持低温，捣碎的时间不易太长，以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。(3) 超声波法： 借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多用于微生物细胞的破碎，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。(4) 压榨法： 是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(细胞直径的孔)，致使其被挤破 、压碎。(5) 冻融法： 将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 2.溶涨和自溶： 溶涨：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。 应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将某些有效成分在自溶时分解。 3.化学处理： 用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠) 处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。 4. 生物酶降解： 生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。 四四. .抽提抽提1.抽提的含义： 抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。 经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。 一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。2.抽提的影响因子 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。（1）pH值： 改变溶质解离状态。 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提。(2)溶剂的极性和离子强度： 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。 提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4） 一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。 高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。 常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。(3)水解酶： 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。 如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用68的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在1315抽提3h，可得到较高的回收率。因为68乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。 RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高(4)(4)温度温度： 一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。 例如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8时， 从200公斤孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20时，从400公斤孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高温下制备的HCG粗品很难进一步纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破坏。 一般提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。 小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04（5）搅拌： 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。（6）氧化： 一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。（7）金属离子： 蛋白质的巯基还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。 （8）抽提液与抽提物的比例： 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。第二节第二节 沉淀分离技术沉淀分离技术 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。 蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有明显差异，所以制备这两种大分子时，所用的试剂和操作方法也不完全相同。一一. .蛋白质的沉淀分离蛋白质的沉淀分离（一）盐析沉淀法1.盐析的原理 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 2.盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 : 通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： （1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= VV= V0 0(S(S2 2-S-S1 1)/)/（1-S1-S2 2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。(2)加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(St=G(S2 2-S-S1 1)/)/（1-AS1-AS2 2） S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。 实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25） 4.影响蛋白质盐析的因素：（1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2530g/L。 （2）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强 （3）pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 （4）温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加； b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。 一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。 5.盐析时的注意事项 ： （1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀； （2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。 （3）选择好温度，一般在室温下进行； （4）蛋白浓度不易过高，一般2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。（二）等电沉淀法： 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 （三）有机溶剂沉淀法：作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； （2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。 缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。注意：（1) 低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。 （3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4) 注意离子强度，离子种类的影响。（四）选择性变性沉淀法： 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。 例如：利用加热，改变pH或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。（五）非离子多聚物沉淀法： 聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。 沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。 优点： （1）操作条件温和，不易引起变性； （2）具有极高的沉淀效率； （3）沉淀后多聚物容易除去。二二. .核酸的提取与沉淀分离核酸的提取与沉淀分离 核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。 从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在 。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。DNP 在0.14mol/L的氯化钠溶液中， RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%； 当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。 所以常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。DNP1.DNP/RNP复合物的解聚： 主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。 去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。 蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E，可以避免剪切和破坏核酸。2.多糖的消除： 采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿12h，植物在取材前暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉类物质均会减少。 混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可达到分离目的。 或用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。3.RNA3.RNA的提取：的提取： tRNAtRNA(约占细胞内RNA的15%)的相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调节到pH5得到的沉淀的中可分离得到tRAN。 mRNAmRNA占细胞RNA的5%左右，很不稳定，提取条件要严格控制。 rRNArRNA约占细胞内RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。 由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA携带了DNA为蛋白质编码的信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。 RNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。稀盐溶液提取：稀盐溶液提取： 将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得RNA。苯酚溶液提取：苯酚溶液提取： 在细胞破碎制成匀浆后，用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，将RNA与蛋白质分开。4.DNA的提取： 从细胞中提取DNA，一般在细胞破碎后用浓盐法提取。即用1mol/L的氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L NaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理 ，除去蛋白质，而得到DNA。5. 核酸的沉淀分离： 核酸分离纯化应维持在0-4的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。 常用的沉淀分离法有： (1)有机溶剂沉淀法 (2)等电点沉淀法 (3)钙盐沉淀法 (4)选择性溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀法： 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。(2) 等电点沉淀法： 脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点力pH2.0-2.5；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液调节到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。(3) 钙盐沉淀法： 在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。(4) 选择性溶剂沉淀法： 选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。 在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。三三. .利用膜的分离技术利用膜的分离技术1.透析： 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 影响透析速度的因素： （1）半透膜的通透性：常用的半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火绵纸或其他改型的纤维素材料。 （2）透析外液的更换：反复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行初期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。 （3）温度：温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。 （4）压力：增加压力可加快透析速度，如真空透析。2.超滤： 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。 超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。原理： 在外力作用下，超滤膜对大分子物质的截留主要是筛分作用，决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。 使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，被截留物质的Mr变小。超滤的主要应用： 浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。 梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。 脱盐纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。超滤法的典型用途： A: 对蛋白质、酶、DNA、单克隆抗体、免疫球蛋白进行浓缩和脱盐； B: 药物、激素分离； C: 从PCR扩增仪的DNA中去除引物； D: 去除标记的氨基酸和核苷酸； E: HPLC样品制备； F: 从样品中除蛋白； G: 从生物体液、发酵肉汤培养基中纯化抗生素、激素和药物； H: 从细胞悬液、裂解液中回收生物分子； I: 对蛋白质、酶、细胞、DNA、生物分子、抗体和免疫球蛋白进行浓缩和脱盐； J: 哺乳动物细胞的收集； K: 清洗细胞、纯化病毒、去除细胞碎片、除热原。第三节 离心分离技术 离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备. 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。一.基本原理： 离心力（centrifugal force，Fc）： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义： Fc = mFc = ma = ma = m2 2 r r a：粒子旋转的加速度， m：沉降粒子的有效质量， ：粒子旋转的角速度， r：粒子的旋转半径( cm )。 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）: 由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 X X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n n为转子每分钟的转数（revolutions per minute,简写成r/min,或rpm）。 22 一般在低速离心时（转速小于5000 r/min），离心力的大小常用r/min来表示，而超速离心时则用g或g来表示。 由于离心管中从管口到旋转中心的距离是不同的，所以在同样转速时，管口和管底所受到的离心力也有差别。 例如：在某个角度转头中，离心管口到旋转中心的距离为4.8cm，而离心管底到旋转中心的距离是8.0cm，当转速为12000 r/min是，离心管口和离心管底所受到的相对离心力RCF分别是：RCF（管口）= 1.11810-5(12000)24.8=7734gRCF（管底）=1.11810-5 (12000)28.0=12891g 科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点的离心力。旋转轴340rminravrmax 为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole 和Cotzias 利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便。 换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 沉降系数（sedimentation coefficient，s）： 根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。若用2n/60表示，则 X1：离心前粒子到旋转轴的距离。 X2：离心后粒子到旋转轴的距离。 S：一般在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。 例如，动物细胞的核糖体沉降系数等于80S，它的含义就是：8010-13 s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。 沉降速度（sedimentation velocity）： 对于球形颗粒 F Fc c=(1/6)=(1/6) d d3 3(p pm m) )2 2X X F Ff f=3=3 dvdv 当F Fc c=F=Ff f时 (1/6)1/6) d d3 3(p pm m) )2 2X X = 3= 3 ddv v v=(1/18 v=(1/18) d) d2 2(p pm m) )2 2X X Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；：流体介质的粘度；P：粒子的密度；m：介质的密度；v：粒子移动的速度 从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表达式也可表示为： 当Pm，则S0，粒子顺着离心场方向沉降。当Pm，则 S0，粒子到达某一位置后达到平衡。当Pm，则S0，粒子逆着离心场方向上浮。 2d5.沉降系数与物质相对分子质量: 由沉降系数根据Svedberg 公式可以计算出物质的相对分子质量： Mr=RTSMr=RTS20,w20,w/D/D20,w20,w(1-(1-) Mr：相对分子质量； D20,w：以20的水为介质时颗粒的扩散系数； R: 气体常数； T：绝对温度； S20,w：以20的水为介质时颗粒的沉降系数； ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数； ：溶剂密度。 6.沉降时间（sedimentation time，Ts）: 在实际工作中，常常需要在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间。根据沉降系数（S）式可得 积分得 X2:离心转轴至离心管底内壁的距离；X1:离心转轴至样品溶液面之间的距离，将（t2t1）用Ts表示： 其中的 (lnXmax lnXmin)/2 为一常数，称k常数或k值。 7.K值（k factor）: K值是用来描述在一个转子中，将粒子沉降到离心管底的效率。也就是溶液达到澄清的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K值愈小，粒子沉降到离心管底需要的时间愈短。 通常，离心机的转子说明书中提供的K值，是在最大转速下所计算出来的数值。若未达到最大转速，可用下试计算K值： 利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间短一些。二.离心机的主要构造和类型： 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。1.1.制备性离心机可分为三类制备性离心机可分为三类: : 低速离心机 :最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头 ，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。 这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。 高速离心机 ：最大转速为20000-25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0-40oC，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。 通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。 超速离心机：大于30103 r/min，最大离心力600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。新式的有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和时间）。有40多种不同容量和性能的转头给用户选择。离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。 超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。 角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4-12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20-40度之间，角度越大分离效果越好。 优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。 壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。2.2.转头转头 角式转头角式转头 荡平式转头： 这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心 优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。 其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 区带转头区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。 沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。 区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 垂直转头：其离心管垂直放置，样品颗粒的沉降距离短，离心所需时间也短，适用于密度梯度区带离心，离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。 连续流动转头： 可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。 3.3.离心管离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成： 塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。 塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。4.4.分析性离心机分析性离心机 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。 利用特殊配置的数据处理机自动计算s(沉降系数)和Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化等。主要产品有美国Beckman公司的Model E及日本日立公司的282型。三.离心分离方法的选择1.差速离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2-3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。三.离心分离方法的选择1.差速离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2-3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。2.密度梯度离心： 又称速率区带离心法。是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm。 这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更大）或相对分子质量相差3倍的蛋白质。大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心管先装在密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带会越靠近离心管底。 由Pm可知S0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到离心管底之前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。 离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60。 此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是用于分离大小相异而密度相似的物质。3.等密度离心： 密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在预先制备好的梯度介质溶液顶上，或先与梯度液混合后装入离心管，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。 离心时，样品的低密度的颗粒向上浮起，高密度的颗粒向下沉降，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成不同的区带 。 当介质的密度大于粒子的密度，即mP时粒子上浮；在Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个与它本身的密度相等的位置，即Pm，此时dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 但颗粒的大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种: a:用注射器和滴管由离心管上部吸出。 b:用针刺穿离心管底部滴出。 c:用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。 d:用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 梯度溶液的制备:梯度材料的选择原则 作为一种理想的梯度材料应具备以下几点： 与被分离的生物材料不发生反应，即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。 可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。 不会对离心设备发生腐蚀作用。 容易纯化，价格便宜或容易回收。 浓度便于测定，如具有折光率。 对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。 上述条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。基本上符合上述原则的梯度材料有： 糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400，也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡萄糖胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞，包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。 氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较高。 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。 硅溶胶：如Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下仍是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。可用于细胞、细胞器和病毒的分离。 蛋白质：如牛血清白蛋白。 重水。 非水溶性有机物：如氟代碳等。四.离心操作的注意事项 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。 超速冷冻离心机超速冷冻离心机: :未经过培训和考核者不能使用。 其它普通离心机：其它普通离心机：按照操作要求进行。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第二章 层析技术 第一节、层析技术的原理n n原理原理：层析技术层析技术是层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物是层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物中各组份物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小，分子的中各组份物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小，分子的极性，分子亲和力，分配系数等），使各组分以不同程度分布度在两极性，分子亲和力，分配系数等），使各组分以不同程度分布度在两相中（其中一相为固定相，另一相为流动相），从而使各组分以不同相中（其中一相为固定相，另一相为流动相），从而使各组分以不同速度移动而达到分离。速度移动而达到分离。n n 层析分离技术在上个世纪就已在生产实践上应用。层析分离技术在上个世纪就已在生产实践上应用。19031903年用于植年用于植物色素的分离提取，分离后的叶绿素和叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上物色素的分离提取，分离后的叶绿素和叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上从上到下排列成色谱，故也称为从上到下排列成色谱，故也称为“ “色层分离法色层分离法” ”。19311931年，有人用氧年，有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构异构体，显示了这一分离技术化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构异构体，显示了这一分离技术的高度分辨力，从此吸引了人们的广泛关注。自的高度分辨力，从此吸引了人们的广泛关注。自19441944年应用滤纸作为年应用滤纸作为固定支持物的固定支持物的“ “纸层析纸层析” ”诞生以来，层析技术的发展越来越快。诞生以来，层析技术的发展越来越快。19501950年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，亲和层析，凝胶层析等亲和层析，凝胶层析等06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第二节 层析技术的分类n n分类：分类：根据操作形式的不同，层析技术可分为纸层析，根据操作形式的不同，层析技术可分为纸层析，薄层层析和柱层析。薄层层析和柱层析。 根据理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析，分根据理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析，分配层析，高压液相层析，吸附分配层析，离子交换层配层析，高压液相层析，吸附分配层析，离子交换层析，排阻层析，亲和层析，气相色谱层析。析，排阻层析，亲和层析，气相色谱层析。 层析基本操作步骤：层析基本操作步骤： 1 1，选择适当的吸附剂，选择适当的吸附剂 2 2，加样，加样 3 3，展开，展开 4 4，检出和鉴定，检出和鉴定06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第三节 薄层层析n n原理原理：以薄层板作为支持介质的层析。：以薄层板作为支持介质的层析。 在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流过，从而使各组分薄层板一端，然后让推动剂从上流过，从而使各组分得到分离的物理方法。得到分离的物理方法。n n常用的常用的支持剂支持剂：硅胶：硅胶G G，硅胶，硅胶GFGF，氧化铝，纤维素，硅，氧化铝，纤维素，硅藻土，纤维素藻土，纤维素G G，交联葡聚糖凝胶等。，交联葡聚糖凝胶等。n n基本操作步骤：基本操作步骤：薄层板的准备；点样；展开；定位；薄层板的准备；点样；展开；定位；定量。定量。n n应用应用：氨基酸，多肽，蛋白质及酶，维生素，核甘酸，：氨基酸，多肽，蛋白质及酶，维生素，核甘酸，脂肪酸，脂类，糖类，磷脂，生物碱，酚类等物质的脂肪酸，脂类，糖类，磷脂，生物碱，酚类等物质的分离分离n n优点优点：设备简单，操作方便，快速灵敏，分析制备兼设备简单，操作方便，快速灵敏，分析制备兼适适06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第四节 聚酰胺薄层层析n n原理原理：用于层析的聚酰胺基团有两类：锦纶：用于层析的聚酰胺基团有两类：锦纶6666（尼龙）和锦纶（尼龙）和锦纶6 6，这两类材料中都含有大，这两类材料中都含有大量的酰胺基团，故统称为量的酰胺基团，故统称为聚酰胺聚酰胺。聚酰胺以其。聚酰胺以其COCO或或NHNH与极性化合物的与极性化合物的OHOH或或O O之之间形成氢键间形成氢键，从而发生，从而发生吸附作用吸附作用。不同物质与。不同物质与聚酰胺之间形成氢键的能力不同。在聚酰胺薄聚酰胺之间形成氢键的能力不同。在聚酰胺薄膜上做层析分离时，流动相从薄膜表面流过，膜上做层析分离时，流动相从薄膜表面流过，被分离物质在溶剂和薄膜之间按被分离物质在溶剂和薄膜之间按分配系数分配系数的大的大小，发生不同速率的吸附与解吸过程，从而使小，发生不同速率的吸附与解吸过程，从而使混合物得到有序的分离。混合物得到有序的分离。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n影响影响迁移率迁移率的主要因素的主要因素 1 1、成键基团数目越多，吸附力越大、成键基团数目越多，吸附力越大 2 2、成键基团的位置，影响氢键数目和强度、成键基团的位置，影响氢键数目和强度 3 3、芳香环，共双键越多，成键越强、芳香环，共双键越多，成键越强 4 4、被分离物质分子内氢键的形成，可以削弱它与、被分离物质分子内氢键的形成，可以削弱它与聚酰胺之间氢键的形成聚酰胺之间氢键的形成 5 5、溶剂的影响、溶剂的影响 优点优点：对极性化合物有特异的分辨能力，灵敏度：对极性化合物有特异的分辨能力，灵敏度高，操作方便，速度快，样点不扩散，有荧光的高，操作方便，速度快，样点不扩散，有荧光的物质可用紫外灯检出，不必喷显色剂显色。物质可用紫外灯检出，不必喷显色剂显色。 用途用途：分离多种化合物，在蛋白质或肽的：分离多种化合物，在蛋白质或肽的N N末端残末端残基分析中是个比较理想的方法，对基分析中是个比较理想的方法，对丹酰氨基酸丹酰氨基酸的的分析可达分析可达10109 91010101006 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第五节 凝胶层析n n一、一、原理原理：又称：又称凝胶过滤凝胶过滤，是一种，是一种柱层析柱层析方法。方法。层析柱中装有水不溶凝胶颗粒，颗粒内部形成层析柱中装有水不溶凝胶颗粒，颗粒内部形成多孔的三维网状结构，凝胶是高度亲水的，在多孔的三维网状结构，凝胶是高度亲水的，在水溶液里吸水膨胀，当在胶床表面加上分子大水溶液里吸水膨胀，当在胶床表面加上分子大小不同的样品混合物并用洗脱液洗脱时，直径小不同的样品混合物并用洗脱液洗脱时，直径小于小于网孔的自由通透小分子可以进入胶粒内部，网孔的自由通透小分子可以进入胶粒内部，需层层扩散，流过的路程比较需层层扩散，流过的路程比较长，最后流出长，最后流出；而直径而直径大于大于网孔直径的大分子不能进入胶粒内网孔直径的大分子不能进入胶粒内部，沿着胶粒的间隙向下流出，所经路程部，沿着胶粒的间隙向下流出，所经路程短短，最先流出最先流出；通透性居中的分子则后于大分子而通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出先于小分子流出，从而按从大到小的顺序实现，从而按从大到小的顺序实现对对大中小大中小分子的分离。分子的分离。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、常用的二、常用的凝胶材料凝胶材料：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。n n三、三、操作步骤操作步骤 1 1、凝胶的选择和处理、凝胶的选择和处理 2 2、凝胶柱的制备、凝胶柱的制备 3 3、加样、加样 4 4、洗脱、洗脱 5 5、凝胶柱的再生和保存、凝胶柱的再生和保存 四、四、优点优点：操作条件温和，适于分离不稳定的化合物，：操作条件温和，适于分离不稳定的化合物，回收率高，分离效果好，重现性强，分离需时短，回收率高，分离效果好，重现性强，分离需时短，柱可反柱可反复使用复使用。n n五、五、用途：用途：广泛用于生化物质的分离，脱盐，制备，广泛用于生化物质的分离，脱盐，制备，分子分子质量的测定质量的测定等。等。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第六节 离子交换层析n n一、原理一、原理：在含有可与：在含有可与周围介质周围介质进行离子交换进行离子交换的基质上进行化合物分离的方法叫的基质上进行化合物分离的方法叫离子交换层离子交换层析析。离子交换层析是根据物质的。离子交换层析是根据物质的酸碱性，极性酸碱性，极性，和和分子的大小分子的大小的差异而进行的的差异而进行的柱层析柱层析技术。技术。n n二、二、离子交换材料离子交换材料：阳离子交换树脂阳离子交换树脂和和阴离子阴离子交换树脂交换树脂。带有酸性可电离基团的以。带有酸性可电离基团的以SO3HSO3H表表示，称为示，称为阳离子交换树脂阳离子交换树脂；带有碱性可以电离；带有碱性可以电离基团以基团以R4NOHR4NOH表示，称为表示，称为阴离子交换树脂阴离子交换树脂。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n三、离子交换层析的三、离子交换层析的操作步骤操作步骤 1 1、离子交换剂的处理、再生和转型离子交换剂的处理、再生和转型 常规处理是加适量的水悬浮除去细颗粒，然常规处理是加适量的水悬浮除去细颗粒，然后再用酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要后再用酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要的反离子；使用过的离子交换剂可采用酸、碱反的反离子；使用过的离子交换剂可采用酸、碱反复处理使其恢复原来的性质；改型是指离子交换复处理使其恢复原来的性质；改型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程。剂由一种反离子转到另一种反离子的过程。 2 2、分离物质的交换分离物质的交换 3 3、物质的洗脱与收集物质的洗脱与收集06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n四、离子交换层析前要注意以下几点四、离子交换层析前要注意以下几点： 1 1，离子交换剂的选择离子交换剂的选择：考虑被分离物质带有什：考虑被分离物质带有什么样的电荷；分子的大小；物理化学性质等。么样的电荷；分子的大小；物理化学性质等。 2 2，离子交换剂的准备离子交换剂的准备：除去交换剂中的杂质；：除去交换剂中的杂质；交换剂的溶胀；除去交换剂中细小的微粒；改型。交换剂的溶胀；除去交换剂中细小的微粒；改型。 3 3，缓冲液的选择缓冲液的选择：对阴离子交换剂应当用阳离：对阴离子交换剂应当用阳离子缓冲液；对于阴离子交换剂应用阴离子交换剂；子缓冲液；对于阴离子交换剂应用阴离子交换剂；缓冲液离子的缓冲液离子的PKPK值要在所用的值要在所用的PHPH值附近；缓冲系值附近；缓冲系统的选择不影响分离物质的活性，溶解度，不干统的选择不影响分离物质的活性，溶解度，不干扰分析；选择的扰分析；选择的PHPH值决定于被分离物质的等电点，值决定于被分离物质的等电点，稳定性和溶解度。稳定性和溶解度。 五、五、应用：应用：用来分离极性较强，电离度大的混合用来分离极性较强，电离度大的混合物。物。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第七节 亲和层析n n一、一、原理原理：利用某些生物分子之间：利用某些生物分子之间专一可逆结专一可逆结合特性合特性的分离方法的分离方法n n二、基本操作二、基本操作：寻找能被分离分子（：寻找能被分离分子（配体配体）识）识别和可逆结合的专一性物质别和可逆结合的专一性物质配基配基；把配基；把配基共价结合到层析介质（共价结合到层析介质（载体载体）上，即把配基固）上，即把配基固定化；把定化；把载体配基载体配基复合物罐装在层析柱内复合物罐装在层析柱内做成亲和柱；上样亲和，洗涤杂质，洗脱收集做成亲和柱；上样亲和，洗涤杂质，洗脱收集亲和分子（配体），亲和柱再生。亲和分子（配体），亲和柱再生。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n三、亲和层析介质三、亲和层析介质载体的选择要求载体的选择要求： 1 1，非特异性吸附作用要低，与其它大分子的作，非特异性吸附作用要低，与其它大分子的作用很微弱。用很微弱。 2 2，必须具有很好的液体流动性，必须具有很好的液体流动性 3 3，在较宽的，在较宽的PHPH，离子强度和变性剂浓度范围内，离子强度和变性剂浓度范围内具有化学和物理稳定性具有化学和物理稳定性 4 4，必须具有合适的丰富的化学基团，配基可以，必须具有合适的丰富的化学基团，配基可以共价地和它结合，并在连接的条件下是稳定的共价地和它结合，并在连接的条件下是稳定的 5 5，必须具有非常有效的多孔性，必须具有非常有效的多孔性 常用的三种介质常用的三种介质：琼脂糖琼脂糖（常用），聚丙烯酰胺（常用），聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球。凝胶和受控多孔玻璃球。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n四、配基的选择四、配基的选择 配基是发生亲和反应的功能部位，也是载体和亲和分子配基是发生亲和反应的功能部位，也是载体和亲和分子之间的桥梁。之间的桥梁。 配基本身必须具备配基本身必须具备两个基团两个基团：一：一个能与载体共价结合个能与载体共价结合；一一个能与被亲和分子结合个能与被亲和分子结合 可以作为配基使用的物质有：可以作为配基使用的物质有：酶底物的类似物；效应物；酶底物的类似物；效应物；酶的辅助因子。酶的辅助因子。 选择好的配基有选择好的配基有两个标准两个标准：一是在：一是在蛋白质和配基之间必蛋白质和配基之间必须有强的亲和力须有强的亲和力；二是必须具有适当的化学基团，这种基；二是必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与大分子特异结合，但可以用来连接配基和团不参与配基与大分子特异结合，但可以用来连接配基和支持物，而且这种连接不影响配基和大分子结合的亲和力。支持物，而且这种连接不影响配基和大分子结合的亲和力。 配基和支持物的结合方法：配基和支持物的结合方法：载体结合法；物理吸附法；载体结合法；物理吸附法；交换法；包埋法。交换法；包埋法。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n五、应用 1、酶 2、抗原与抗体 3、结合蛋白和输送蛋白 4、受体蛋白 5、细胞及病毒 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第八节 气相色谱n n一、原理：混合样品随固定流速的一、原理：混合样品随固定流速的载气载气进入层析柱。此种进入层析柱。此种样品必须是样品必须是气态气态的，如果样品原是液态或固态，要使之进的，如果样品原是液态或固态，要使之进入层析柱的刹那间变成气态，层析柱内装有称为入层析柱的刹那间变成气态，层析柱内装有称为担体担体的颗的颗粒状惰性支持物，其表面为一类具有高沸点的有机化合物粒状惰性支持物，其表面为一类具有高沸点的有机化合物均匀地包裹着，使担体表面形成以一层很薄的液膜，当样均匀地包裹着，使担体表面形成以一层很薄的液膜，当样品气体进入层析柱遇到这种固定液时就能溶解在固定液中，品气体进入层析柱遇到这种固定液时就能溶解在固定液中，它遇热又能挥发到它遇热又能挥发到载气载气里，并随载气的定向流动而向前推里，并随载气的定向流动而向前推进，遇到新的固定相又被吸收，如此交替吸收和挥发，使进，遇到新的固定相又被吸收，如此交替吸收和挥发，使样品蒸汽所经过的每一点都进行着固定相和流动相之间的样品蒸汽所经过的每一点都进行着固定相和流动相之间的分配平衡。由于样品中组分在固定相和流动相的分配平衡。由于样品中组分在固定相和流动相的分配系数分配系数不同不同，经过一段时间后原来均匀混合的样品彼此分离了，经过一段时间后原来均匀混合的样品彼此分离了，被分离的组分按先后次序被载气带入鉴定器，在那里把进被分离的组分按先后次序被载气带入鉴定器，在那里把进入的样品组分浓度转换成电压，经放大后在自动记录仪上入的样品组分浓度转换成电压，经放大后在自动记录仪上记录下来。从给样到每一组分出现的层析峰记录下来。从给样到每一组分出现的层析峰s s上的时间称上的时间称为为保留时间保留时间，不同化合物在一定条件下有其特定的保留时，不同化合物在一定条件下有其特定的保留时间，还根据峰面积来计算各种化合物的含量，这就是气相间，还根据峰面积来计算各种化合物的含量，这就是气相色普法中气液层析的简单原理色普法中气液层析的简单原理 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n气相色谱仪的组成气相色谱仪的组成 1 1 载气载气：常用的气体有氢气，氮气，氦气，：常用的气体有氢气，氮气，氦气，CO2,CO2,氩气等，氩气等， 2 2 层析柱层析柱：仪器的重要组成部分，：仪器的重要组成部分， 3 3 支持物支持物（担体）：作用是支持固定液，这种物质无吸附（担体）：作用是支持固定液，这种物质无吸附性能，是惰性的，即不与固定相或要分离的组分起任何反性能，是惰性的，即不与固定相或要分离的组分起任何反应，高温下也不变性。应，高温下也不变性。 4 4 固定液固定液：没有挥发性，对要分离的组分有足够的溶解能：没有挥发性，对要分离的组分有足够的溶解能力。力。 5 5 样品样品：一般采用：一般采用ugug到到mgmg量范围，并尽可能以浓缩方式送量范围，并尽可能以浓缩方式送入柱内。入柱内。 6 6 鉴定器鉴定器：是测定流出气体组分的装置，要求能迅速地反：是测定流出气体组分的装置，要求能迅速地反应组分的变化，有很好的稳定性，有足够的灵敏度，重复应组分的变化，有很好的稳定性，有足够的灵敏度，重复性好，而且结构简单，与组分无作用，有较宽的操作温度。性好，而且结构简单，与组分无作用，有较宽的操作温度。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、气相色普的特点： 1 气体粘度小，气相与液相间的质量传递速率高，容易达到平衡。 2 检查气体中的组分比检定液体的组分容易 3 气液色普法中固定相液体的选择范围很广，操作温度范围也很宽。 4 由于有灵敏的检测器，样品用量很少。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n三、应用 1、分析蛋白质和氨基酸 2、分析核酸 3、分析糖类物质 4、分析脂肪酸 5、分析农药06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第九节 高效液相色谱n n一、原理一、原理：高效液相色普仪一般由溶剂槽，高压泵，：高效液相色普仪一般由溶剂槽，高压泵，分析柱，进样器，检测器，部分收集器，记录仪，数分析柱，进样器，检测器，部分收集器，记录仪，数据处理机等单元组成。据处理机等单元组成。 根据柱中根据柱中担体担体种类的不同，其分离原理有以下几类：种类的不同，其分离原理有以下几类：1 1，液液分配层析液液分配层析：利用溶质在流动相中的：利用溶质在流动相中的分配系数分配系数的的差别而达到分离的目的。差别而达到分离的目的。2 2，液固吸附层析液固吸附层析：利用溶质被固体吸附剂吸附能力的：利用溶质被固体吸附剂吸附能力的差别而达到分离的目的。差别而达到分离的目的。3 3，离子交换层析离子交换层析：通过溶质和树脂担体的交换作用，利：通过溶质和树脂担体的交换作用，利用不同溶质用不同溶质离子交换能力离子交换能力的差别而达到分离目的。的差别而达到分离目的。4 4，凝胶渗透层析凝胶渗透层析：按溶质：按溶质分子量大小分子量大小而分离。而分离。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU二、二、高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成 1 1、进样系统、进样系统 2 2、输液系统、输液系统 3 3、分离系统、分离系统 4 4、检测系统、检测系统 5 5、数据处理系统、数据处理系统三、三、应用应用 1 1、定性和定量分析、定性和定量分析 2 2、测定酶的活性、测定酶的活性 3 3、测定蛋白质的分子量、测定蛋白质的分子量 4 4、分离核酸和核蛋白、分离核酸和核蛋白四四、优点：高效，高灵敏度，高速，定量准确和应、优点：高效，高灵敏度，高速，定量准确和应用范围广。用范围广。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第三章 电泳n n电泳的概念：电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（动的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。n n电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄年俄国物理学家国物理学家ReRe ssss进行了世界上第一次电泳实进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在验）。但电泳技术的广泛应用，则是在19371937年年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用学、免疫学等领域得到了广泛应用。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU电泳的分类电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：原则上按电泳的原理来分，可分为二类：n n自由界面电泳自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。n n区带电泳区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散对流和扩散，以，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。又可分为不同的类型。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU按支持介质种类的不同，按支持介质种类的不同，区带电泳区带电泳可分为：可分为：纸电泳纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素为支持介质，：以醋酸纤维素为支持介质，主要在医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋主要在医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。泳分辨率高。 vv以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。进行分离。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳：以淀粉为支持介质，多用于同工酶分：以淀粉为支持介质，多用于同工酶分析。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性析。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，可重复性较差，加之电泳时间长，操作麻烦，分差，可重复性较差，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖为支持介质，一般用于：以琼脂糖为支持介质，一般用于核核酸酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。纯化及检测。其分辨率较高。vv聚丙烯酰胺和琼脂糖聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介是目前实验室最常用的支持介质质06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn另外根据支持介质形状不同，另外根据支持介质形状不同，区带电泳区带电泳可分为：可分为：板电泳和柱电泳板电泳和柱电泳。n 据用途不同，可分为：据用途不同，可分为：分析电泳、制备分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。电泳、定量电泳、免疫电泳。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU电泳槽及电泳仪水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU电泳条带06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第一节 基本原理 电泳电泳是在电场的作用下而产生的物质运是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。分离目的。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU若将带净电荷若将带净电荷若将带净电荷若将带净电荷Q Q Q Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：力为：力为：力为： F F F F引引引引=E Q =E Q =E Q =E Q （1 1）在溶液中在溶液中在溶液中在溶液中, , , ,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F F F阻阻阻阻 F F F F阻阻阻阻=6=6=6=6r r r rV (2)V (2)V (2)V (2) 当当当当F F F F引引引引=F=F=F=F阻阻阻阻时时时时 EQ= 6rEQ= 6rEQ= 6rEQ= 6rV (3)V (3)V (3)V (3) V= EQ/6r V= EQ/6r (4)(4)(4)(4) 由上式可以看出由上式可以看出由上式可以看出由上式可以看出, , , ,粒子的移动速度粒子的移动速度粒子的移动速度粒子的移动速度( ( ( (泳动速度泳动速度泳动速度泳动速度V)V)V)V)与电场强度与电场强度与电场强度与电场强度(E)(E)(E)(E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量(Q)(Q)(Q)(Q)成正比成正比成正比成正比, , , ,而与粒子的半径而与粒子的半径而与粒子的半径而与粒子的半径(r)(r)(r)(r)及溶及溶及溶及溶液的粘度液的粘度液的粘度液的粘度( ( ( () ) ) )成反比。成反比。成反比。成反比。非球形分子（如线状非球形分子（如线状非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNADNADNADNA）在电泳）在电泳）在电泳）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。关。关。关。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU V= EQ/6r V= EQ/6r (4) (4) 在一定在一定pHpH条件下，每一种分子都具有特条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。本原理。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU影响迁移率的因素 V= EQ/6r V= EQ/6r (4)(4) 由由由由（4 4 4 4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，为了便于比较，为了便于比较，为了便于比较，常用迁移率常用迁移率常用迁移率常用迁移率 m m m m（或称泳动率，指带电（或称泳动率，指带电（或称泳动率，指带电（或称泳动率，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）粒子在单位电场强度下的泳动速度）粒子在单位电场强度下的泳动速度）粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表代替泳动速度表代替泳动速度表代替泳动速度表示粒子的泳动情况。示粒子的泳动情况。示粒子的泳动情况。示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6m = V/E = Q/6m = V/E = Q/6m = V/E = Q/6r r r r （5 5 5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，由上式可以看出，由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷迁移率仅与球形粒子所带电荷迁移率仅与球形粒子所带电荷迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU 由于蛋白质、氨基酸以及核酸等的电离度由于蛋白质、氨基酸以及核酸等的电离度由于蛋白质、氨基酸以及核酸等的电离度由于蛋白质、氨基酸以及核酸等的电离度随溶液随溶液随溶液随溶液pHpHpHpH变化变化变化变化而不同，所以实际上常使用而不同，所以实际上常使用而不同，所以实际上常使用而不同，所以实际上常使用有效迁移率有效迁移率有效迁移率有效迁移率。有效迁移率。有效迁移率。有效迁移率。有效迁移率U U U U为为为为迁移率迁移率迁移率迁移率m m m m和当时条件下电离度和当时条件下电离度和当时条件下电离度和当时条件下电离度的乘积。的乘积。的乘积。的乘积。 U = maU = ma （6 6） 将（将（将（将（6 6 6 6）式代入（）式代入（）式代入（）式代入（5 5 5 5）式得：）式得：）式得：）式得： m = Q/6rm = Q/6rm = Q/6rm = Q/6r （5 5 5 5） U = U = Qa/6rQa/6r （7 7）n由（由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影响溶液粘度凡能影响溶液粘度的因素的因素如如温度温度，影响分子带电量，影响分子带电量Q Q及解离度及解离度的因素如的因素如pHpH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。的改变，都会对有效迁移率，产生影响。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受因素外，有效迁移率还受因素外，有效迁移率还受因素外，有效迁移率还受电渗电渗电渗电渗（是指在电场中，（是指在电场中，（是指在电场中，（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。选用离子强度适宜的溶液。选用离子强度适宜的溶液。选用离子强度适宜的溶液。离子强度离子强度离子强度离子强度影响粒子的影响粒子的影响粒子的影响粒子的 电动势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离电动势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离电动势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离电动势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。泳动速度越慢，反之越快。泳动速度越慢，反之越快。泳动速度越慢，反之越快。 总之，总之，总之，总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、溶液粘度、温度、溶液粘度、温度、溶液粘度、温度、pHpHpHpH、电渗及离子强度多种因素、电渗及离子强度多种因素、电渗及离子强度多种因素、电渗及离子强度多种因素的影响。的影响。的影响。的影响。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第二节 常用电泳支持介质n n一、一、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAG)(PAG) 是目前应用最广泛的电泳支持介质是目前应用最广泛的电泳支持介质, ,其机械强度高其机械强度高, ,弹性好弹性好, ,透明透明, ,化学性质稳定化学性质稳定, ,属于非离子型化合物属于非离子型化合物, ,没有吸附和电渗现象。没有吸附和电渗现象。 、凝胶的组成、凝胶的组成聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺是由是由丙烯酰胺丙烯酰胺（AcrAcr）和）和甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（BisBis）在催化剂在催化剂( (过硫酸氨，过硫酸氨，APSAPS）的作用下合成的。）的作用下合成的。 凝胶的物理性质用凝胶的物理性质用凝胶浓度凝胶浓度（T T）和）和交联度交联度（C C）两个参数来）两个参数来描述：描述：T%= T%= （Acr+Bis/VAcr+Bis/V）* *100100；C%=C%=（Bis/ Acr+BisBis/ Acr+Bis）* *100100。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU、影响凝胶孔径的因素影响凝胶孔径的因素影响凝胶孔径的因素影响凝胶孔径的因素 凝胶孔径大小主要凝胶孔径大小主要凝胶孔径大小主要凝胶孔径大小主要受浓度受浓度受浓度受浓度的影响，浓度越大，的影响，浓度越大，的影响，浓度越大，的影响，浓度越大，孔径越小。孔径越小。孔径越小。孔径越小。 凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度太凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度太凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度太凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。通常把小，凝胶稀软，不易操作。通常把小，凝胶稀软，不易操作。通常把小，凝胶稀软，不易操作。通常把7.5%7.5%7.5%7.5%的凝胶称的凝胶称的凝胶称的凝胶称为标准胶。当在标准凝胶浓度上分离效果不理想为标准胶。当在标准凝胶浓度上分离效果不理想为标准胶。当在标准凝胶浓度上分离效果不理想为标准胶。当在标准凝胶浓度上分离效果不理想时，可以调整凝胶浓度。当凝胶浓度确定之后，时，可以调整凝胶浓度。当凝胶浓度确定之后，时，可以调整凝胶浓度。当凝胶浓度确定之后，时，可以调整凝胶浓度。当凝胶浓度确定之后，交联度为交联度为交联度为交联度为5%5%5%5%时，凝胶具有最小的孔径。如果用聚时，凝胶具有最小的孔径。如果用聚时，凝胶具有最小的孔径。如果用聚时，凝胶具有最小的孔径。如果用聚丙烯酰胺凝胶分离大分子核酸，通常用大孔径凝丙烯酰胺凝胶分离大分子核酸，通常用大孔径凝丙烯酰胺凝胶分离大分子核酸，通常用大孔径凝丙烯酰胺凝胶分离大分子核酸，通常用大孔径凝胶。为了提高机械强度，最好加入胶。为了提高机械强度，最好加入胶。为了提高机械强度，最好加入胶。为了提高机械强度，最好加入0.5%0.5%0.5%0.5%琼脂糖或琼脂糖或琼脂糖或琼脂糖或在在在在3%3%3%3%的凝胶中加的凝胶中加的凝胶中加的凝胶中加20%20%20%20%蔗糖。蔗糖。蔗糖。蔗糖。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n、聚丙烯酰胺凝胶的合成、聚丙烯酰胺凝胶的合成、聚丙烯酰胺凝胶的合成、聚丙烯酰胺凝胶的合成n n、过硫酸氨过硫酸氨过硫酸氨过硫酸氨TEMEDTEMEDTEMEDTEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统化学催化聚合系统化学催化聚合系统 在此系统中，四甲基乙二胺（在此系统中，四甲基乙二胺（在此系统中，四甲基乙二胺（在此系统中，四甲基乙二胺（TEMEDTEMEDTEMEDTEMED）称为加）称为加）称为加）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的速剂，它能以自由基的形式存在。微量的速剂，它能以自由基的形式存在。微量的速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的的的的加入，可使过硫酸氨（加入，可使过硫酸氨（加入，可使过硫酸氨（加入，可使过硫酸氨（APSAPSAPSAPS引发剂）形成自由基。引发剂）形成自由基。引发剂）形成自由基。引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。酰胺凝胶。酰胺凝胶。酰胺凝胶。n n、核黄素核黄素核黄素核黄素TEMEDTEMEDTEMEDTEMED光聚合催化系统光聚合催化系统光聚合催化系统光聚合催化系统 在此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色在此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色在此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色在此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。用于大孔浓缩胶的配置。用于大孔浓缩胶的配置。用于大孔浓缩胶的配置。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n4 4 4 4、聚丙烯酰胺凝胶的性能、聚丙烯酰胺凝胶的性能、聚丙烯酰胺凝胶的性能、聚丙烯酰胺凝胶的性能制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点：下优点：下优点：下优点：n n1 1 1 1、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节，并且制备重复性好。和调节，并且制备重复性好。和调节，并且制备重复性好。和调节，并且制备重复性好。n n2 2 2 2、聚丙烯酰胺凝胶是碳、聚丙烯酰胺凝胶是碳、聚丙烯酰胺凝胶是碳、聚丙烯酰胺凝胶是碳- - - -碳结构，没有或很少带碳结构，没有或很少带碳结构，没有或很少带碳结构，没有或很少带有极性基团，因而吸附少，电荷作用小，不易和有极性基团，因而吸附少，电荷作用小，不易和有极性基团，因而吸附少，电荷作用小，不易和有极性基团，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。样品相互作用，化学性质比较稳定。样品相互作用，化学性质比较稳定。样品相互作用，化学性质比较稳定。n n3 3 3 3、凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，、凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，、凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，、凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，且需要样量较少。且需要样量较少。且需要样量较少。且需要样量较少。n n4 4 4 4、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。n n 由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二二 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖是一种直连多糖，在水浴中加热溶解，琼脂糖是一种直连多糖，在水浴中加热溶解，琼脂糖是一种直连多糖，在水浴中加热溶解，琼脂糖是一种直连多糖，在水浴中加热溶解，冷凝后靠糖链间的氢键作用形成凝胶冷凝后靠糖链间的氢键作用形成凝胶冷凝后靠糖链间的氢键作用形成凝胶冷凝后靠糖链间的氢键作用形成凝胶 调整琼脂糖浓度，可获得不同孔径的凝胶，用调整琼脂糖浓度，可获得不同孔径的凝胶，用调整琼脂糖浓度，可获得不同孔径的凝胶，用调整琼脂糖浓度，可获得不同孔径的凝胶，用作电泳支持介质。作电泳支持介质。作电泳支持介质。作电泳支持介质。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电由于琼脂糖具有亲水性及不含带电由于琼脂糖具有亲水性及不含带电由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生化物质的变性和吸荷的基团，因此很少引起敏感的生化物质的变性和吸荷的基团，因此很少引起敏感的生化物质的变性和吸荷的基团，因此很少引起敏感的生化物质的变性和吸附附附附，是分离生物高分子尤其是，是分离生物高分子尤其是，是分离生物高分子尤其是，是分离生物高分子尤其是核酸核酸核酸核酸的优良电泳介质。的优良电泳介质。的优良电泳介质。的优良电泳介质。用琼脂糖配置电泳凝胶，只需将琼脂糖在缓冲液中加用琼脂糖配置电泳凝胶，只需将琼脂糖在缓冲液中加用琼脂糖配置电泳凝胶，只需将琼脂糖在缓冲液中加用琼脂糖配置电泳凝胶，只需将琼脂糖在缓冲液中加热溶化，在将凝胶倒入电泳槽中即可。热溶化，在将凝胶倒入电泳槽中即可。热溶化，在将凝胶倒入电泳槽中即可。热溶化，在将凝胶倒入电泳槽中即可。 聚丙烯酰胺凝胶浓度在聚丙烯酰胺凝胶浓度在聚丙烯酰胺凝胶浓度在聚丙烯酰胺凝胶浓度在2.4%20%2.4%20%2.4%20%2.4%20%，分离范围，分离范围，分离范围，分离范围1.01.01.01.0101010106 6 6 63.33.33.33.3101010102 2 2 2DaDaDaDa；琼脂糖凝胶浓度在；琼脂糖凝胶浓度在；琼脂糖凝胶浓度在；琼脂糖凝胶浓度在0.1%2.5%0.1%2.5%0.1%2.5%0.1%2.5%，5 5 5 5101010108 8 8 85555101010104 4 4 406 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU三、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区三、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区三、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区三、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别别别别n n、分离范围不同分离范围不同分离范围不同分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。、凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。、凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同琼脂糖凝胶最薄只能达到；琼脂糖凝胶最薄只能达到；琼脂糖凝胶最薄只能达到；琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成聚丙烯酰胺凝胶可以制成聚丙烯酰胺凝胶可以制成聚丙烯酰胺凝胶可以制成. . . .，分辨率高。，分辨率高。，分辨率高。，分辨率高。、成本不同成本不同成本不同成本不同琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高、安全性不同安全性不同安全性不同安全性不同琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第三节第三节 非变性非变性聚丙烯酰胺凝胶盘状聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳电泳 聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓非变非变非变非变性凝胶性凝胶性凝胶性凝胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率受它的受它的受它的受它的静电荷与分子大小静电荷与分子大小静电荷与分子大小静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中两个因素的影响。因此在非变性凝胶中两个因素的影响。因此在非变性凝胶中两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是进行电泳是进行电泳是进行电泳是不能测得分子量的不能测得分子量的不能测得分子量的不能测得分子量的。所谓。所谓。所谓。所谓变性凝胶变性凝胶变性凝胶变性凝胶，即在凝胶中加入，即在凝胶中加入，即在凝胶中加入，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、变性剂，如尿素、变性剂，如尿素、变性剂，如尿素、SDS(SDS(SDS(SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠) ) ) )、巯基乙醇、巯基乙醇、巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTDTTDTT等。这等。这等。这等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与白质在这种变性凝胶中的迁移率与白质在这种变性凝胶中的迁移率与白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系它们分子量的对数成直线关系它们分子量的对数成直线关系它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得因此利用变性凝胶进行电泳可以测得因此利用变性凝胶进行电泳可以测得因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量蛋白质的分子量蛋白质的分子量蛋白质的分子量。目前应用。目前应用。目前应用。目前应用较多的变性剂为较多的变性剂为较多的变性剂为较多的变性剂为SDSSDSSDSSDS。本节介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与。本节介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与。本节介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与。本节介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与方法方法方法方法 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、二、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理原理：在：在区带电泳的基础上，以不连续的聚丙烯酰区带电泳的基础上，以不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、续性、缓冲液离子的不连续性、PHPH的不连的不连续性及电位梯度的不连续性续性及电位梯度的不连续性，使样品在不，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。然后进行分离。n n三、根据缓冲液的三、根据缓冲液的PHPH值的高低，可分为值的高低，可分为碱碱性系统、酸性系统和中性系统性系统、酸性系统和中性系统06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU碱性系统碱性系统n n碱性系统的组成碱性系统的组成碱性系统的组成碱性系统的组成n n1 1 1 1、分离胶分离胶分离胶分离胶，由，由，由，由T=7.5%T=7.5%T=7.5%T=7.5%，C=2.5%C=2.5%C=2.5%C=2.5%的单体溶液和的单体溶液和的单体溶液和的单体溶液和PH8.9PH8.9PH8.9PH8.9的的的的Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液经过硫酸氨催化聚合而成的缓冲液经过硫酸氨催化聚合而成的缓冲液经过硫酸氨催化聚合而成的缓冲液经过硫酸氨催化聚合而成的小孔径小孔径小孔径小孔径凝凝凝凝胶。被浓缩的样品进入分离胶后，在电荷效应和分子胶。被浓缩的样品进入分离胶后，在电荷效应和分子胶。被浓缩的样品进入分离胶后，在电荷效应和分子胶。被浓缩的样品进入分离胶后，在电荷效应和分子筛效应共同作用下得到分离。筛效应共同作用下得到分离。筛效应共同作用下得到分离。筛效应共同作用下得到分离。n n2 2 2 2、浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶，由，由，由，由T=3%T=3%T=3%T=3%，C=2%C=2%C=2%C=2%的单体溶液和的单体溶液和的单体溶液和的单体溶液和PH6.7PH6.7PH6.7PH6.7的的的的Tris-Tris-Tris-Tris-HClHClHClHCl缓冲液组成，经催化聚合而成的缓冲液组成，经催化聚合而成的缓冲液组成，经催化聚合而成的缓冲液组成，经催化聚合而成的大孔径大孔径大孔径大孔径凝胶。它使凝胶。它使凝胶。它使凝胶。它使样品在进入分离胶之前被浓缩成薄层，从而提高了电样品在进入分离胶之前被浓缩成薄层，从而提高了电样品在进入分离胶之前被浓缩成薄层，从而提高了电样品在进入分离胶之前被浓缩成薄层，从而提高了电泳分离的分辨率泳分离的分辨率泳分离的分辨率泳分离的分辨率n n3 3 3 3、样品胶，样品胶，样品胶，样品胶，由由由由T=3%T=3%T=3%T=3%，C=20%C=20%C=20%C=20%单体溶液、待分离样品溶单体溶液、待分离样品溶单体溶液、待分离样品溶单体溶液、待分离样品溶液以及液以及液以及液以及PH6.7PH6.7PH6.7PH6.7的的的的Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液。主要起抗对流的作用缓冲液。主要起抗对流的作用缓冲液。主要起抗对流的作用缓冲液。主要起抗对流的作用使样品不被电极缓冲液稀释。使样品不被电极缓冲液稀释。使样品不被电极缓冲液稀释。使样品不被电极缓冲液稀释。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n碱性系统的三种物理效应碱性系统的三种物理效应碱性系统的三种物理效应碱性系统的三种物理效应n n1 1 1 1、浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应 是由于柱胶中凝胶层的不连续性、缓冲离子成分的不连续性、是由于柱胶中凝胶层的不连续性、缓冲离子成分的不连续性、是由于柱胶中凝胶层的不连续性、缓冲离子成分的不连续性、是由于柱胶中凝胶层的不连续性、缓冲离子成分的不连续性、PHPHPHPH的不连续性及电泳开始后产生的电位梯度不连续性综合作用的不连续性及电泳开始后产生的电位梯度不连续性综合作用的不连续性及电泳开始后产生的电位梯度不连续性综合作用的不连续性及电泳开始后产生的电位梯度不连续性综合作用 形成形成形成形成的。的。的。的。n n2 2 2 2、电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应 蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。时，电荷效应仍起作用。时，电荷效应仍起作用。时，电荷效应仍起作用。n n3 3 3 3、分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应 当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pHpHpHpH值和凝胶值和凝胶值和凝胶值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的孔径突然改变，选择分离胶的孔径突然改变，选择分离胶的孔径突然改变，选择分离胶的pHpHpHpH值值值值8.98.98.98.9接近甘氨酸的接近甘氨酸的接近甘氨酸的接近甘氨酸的PkaPkaPkaPka值（值（值（值（9.79.79.79.79.89.89.89.8），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一个均一的电势梯度和个均一的电势梯度和个均一的电势梯度和个均一的电势梯度和pHpHpHpH条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同而被分开。度不同，表现的泳动率的不同而被分开。度不同，表现的泳动率的不同而被分开。度不同，表现的泳动率的不同而被分开。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU四四 操作步骤操作步骤n n1 1 1 1、凝胶的制备、凝胶的制备、凝胶的制备、凝胶的制备n n2 2 2 2、样品的准备、样品的准备、样品的准备、样品的准备n n3 3 3 3、加样、加样、加样、加样n n4 4 4 4、电泳、电泳、电泳、电泳n n5 5 5 5、剥胶、剥胶、剥胶、剥胶n n6 6 6 6、固定、固定、固定、固定n n7 7 7 7、染色、染色、染色、染色n n8 8 8 8、脱色、脱色、脱色、脱色n n9 9 9 9、结果记录、结果记录、结果记录、结果记录06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n1 1 1 1、凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备 配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很多：在凝胶架的孔洞内，加少许多：在凝胶架的孔洞内，加少许多：在凝胶架的孔洞内，加少许多：在凝胶架的孔洞内，加少许40%40%40%40%蔗糖溶液，然后把洗蔗糖溶液，然后把洗蔗糖溶液，然后把洗蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%1%1%1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。胶封住。胶封住。胶封住。n n 配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。室温下预温。室温下预温。室温下预温。n n 聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为为为为有些样品会抑制胶聚合；有些样品会抑制胶聚合；有些样品会抑制胶聚合；有些样品会抑制胶聚合；光照可引起某些蛋白质变光照可引起某些蛋白质变光照可引起某些蛋白质变光照可引起某些蛋白质变性；性；性；性；多了一道手续，延长制胶时间多了一道手续，延长制胶时间多了一道手续，延长制胶时间多了一道手续，延长制胶时间。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n、分离胶的制备分离胶的制备分离胶的制备分离胶的制备：按比例混合贮存液，：按比例混合贮存液，：按比例混合贮存液，：按比例混合贮存液，( ( ( (先不与过硫酸先不与过硫酸先不与过硫酸先不与过硫酸铵混合铵混合铵混合铵混合) ) ) )，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。标记，注胶到相同的高度。标记，注胶到相同的高度。标记，注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现务必勿使气泡出现务必勿使气泡出现务必勿使气泡出现。为了使凝。为了使凝。为了使凝。为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约3 3 3 35mm5mm5mm5mm高度，消除凝胶的弯月面。高度，消除凝胶的弯月面。高度，消除凝胶的弯月面。高度，消除凝胶的弯月面。加水要小心，切勿冲乱界面加水要小心，切勿冲乱界面加水要小心，切勿冲乱界面加水要小心，切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。n n 水层放好后，静置水层放好后，静置水层放好后，静置水层放好后，静置30303030分钟，使凝胶进行化学聚合反应。分钟，使凝胶进行化学聚合反应。分钟，使凝胶进行化学聚合反应。分钟，使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为聚合最适温度为聚合最适温度为聚合最适温度为25252525。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置2020202030303030分钟，聚合便完全。分钟，聚合便完全。分钟，聚合便完全。分钟，聚合便完全。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n、浓缩胶的制备浓缩胶的制备：分离胶聚合好后，用：分离胶聚合好后，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。按比例混合浓缩胶液的水。按比例混合浓缩胶液( (也预先抽气，也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀) )，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。放在两只水层压平胶面。放在两只20W20W以上功率的日以上功率的日光灯下，约离灯管光灯下，约离灯管101015cm15cm处，光下聚合处，光下聚合6060分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩胶应临用前制备。胶应临用前制备。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n2 2 2 2、样品的准备样品的准备样品的准备样品的准备n n 聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。清练习操作。清练习操作。清练习操作。n n 盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积，需要按体积，需要按体积，需要按体积，需要5 5 5 5100l100l100l100l的样品的样品的样品的样品( ( ( (约约约约0.10.10.10.12mm2mm2mm2mm高高高高) ) ) )；按含量；按含量；按含量；按含量需要需要需要需要5 5 5 5100g100g100g100g。实际上就是用。实际上就是用。实际上就是用。实际上就是用0.1%0.1%0.1%0.1%浓度的样品浓度的样品浓度的样品浓度的样品5 5 5 5100l100l100l100l。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，通常用少数组分的样品，通常用少数组分的样品，通常用少数组分的样品，通常用1010101020g20g20g20g，对于含有多种组分，对于含有多种组分，对于含有多种组分，对于含有多种组分的样品，可用到的样品，可用到的样品，可用到的样品，可用到200g200g200g200g。即每一凝胶的样品容纳量不仅指。即每一凝胶的样品容纳量不仅指。即每一凝胶的样品容纳量不仅指。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于5%5%5%5%。n n 近来，样品胶一般已改用样品液中加入近来，样品胶一般已改用样品液中加入近来，样品胶一般已改用样品液中加入近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%5%5%5%20%20%20%20%的蔗的蔗的蔗的蔗糖或糖或糖或糖或10%10%10%10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。糖液和甘油能起同样的效果。糖液和甘油能起同样的效果。糖液和甘油能起同样的效果。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n3 3、加样加样加样加样n n 加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。n n 加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。冲液互不干扰。冲液互不干扰。冲液互不干扰。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n4 4 4 4、电泳电泳电泳电泳n n 在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。缓冲系统为酸性时则相反。缓冲系统为酸性时则相反。缓冲系统为酸性时则相反。缓冲系统为酸性时则相反。DavisDavisDavisDavis标准状态的凝胶电泳，标准状态的凝胶电泳，标准状态的凝胶电泳，标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在在在在0 0 0 04444。打开电源开关，调节电流，开始时用。打开电源开关，调节电流，开始时用。打开电源开关，调节电流，开始时用。打开电源开关，调节电流，开始时用1 1 1 12mA/2mA/2mA/2mA/管，电泳管，电泳管，电泳管，电泳3 3 3 35 5 5 5分钟后，再逐渐升高到分钟后，再逐渐升高到分钟后，再逐渐升高到分钟后，再逐渐升高到4mA/4mA/4mA/4mA/管。不要一开始管。不要一开始管。不要一开始管。不要一开始就电流很高。电流最好不要超过就电流很高。电流最好不要超过就电流很高。电流最好不要超过就电流很高。电流最好不要超过5mA/5mA/5mA/5mA/管。太高的电流强度管。太高的电流强度管。太高的电流强度管。太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/43/43/43/4距离时，就距离时，就距离时，就距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。n n上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PHPHPHPH，如如如如PHPHPHPH值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n5 5 5 5、剥胶剥胶剥胶剥胶n n 为了防止电泳后凝胶中蛋白为了防止电泳后凝胶中蛋白为了防止电泳后凝胶中蛋白为了防止电泳后凝胶中蛋白( ( ( (酶酶酶酶) ) ) )盘状区带扩盘状区带扩盘状区带扩盘状区带扩散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用色，一般用色，一般用色，一般用2020202030ml30ml30ml30ml的注射器配上的注射器配上的注射器配上的注射器配上10cm10cm10cm10cm长的针头，长的针头，长的针头，长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓度较高，取出困难，可用度较高，取出困难，可用度较高，取出困难，可用度较高，取出困难，可用10%10%10%10%甘油水溶液代替水注甘油水溶液代替水注甘油水溶液代替水注甘油水溶液代替水注入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。应注意不要损伤胶柱表面。应注意不要损伤胶柱表面。应注意不要损伤胶柱表面。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n6 6 6 6、固定固定固定固定n n 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在7%7%7%7%乙酸或乙酸或乙酸或乙酸或12.5%12.5%12.5%12.5%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。也可浸泡在用的效果。也可浸泡在用的效果。也可浸泡在用的效果。也可浸泡在用7%7%7%7%乙酸或乙酸或乙酸或乙酸或12.5%12.5%12.5%12.5%三氯乙酸配三氯乙酸配三氯乙酸配三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。n n 三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样：其三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样：其三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样：其三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样：其分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的CCl3CCl3CCl3CCl3基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙酸一样。酸一样。酸一样。酸一样。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n7 7 7 7、染色染色染色染色n n 电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求：合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求：合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求：合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求：n n、必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧、必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧、必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧、必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描；中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描；中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描；中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描；n n、染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以、染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以、染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以、染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以利于背景的脱色；利于背景的脱色；利于背景的脱色；利于背景的脱色；n n、选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度；、选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度；、选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度；、选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度；n n、选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能、选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能、选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能、选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑10B10B10B10B、考马斯、考马斯、考马斯、考马斯亮蓝，亮蓝，亮蓝，亮蓝，1-1-1-1-苯胺基苯胺基苯胺基苯胺基-8-8-8-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下：萘磺酸等，其性能及染色原理如下：萘磺酸等，其性能及染色原理如下：萘磺酸等，其性能及染色原理如下：n n氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑10B10B10B10B (amino black 10B)(amino black 10B)(amino black 10B)(amino black 10B) C22H13O12N6S3Na3 C22H13O12N6S3Na3 C22H13O12N6S3Na3 C22H13O12N6S3Na3 MWMWMWMW715 max715 max715 max715 max620620620620630nm 630nm 630nm 630nm 氨基黑是酸性染料，其磺氨基黑是酸性染料，其磺氨基黑是酸性染料，其磺氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染但用氨基黑染但用氨基黑染但用氨基黑染SDS-SDS-SDS-SDS-蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一蛋白质时的着色度不等，色调不一蛋白质时的着色度不等，色调不一蛋白质时的着色度不等，色调不一( ( ( (有蓝、黑、棕等有蓝、黑、棕等有蓝、黑、棕等有蓝、黑、棕等) ) ) )，作，作，作，作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质身的蛋白质身的蛋白质身的蛋白质- - - -染料量染料量染料量染料量( ( ( (吸收值吸收值吸收值吸收值) ) ) )的标准曲线。的标准曲线。的标准曲线。的标准曲线。n n考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰R250(Coomassie brilliant blne R250) R250(Coomassie brilliant blne R250) R250(Coomassie brilliant blne R250) R250(Coomassie brilliant blne R250) 即即即即三苯基甲烷三苯基甲烷三苯基甲烷三苯基甲烷(triphenylmethane)(triphenylmethane)(triphenylmethane)(triphenylmethane) C46H44O7H3S2Na MW C46H44O7H3S2Na MW C46H44O7H3S2Na MW C46H44O7H3S2Na MW824 max824 max824 max824 max560560560560590nm 590nm 590nm 590nm 染色的灵敏度比氨基黑高染色的灵敏度比氨基黑高染色的灵敏度比氨基黑高染色的灵敏度比氨基黑高5 5 5 5倍。倍。倍。倍。尤其适用于尤其适用于尤其适用于尤其适用于SDSSDSSDSSDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎BeerBeerBeerBeer定律，用作定律，用作定律，用作定律，用作定量分析时要注意这点。定量分析时要注意这点。定量分析时要注意这点。定量分析时要注意这点。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰G250(Coomassie brilliant blneG250(Coomassie brilliant blneG250(Coomassie brilliant blneG250(Coomassie brilliant blne G250) G250) G250) G250)，即二甲花青亮蓝即二甲花青亮蓝即二甲花青亮蓝即二甲花青亮蓝(Xylene Cyanine brilliant Blue)(Xylene Cyanine brilliant Blue)(Xylene Cyanine brilliant Blue)(Xylene Cyanine brilliant Blue)，MWMWMWMW854854854854，maxmaxmaxmax590590590590610nm610nm610nm610nm，染色灵敏度不如，染色灵敏度不如，染色灵敏度不如，染色灵敏度不如R250R250R250R250，但比，但比，但比，但比氨基黑高氨基黑高氨基黑高氨基黑高3 3 3 3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。性好和稳定的染色，适于作定量分析。性好和稳定的染色，适于作定量分析。性好和稳定的染色，适于作定量分析。n n 氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是：都带有氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是：都带有氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是：都带有氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是：都带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此，用考亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此，用考亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此，用考亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此，用考马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外，考马斯亮兰的灵马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外，考马斯亮兰的灵马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外，考马斯亮兰的灵马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外，考马斯亮兰的灵敏度要比氨基黑高。敏度要比氨基黑高。敏度要比氨基黑高。敏度要比氨基黑高。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n、1-1-1-1-苯胺基苯胺基苯胺基苯胺基-8-8-8-8-萘磺酸萘磺酸萘磺酸萘磺酸(1-animo-naphthal (1-animo-naphthal (1-animo-naphthal (1-animo-naphthal sulfonic acidsulfonic acidsulfonic acidsulfonic acid简称简称简称简称ANS)ANS)ANS)ANS)，MWMWMWMW241241241241，本身无荧光，本身无荧光，本身无荧光，本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，凝胶在但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，凝胶在但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，凝胶在但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，凝胶在此染料溶液浸此染料溶液浸此染料溶液浸此染料溶液浸1 1 1 13 3 3 3分钟，用长波紫外灯照射时产分钟，用长波紫外灯照射时产分钟，用长波紫外灯照射时产分钟，用长波紫外灯照射时产生黄色荧光，可显示蛋白质生黄色荧光，可显示蛋白质生黄色荧光，可显示蛋白质生黄色荧光，可显示蛋白质100mg100mg100mg100mg，如果不明显，如果不明显，如果不明显，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol/L3mol/L3mol/L3mol/L盐酸中几秒至盐酸中几秒至盐酸中几秒至盐酸中几秒至2 2 2 2分钟，使表面蛋白质稍变性分钟，使表面蛋白质稍变性分钟，使表面蛋白质稍变性分钟，使表面蛋白质稍变性, , , ,然后再用然后再用然后再用然后再用n n ANSANSANSANS染色，这样可显示蛋白质染色，这样可显示蛋白质染色，这样可显示蛋白质染色，这样可显示蛋白质20g20g20g20g。这种染色。这种染色。这种染色。这种染色优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。影响抗体的产生。影响抗体的产生。影响抗体的产生。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU方方方方 法法法法固固固固 定定定定 液液液液染染染染 料料料料染色时间染色时间染色时间染色时间脱脱脱脱 色色色色氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑10B10B甲甲甲甲 醇醇醇醇7%7%乙酸乙酸乙酸乙酸0.1N0.1N氢氧化钠中氢氧化钠中氢氧化钠中氢氧化钠中1%1%氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑7%7%乙酸中乙酸中乙酸中乙酸中0.5%0.5%1%1%氨基氨基氨基氨基黑黑黑黑5 5分钟分钟分钟分钟( (室温室温室温室温) )2 2小时小时小时小时( (室温室温室温室温) )1010分钟分钟分钟分钟(96(96) )5%5%乙醇乙醇乙醇乙醇7%7%乙酸乙酸乙酸乙酸考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰 R250R25020%20%磺基水杨酸磺基水杨酸磺基水杨酸磺基水杨酸10%10%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸样品中含尿素的在样品中含尿素的在样品中含尿素的在样品中含尿素的在5%5%三氯乙酸中固三氯乙酸中固三氯乙酸中固三氯乙酸中固定定定定0.25%R2500.25%R250水溶液水溶液水溶液水溶液10%10%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸-1%R250-1%R2501919 1(V/V)1(V/V)5%5%磺基水杨酸和磺基水杨酸和磺基水杨酸和磺基水杨酸和1%R2501%R2501919 1 15 5分钟分钟分钟分钟( (室温室温室温室温) )0.50.5小时小时小时小时( (室温室温室温室温) )1 1小时小时小时小时( (室温室温室温室温) )7%7%乙酸乙酸乙酸乙酸10%10%三氯乙三氯乙三氯乙三氯乙酸酸酸酸90%90%甲酸甲酸甲酸甲酸考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰考马斯亮兰 G250G2506%6%乙酸乙酸乙酸乙酸12.5%12.5%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸6%6%乙酸中乙酸中乙酸中乙酸中1% G2501% G25012.5%12.5%三氯乙酸中三氯乙酸中三氯乙酸中三氯乙酸中0.1% 0.1% G250G2501010分钟分钟分钟分钟( (室温室温室温室温) )3030分钟分钟分钟分钟( (室温室温室温室温) )甲醇甲醇甲醇甲醇- -水水水水- -浓浓浓浓氨氨氨氨6464 3636 1 11-1-苯胺基苯胺基苯胺基苯胺基- -8-8-萘磺酸萘磺酸萘磺酸萘磺酸2mol/L2mol/L盐酸浸几秒盐酸浸几秒盐酸浸几秒盐酸浸几秒种种种种PH6.8PH6.8，0.1mol/L0.1mol/L磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐缓冲液中缓冲液中缓冲液中缓冲液中0.003%0.003%染料染料染料染料3 3分钟分钟分钟分钟Ponceau Ponceau 3R3R12.5%12.5%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH中中中中1%3R1%3R2 2分钟分钟分钟分钟( (室温室温室温室温) )5%5%乙醇乙醇乙醇乙醇固绿固绿固绿固绿7%7%乙酸乙酸乙酸乙酸7%7%乙酸中乙酸中乙酸中乙酸中1%1%固绿固绿固绿固绿2 2小时小时小时小时(5(5) )7%7%乙酸乙酸乙酸乙酸06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU 8 8 8 8、脱色脱色脱色脱色n n 凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有7%7%7%7%乙酸，甲乙酸，甲乙酸，甲乙酸，甲醇醇醇醇- - - -水水水水- - - -乙酸溶液等。经常更换新溶液，直到染料乙酸溶液等。经常更换新溶液，直到染料乙酸溶液等。经常更换新溶液，直到染料乙酸溶液等。经常更换新溶液，直到染料洗出，背景几乎无色为止。用氨基黑染色的，脱洗出，背景几乎无色为止。用氨基黑染色的，脱洗出，背景几乎无色为止。用氨基黑染色的，脱洗出，背景几乎无色为止。用氨基黑染色的，脱色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了短时间得出结果，可采用电泳脱色。即在一玻璃短时间得出结果，可采用电泳脱色。即在一玻璃短时间得出结果，可采用电泳脱色。即在一玻璃短时间得出结果，可采用电泳脱色。即在一玻璃或有机玻璃槽中盛或有机玻璃槽中盛或有机玻璃槽中盛或有机玻璃槽中盛7%7%7%7%的乙酸溶液，已染色的胶放的乙酸溶液，已染色的胶放的乙酸溶液，已染色的胶放的乙酸溶液，已染色的胶放置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电压压压压3030303040V40V40V40V，电流，电流，电流，电流0.5A0.5A0.5A0.5A左右，左右，左右，左右，1 1 1 12 2 2 2小时即可脱色完小时即可脱色完小时即可脱色完小时即可脱色完毕。毕。毕。毕。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n9 9 9 9、结果的记录结果的记录结果的记录结果的记录n n、绘制示意图绘制示意图绘制示意图绘制示意图，将各个样品的谱带如实地描绘下来，根，将各个样品的谱带如实地描绘下来，根，将各个样品的谱带如实地描绘下来，根，将各个样品的谱带如实地描绘下来，根据谱带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之。据谱带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之。据谱带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之。据谱带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之。n n一级宽带一级宽带一级宽带一级宽带 谱带色深而宽谱带色深而宽谱带色深而宽谱带色深而宽n n二级宽带二级宽带二级宽带二级宽带 谱带色浅而宽谱带色浅而宽谱带色浅而宽谱带色浅而宽 n n三级宽带三级宽带三级宽带三级宽带 谱带色极浅而宽谱带色极浅而宽谱带色极浅而宽谱带色极浅而宽 n n一级窄带一级窄带一级窄带一级窄带 谱带色深而窄谱带色深而窄谱带色深而窄谱带色深而窄n n二级窄带二级窄带二级窄带二级窄带 谱带色浅而窄谱带色浅而窄谱带色浅而窄谱带色浅而窄n n三级窄带三级窄带三级窄带三级窄带 谱带色极浅而窄谱带色极浅而窄谱带色极浅而窄谱带色极浅而窄 谱带扩散谱带扩散谱带扩散谱带扩散 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n、测量相对迁移率测量相对迁移率测量相对迁移率测量相对迁移率(Rf):(Rf):(Rf):(Rf):分离区带的泳动速度可用相对分离区带的泳动速度可用相对分离区带的泳动速度可用相对分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置剂移动的位置剂移动的位置剂移动的位置( ( ( (前沿前沿前沿前沿) ) ) )作一标记作一标记作一标记作一标记( ( ( (通常是插一根短铜丝通常是插一根短铜丝通常是插一根短铜丝通常是插一根短铜丝) ) ) )，染，染，染，染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。n nRfRfRfRf 谱带迁移距离谱带迁移距离谱带迁移距离谱带迁移距离/ / / / 前沿指示剂迁移距离前沿指示剂迁移距离前沿指示剂迁移距离前沿指示剂迁移距离n n测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。定。定。定。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n照相照相照相照相：采用透射照相方法，用照相机把谱带：采用透射照相方法，用照相机把谱带：采用透射照相方法，用照相机把谱带：采用透射照相方法，用照相机把谱带真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在试管中试管中试管中试管中( ( ( (注满脱色液或保存液注满脱色液或保存液注满脱色液或保存液注满脱色液或保存液) ) ) )拍摄。对于绿色、拍摄。对于绿色、拍摄。对于绿色、拍摄。对于绿色、蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色镜，能增加清晰度。镜，能增加清晰度。镜，能增加清晰度。镜，能增加清晰度。n n光密度计扫描定量光密度计扫描定量光密度计扫描定量光密度计扫描定量：把谱带放在光密度扫描：把谱带放在光密度扫描：把谱带放在光密度扫描：把谱带放在光密度扫描仪上，描绘谱带仪上，描绘谱带仪上，描绘谱带仪上，描绘谱带光密度曲线。配合计算机，光密度曲线。配合计算机，光密度曲线。配合计算机，光密度曲线。配合计算机，可作定量分析。可作定量分析。可作定量分析。可作定量分析。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第四节第四节 SDS-PAGESDS-PAGEn n一、一、一、一、原理原理原理原理 SDSSDSSDSSDS(sodium dodecyl sulfate)(sodium dodecyl sulfate)(sodium dodecyl sulfate)(sodium dodecyl sulfate)，H25C12NaSO4 MH25C12NaSO4 MH25C12NaSO4 MH25C12NaSO4 M288.38g/mol288.38g/mol288.38g/mol288.38g/mol，是一种很强的阴离子表面活性剂。，是一种很强的阴离子表面活性剂。，是一种很强的阴离子表面活性剂。，是一种很强的阴离子表面活性剂。SDSSDSSDSSDS能破坏蛋白质分能破坏蛋白质分能破坏蛋白质分能破坏蛋白质分子间的结构子间的结构子间的结构子间的结构( ( ( (尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内的二硫键还原打开的二硫键还原打开的二硫键还原打开的二硫键还原打开) ) ) )，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的形成牢固的带负电荷的形成牢固的带负电荷的形成牢固的带负电荷的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质-SDS-SDS-SDS-SDS复合物复合物复合物复合物。在一定条件下，。在一定条件下，。在一定条件下，。在一定条件下，SDSSDSSDSSDS与大与大与大与大多数蛋白质的结合比为多数蛋白质的结合比为多数蛋白质的结合比为多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g1.4gSDS/1g1.4gSDS/1g1.4gSDS/1g蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电荷的白质本身的净电荷的白质本身的净电荷的白质本身的净电荷的10101010倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电荷，从而清除不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。荷，从而清除不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。荷，从而清除不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。荷，从而清除不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。 SDSSDSSDSSDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质- - - -SDSSDSSDSSDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDSSDSSDSSDS复合物的短轴长度都一复合物的短轴长度都一复合物的短轴长度都一复合物的短轴长度都一样，约为样，约为样，约为样，约为10A10A10A10A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。 这样的蛋白质这样的蛋白质这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS-SDS-SDS复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，质原有电荷和形状的影响，质原有电荷和形状的影响，质原有电荷和形状的影响，迁移率迁移率迁移率迁移率只是椭圆棒的长度也就是只是椭圆棒的长度也就是只是椭圆棒的长度也就是只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分蛋白质分蛋白质分蛋白质分子量的函数子量的函数子量的函数子量的函数 测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为“ “标记物标记物标记物标记物” ”(maker)(maker)(maker)(maker)，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳，作出已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率标聚丙烯酰胺凝焦电泳，作出已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率标聚丙烯酰胺凝焦电泳，作出已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率标聚丙烯酰胺凝焦电泳，作出已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率标准曲线，从标准曲线上根据迁移率找出待测蛋白质样品的分子量准曲线，从标准曲线上根据迁移率找出待测蛋白质样品的分子量准曲线，从标准曲线上根据迁移率找出待测蛋白质样品的分子量准曲线，从标准曲线上根据迁移率找出待测蛋白质样品的分子量。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、设备二、设备二、设备二、设备n n 1 1 1 1、凝胶电泳装置、凝胶电泳装置、凝胶电泳装置、凝胶电泳装置n n 2 2 2 2、电源、电源、电源、电源n n 3 3 3 3、100100100100度的沸水度的沸水度的沸水度的沸水n n 4 4 4 4、EppendorfEppendorfEppendorfEppendorf管管管管n n 5 5 5 5、微量注射器（、微量注射器（、微量注射器（、微量注射器（50 or100ul50 or100ul50 or100ul50 or100ul）n n 6 6 6 6、干胶器、干胶器、干胶器、干胶器n n 7 7 7 7、带盖的玻璃、带盖的玻璃、带盖的玻璃、带盖的玻璃 orororor塑料小容器塑料小容器塑料小容器塑料小容器06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n三、操作步骤三、操作步骤n n1 1、制胶、制胶n n2 2、样品准备与上样、样品准备与上样n n3 3、电泳、电泳n n4 4、固定、染色、脱色、固定、染色、脱色n n5 5、分子量测定、分子量测定06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n四、应用四、应用四、应用四、应用n n 1 1 1 1、蛋白质纯度的分析、蛋白质纯度的分析、蛋白质纯度的分析、蛋白质纯度的分析n n 2 2 2 2、蛋白质分子量的测定、蛋白质分子量的测定、蛋白质分子量的测定、蛋白质分子量的测定n n 3 3 3 3、蛋白质水解的分析、蛋白质水解的分析、蛋白质水解的分析、蛋白质水解的分析n n 4 4 4 4、免疫沉淀蛋白的鉴定、免疫沉淀蛋白的鉴定、免疫沉淀蛋白的鉴定、免疫沉淀蛋白的鉴定n n 5 5 5 5、免疫印迹的第一步、免疫印迹的第一步、免疫印迹的第一步、免疫印迹的第一步n n 6 6 6 6、蛋白质修饰的鉴定、蛋白质修饰的鉴定、蛋白质修饰的鉴定、蛋白质修饰的鉴定n n 7 7 7 7、分离放射性标记的蛋白、分离放射性标记的蛋白、分离放射性标记的蛋白、分离放射性标记的蛋白06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第五节第五节 连续密度梯度电泳连续密度梯度电泳n n一、一、一、一、原理原理原理原理：如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的：如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的：如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的：如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的线性线性线性线性梯度梯度梯度梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度主要受到两个因素的影响：一是主要受到两个因素的影响：一是主要受到两个因素的影响：一是主要受到两个因素的影响：一是样品本身的电荷密度样品本身的电荷密度样品本身的电荷密度样品本身的电荷密度，二是，二是，二是，二是样品样品样品样品分子的大小分子的大小分子的大小分子的大小。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此在梯度凝但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此在梯度凝但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此在梯度凝但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此在梯度凝胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于分子本身的大小分子本身的大小分子本身的大小分子本身的大小，而与，而与，而与，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组分，电泳之后将依分，电泳之后将依分，电泳之后将依分，电泳之后将依分子质量大小分子质量大小分子质量大小分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形停留在不同的凝胶孔径层次中形停留在不同的凝胶孔径层次中形停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。成相应的区带。成相应的区带。成相应的区带。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、连续密度梯度电泳的二、连续密度梯度电泳的优点优点 1 1、具有使样品中各个组分浓缩的作用，、具有使样品中各个组分浓缩的作用，稀释的样品可以分次上样，不会影响分离稀释的样品可以分次上样，不会影响分离效果效果 2 2、可提供清晰的谱带，适合纯度鉴定、可提供清晰的谱带，适合纯度鉴定 3 3、可在一张胶片上同时测定分子质量分、可在一张胶片上同时测定分子质量分布范围相当大的多种蛋白质的分子质量布范围相当大的多种蛋白质的分子质量 4 4、可以测定天然状态蛋白质的分子质量、可以测定天然状态蛋白质的分子质量06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第六节第六节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳n n等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦(isoelectric focusing)(isoelectric focusing)(isoelectric focusing)(isoelectric focusing)，缩写为，缩写为，缩写为，缩写为IEFIEFIEFIEF或或或或EFEFEFEF，也称等电分离、等电点划分，等电，也称等电分离、等电点划分，等电，也称等电分离、等电点划分，等电，也称等电分离、等电点划分，等电点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展起来的电泳技术，它不仅用来分离、鉴定和测起来的电泳技术，它不仅用来分离、鉴定和测起来的电泳技术，它不仅用来分离、鉴定和测起来的电泳技术，它不仅用来分离、鉴定和测定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以结合结合结合结合SDSSDSSDSSDS电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各种蛋白质成分的图谱。种蛋白质成分的图谱。种蛋白质成分的图谱。种蛋白质成分的图谱。 因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n一、原理一、原理一、原理一、原理：聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成：聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成：聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成：聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成 的的的的两性电解质载体两性电解质载体两性电解质载体两性电解质载体，在电场的作用下会自发形，在电场的作用下会自发形，在电场的作用下会自发形，在电场的作用下会自发形成一个成一个成一个成一个连续连续连续连续PHPHPHPH梯度梯度梯度梯度。蛋白质样品在电泳中被分。蛋白质样品在电泳中被分。蛋白质样品在电泳中被分。蛋白质样品在电泳中被分离。运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳离。运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳离。运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳离。运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点不同，因而在等电聚焦中得到有效的分离。在不同，因而在等电聚焦中得到有效的分离。在不同，因而在等电聚焦中得到有效的分离。在不同，因而在等电聚焦中得到有效的分离。在等电聚焦中，利用等电聚焦中，利用等电聚焦中，利用等电聚焦中，利用各蛋白质组分等电点的差异各蛋白质组分等电点的差异各蛋白质组分等电点的差异各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛并不利用凝胶的分子筛并不利用凝胶的分子筛并不利用凝胶的分子筛作用。作用。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n二、二、等电聚焦的关键问题等电聚焦的关键问题 1 1、用载体两性电解质形成的、用载体两性电解质形成的PHPH梯度梯度 2 2、稳定集中的分离了蛋白质区带、稳定集中的分离了蛋白质区带 3 3、分离了的蛋白质的鉴定以及、分离了的蛋白质的鉴定以及PHPH的测的测量量 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU三、三、三、三、载体两性电解质必须具备的条件载体两性电解质必须具备的条件载体两性电解质必须具备的条件载体两性电解质必须具备的条件 1 1 1 1、它的化学组成应不同于被分离物，不干、它的化学组成应不同于被分离物，不干、它的化学组成应不同于被分离物，不干、它的化学组成应不同于被分离物，不干扰被分离物的鉴定。扰被分离物的鉴定。扰被分离物的鉴定。扰被分离物的鉴定。 2 2 2 2、它的分子量要小，这样便于与被分离的、它的分子量要小，这样便于与被分离的、它的分子量要小，这样便于与被分离的、它的分子量要小，这样便于与被分离的物质分开物质分开物质分开物质分开 3 3 3 3、具有化学惰性，不与被分离物质反应，、具有化学惰性，不与被分离物质反应，、具有化学惰性，不与被分离物质反应，、具有化学惰性，不与被分离物质反应，也不能使被分离物质变性也不能使被分离物质变性也不能使被分离物质变性也不能使被分离物质变性 4 4 4 4、在等电点处必须具有足够的缓冲能力、在等电点处必须具有足够的缓冲能力、在等电点处必须具有足够的缓冲能力、在等电点处必须具有足够的缓冲能力 5 5 5 5、在等电点处必须具有足够高的电导，以、在等电点处必须具有足够高的电导，以、在等电点处必须具有足够高的电导，以、在等电点处必须具有足够高的电导，以使一定的电流通过使一定的电流通过使一定的电流通过使一定的电流通过06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n等电聚焦的优点是等电聚焦的优点是等电聚焦的优点是等电聚焦的优点是： 、有很高的分辨率，可将等电点相差、有很高的分辨率，可将等电点相差、有很高的分辨率，可将等电点相差、有很高的分辨率，可将等电点相差0.010.010.010.010.02PH0.02PH0.02PH0.02PH单单单单位的蛋白质分开；位的蛋白质分开；位的蛋白质分开；位的蛋白质分开； 、一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走、一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走、一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走、一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；区带越走越窄；区带越走越窄；区带越走越窄； 、由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都、由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都、由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都、由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离； 、可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达、可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达、可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达、可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH0.01PH0.01PH0.01PH单位。单位。单位。单位。n n等电聚焦电泳也有缺点等电聚焦电泳也有缺点等电聚焦电泳也有缺点等电聚焦电泳也有缺点， 一、是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质一、是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质一、是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质一、是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，可能发生沉淀，可能发生沉淀，可能发生沉淀， 二、是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在二、是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在二、是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在二、是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第七节 双向凝胶电泳n n一、原理一、原理: :双向电泳是一种由任意两个单向电双向电泳是一种由任意两个单向电双向电泳是一种由任意两个单向电双向电泳是一种由任意两个单向电泳组合而成的泳组合而成的泳组合而成的泳组合而成的, , , ,在第一向电泳后再在与第一向在第一向电泳后再在与第一向在第一向电泳后再在与第一向在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。 1975197519751975年年年年OfarrellOfarrellOfarrellOfarrell和和和和KloseKloseKloseKlose分别建立了聚丙烯酰分别建立了聚丙烯酰分别建立了聚丙烯酰分别建立了聚丙烯酰胺凝胶双向电泳以来胺凝胶双向电泳以来胺凝胶双向电泳以来胺凝胶双向电泳以来, , , ,电泳方式有管状、垂直、电泳方式有管状、垂直、电泳方式有管状、垂直、电泳方式有管状、垂直、水平方式；但双向电泳的基本原理仍是水平方式；但双向电泳的基本原理仍是水平方式；但双向电泳的基本原理仍是水平方式；但双向电泳的基本原理仍是第一向第一向第一向第一向为等电聚焦为等电聚焦为等电聚焦为等电聚焦(Iso electrofocusing, IEF),(Iso electrofocusing, IEF),(Iso electrofocusing, IEF),(Iso electrofocusing, IEF),根根根根据蛋白质等电点的不同进行分离；第二向为据蛋白质等电点的不同进行分离；第二向为据蛋白质等电点的不同进行分离；第二向为据蛋白质等电点的不同进行分离；第二向为SDS SDS SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE),(SDS - PAGE),(SDS - PAGE),(SDS - PAGE),按亚按亚按亚按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和质量两次基分子量大小进行分离。经过电荷和质量两次基分子量大小进行分离。经过电荷和质量两次基分子量大小进行分离。经过电荷和质量两次分离后分离后分离后分离后, , , ,可以得到蛋白质分子的等电点和分子可以得到蛋白质分子的等电点和分子可以得到蛋白质分子的等电点和分子可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。量信息。量信息。量信息。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU二 操作步骤n n1 1、样品制备、样品制备n n2 2、IEFIEF电泳电泳( (包括等电聚焦凝胶柱的制备，包括等电聚焦凝胶柱的制备，预电泳，加样和电泳，剥胶，固定预电泳，加样和电泳，剥胶，固定) )n n3 3、平衡、平衡n n4 4、SDSSDSPAGEPAGE（配胶，制备凝胶板，电（配胶，制备凝胶板，电泳，剥胶和显色）泳，剥胶和显色）n n5 5、染色和保存。、染色和保存。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第八节第八节 毛细管电泳毛细管电泳n n一、一、一、一、原理原理原理原理：毛细血管的一端为：毛细血管的一端为：毛细血管的一端为：毛细血管的一端为正极正极正极正极，另一端为，另一端为，另一端为，另一端为负极负极负极负极，毛细，毛细，毛细，毛细管壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电管壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电管壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电管壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电离：离：离：离：H H H H2 2 2 2SiOSiOSiOSiO3 3 3 3=HSiO=HSiO=HSiO=HSiO3 3 3 3-+H+H+H+H+ + + +。结果使管壁带有一定的负电荷。结果使管壁带有一定的负电荷。结果使管壁带有一定的负电荷。结果使管壁带有一定的负电荷。由于静电感应，管中缓冲液中的正离子和偶极分子水的正由于静电感应，管中缓冲液中的正离子和偶极分子水的正由于静电感应，管中缓冲液中的正离子和偶极分子水的正由于静电感应，管中缓冲液中的正离子和偶极分子水的正极趋向管壁，从而形成一个极趋向管壁，从而形成一个极趋向管壁，从而形成一个极趋向管壁，从而形成一个双电层双电层双电层双电层。双电层中的正离子及。双电层中的正离子及。双电层中的正离子及。双电层中的正离子及定向排列的水分子在定向排列的水分子在定向排列的水分子在定向排列的水分子在电场力和毛细张力电场力和毛细张力电场力和毛细张力电场力和毛细张力的共同作用下，向的共同作用下，向的共同作用下，向的共同作用下，向负极移动，形成负极移动，形成负极移动，形成负极移动，形成电渗流电渗流电渗流电渗流，其方向与电场方向一致。不同组，其方向与电场方向一致。不同组，其方向与电场方向一致。不同组，其方向与电场方向一致。不同组分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运动。动。动。动。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是高压电高压电高压电高压电场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理。毛。毛。毛。毛细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n毛细管电泳仪毛细管电泳仪06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU二 分类n n1 1 1 1、毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳 CEZCEZCEZCEZ是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳; ; ; ;它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解质通信、通常是缓冲液作为背景电解质质通信、通常是缓冲液作为背景电解质质通信、通常是缓冲液作为背景电解质质通信、通常是缓冲液作为背景电解质(BGE)(BGE)(BGE)(BGE)，其作用，其作用，其作用，其作用是为电流的通过提供介质，建立稳定的电场，并影响是为电流的通过提供介质，建立稳定的电场，并影响是为电流的通过提供介质，建立稳定的电场，并影响是为电流的通过提供介质，建立稳定的电场，并影响样品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引样品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引样品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引样品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被分离成若干谱带。分离主要依赖于组分之间的有效淌分离成若干谱带。分离主要依赖于组分之间的有效淌分离成若干谱带。分离主要依赖于组分之间的有效淌分离成若干谱带。分离主要依赖于组分之间的有效淌度的差异。度的差异。度的差异。度的差异。CZECZECZECZE可以实现阴阳离子同时分离，但对中型可以实现阴阳离子同时分离，但对中型可以实现阴阳离子同时分离，但对中型可以实现阴阳离子同时分离，但对中型组分无分离效果。对组分无分离效果。对组分无分离效果。对组分无分离效果。对CZECZECZECZE中的毛细管和中的毛细管和中的毛细管和中的毛细管和BEGBEGBEGBEG进行修饰可进行修饰可进行修饰可进行修饰可以衍生出许多其他的以衍生出许多其他的以衍生出许多其他的以衍生出许多其他的CECECECE分离模式分离模式分离模式分离模式。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n2 2 2 2、毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 CIEFCIEFCIEFCIEF是使毛细管内形成是使毛细管内形成是使毛细管内形成是使毛细管内形成PHPHPHPH梯度，样品组梯度，样品组梯度，样品组梯度，样品组分因其等电电的不同而分离。通常使用等电点分因其等电电的不同而分离。通常使用等电点分因其等电电的不同而分离。通常使用等电点分因其等电电的不同而分离。通常使用等电点有一定分布的同系的混合两性电解质溶液作为有一定分布的同系的混合两性电解质溶液作为有一定分布的同系的混合两性电解质溶液作为有一定分布的同系的混合两性电解质溶液作为BGE,BGE,BGE,BGE,在外家电厂的作用下，在外家电厂的作用下，在外家电厂的作用下，在外家电厂的作用下，BGEBGEBGEBGE的组成沿毛细的组成沿毛细的组成沿毛细的组成沿毛细管轴向发生变化各两性电解按其等电大小依次管轴向发生变化各两性电解按其等电大小依次管轴向发生变化各两性电解按其等电大小依次管轴向发生变化各两性电解按其等电大小依次排列性成稳定的排列性成稳定的排列性成稳定的排列性成稳定的pHpHpHpH梯度。当两性样品（如蛋白梯度。当两性样品（如蛋白梯度。当两性样品（如蛋白梯度。当两性样品（如蛋白质）被引入后，在电场作用下，各组分均向等质）被引入后，在电场作用下，各组分均向等质）被引入后，在电场作用下，各组分均向等质）被引入后，在电场作用下，各组分均向等于其等电点值的于其等电点值的于其等电点值的于其等电点值的PHPHPHPH处移动，到达此点后因失去处移动，到达此点后因失去处移动，到达此点后因失去处移动，到达此点后因失去净电荷而停止移动从而实现分离。可以用改变净电荷而停止移动从而实现分离。可以用改变净电荷而停止移动从而实现分离。可以用改变净电荷而停止移动从而实现分离。可以用改变电解质体系或压力驱动的方式，进行洗脱。电解质体系或压力驱动的方式，进行洗脱。电解质体系或压力驱动的方式，进行洗脱。电解质体系或压力驱动的方式，进行洗脱。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n3 3 3 3、毛细管等速电泳毛细管等速电泳毛细管等速电泳毛细管等速电泳 毛细管等速电泳是一种不连续介质电泳毛细管等速电泳是一种不连续介质电泳毛细管等速电泳是一种不连续介质电泳毛细管等速电泳是一种不连续介质电泳技术。两极浸入不同的电解质溶液中，前导电技术。两极浸入不同的电解质溶液中，前导电技术。两极浸入不同的电解质溶液中，前导电技术。两极浸入不同的电解质溶液中，前导电解质中含有淌度大于样品中所有离子浓度的前解质中含有淌度大于样品中所有离子浓度的前解质中含有淌度大于样品中所有离子浓度的前解质中含有淌度大于样品中所有离子浓度的前导离子，尾随电解质中则含有淌度小于样品中导离子，尾随电解质中则含有淌度小于样品中导离子，尾随电解质中则含有淌度小于样品中导离子，尾随电解质中则含有淌度小于样品中所有离子淌度的尾随离子，样品加在两电解质所有离子淌度的尾随离子，样品加在两电解质所有离子淌度的尾随离子，样品加在两电解质所有离子淌度的尾随离子，样品加在两电解质的界面处，电泳达稳态后，各区带依次相随，的界面处，电泳达稳态后，各区带依次相随，的界面处，电泳达稳态后，各区带依次相随，的界面处，电泳达稳态后，各区带依次相随，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子殿后，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子殿后，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子殿后，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子殿后，分析物按淌度大小的顺序排列向一端移动。分析物按淌度大小的顺序排列向一端移动。分析物按淌度大小的顺序排列向一端移动。分析物按淌度大小的顺序排列向一端移动。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n4 4、毛细管移界电泳毛细管移界电泳 移界电泳是最早在分离中得到应用移界电泳是最早在分离中得到应用的一种技术，但由于它不能实现组分的的一种技术，但由于它不能实现组分的完全分离，逐渐地被其他电泳方式所代完全分离，逐渐地被其他电泳方式所代替。使用毛细管后，其分离效率比较常替。使用毛细管后，其分离效率比较常规称界电泳大为提高，但并不能使该技规称界电泳大为提高，但并不能使该技术竞争过其它模式。术竞争过其它模式。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU 5 5、毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 电泳是在凝胶填充的毛细管内进电泳是在凝胶填充的毛细管内进行，样品中各组分不仅受电场力的作用，行，样品中各组分不仅受电场力的作用，耐用，而且还受凝胶的尺寸排阻效应耐用，而且还受凝胶的尺寸排阻效应（分子筛效应）的影响，因此提高了分（分子筛效应）的影响，因此提高了分离度，对荷离度，对荷/ /质比接近但分离分子大小形质比接近但分离分子大小形状不同的样品如蛋白质、状不同的样品如蛋白质、RNARNA、DNADNA及其及其碎片具有很高的分离能力。常用的凝胶碎片具有很高的分离能力。常用的凝胶材料有交联或非交联凝胶两类。材料有交联或非交联凝胶两类。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第九节 琼脂糖凝胶电泳n n对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。n n琼脂糖是经过挑选、质地较纯的琼脂作原料制成的。琼脂在化学琼脂糖是经过挑选、质地较纯的琼脂作原料制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羧基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质给电泳和凝胶过和羧基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质给电泳和凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是一直链多糖，它由滤以不良影响。琼脂糖是一直链多糖，它由D-D-半乳糖和半乳糖和3 3，6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖的残基交替排列组成。半乳糖的残基交替排列组成。n n琼脂糖和琼脂一样也能形成凝胶。形成凝胶主要由于氢键的缘故。琼脂糖和琼脂一样也能形成凝胶。形成凝胶主要由于氢键的缘故。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生物化学物质的变性和吸附，它是一种较好的电泳和免疫扩散的生物化学物质的变性和吸附，它是一种较好的电泳和免疫扩散实验的抗对流剂和层析分子筛的实验的抗对流剂和层析分子筛的 填空材料。填空材料。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第十节第十节 免疫电泳免疫电泳n n把电泳技术与免疫扩散结合起来，叫做把电泳技术与免疫扩散结合起来，叫做把电泳技术与免疫扩散结合起来，叫做把电泳技术与免疫扩散结合起来，叫做免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳。 免疫电泳技术是基于免疫电泳技术是基于免疫电泳技术是基于免疫电泳技术是基于抗原的电泳迁移以及与抗体的专一抗原的电泳迁移以及与抗体的专一抗原的电泳迁移以及与抗体的专一抗原的电泳迁移以及与抗体的专一性免疫沉淀反应性免疫沉淀反应性免疫沉淀反应性免疫沉淀反应。在大部分电泳中，样品中的抗原通。在大部分电泳中，样品中的抗原通。在大部分电泳中，样品中的抗原通。在大部分电泳中，样品中的抗原通过含有相应抗体的过含有相应抗体的过含有相应抗体的过含有相应抗体的pH8.6pH8.6pH8.6pH8.6的薄层琼脂糖凝胶，抗原在的薄层琼脂糖凝胶，抗原在的薄层琼脂糖凝胶，抗原在的薄层琼脂糖凝胶，抗原在pH8.6pH8.6pH8.6pH8.6时通常时通常时通常时通常带强负电带强负电带强负电带强负电，而抗体在此，而抗体在此，而抗体在此，而抗体在此pHpHpHpH不带电，不能迁不带电，不能迁不带电，不能迁不带电，不能迁移。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。移。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。移。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。移。抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应。最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，最初，抗原过量，所以仅产生可溶性的免疫混合物，与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就与抗原一起向阳极移动，当抗体与抗原比例合适时就形成大的、不溶性的免疫沉淀。形成大的、不溶性的免疫沉淀。形成大的、不溶性的免疫沉淀。形成大的、不溶性的免疫沉淀。应用应用应用应用：可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制：可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制：可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制：可用于检查蛋白质制剂的纯度，研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体，检验两种抗原是否相同等。是否相同等。是否相同等。是否相同等。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第十一节 单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳 n n单细胞凝胶电泳分析（单细胞凝胶电泳分析（单细胞凝胶电泳分析（单细胞凝胶电泳分析（single cell gel single cell gel single cell gel single cell gel eletrophoresiseletrophoresiseletrophoresiseletrophoresis，SCGESCGESCGESCGE）是由）是由）是由）是由OstlingOstlingOstlingOstling等等等等（1984198419841984）首创，后经）首创，后经）首创，后经）首创，后经SinghSinghSinghSingh等（等（等（等（1988198819881988）进一步）进一步）进一步）进一步完善并逐渐发展起来的完善并逐渐发展起来的完善并逐渐发展起来的完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞一种快速检测单细胞一种快速检测单细胞一种快速检测单细胞 DNADNADNADNA损伤损伤损伤损伤的实验方法，适用于多种细胞，能够的实验方法，适用于多种细胞，能够的实验方法，适用于多种细胞，能够的实验方法，适用于多种细胞，能够灵敏地检测灵敏地检测灵敏地检测灵敏地检测DNADNADNADNA断裂，在检测诱变剂、射线等断裂，在检测诱变剂、射线等断裂，在检测诱变剂、射线等断裂，在检测诱变剂、射线等对对对对DNADNADNADNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传的损伤、监测环境污染物对机体的遗传的损伤、监测环境污染物对机体的遗传的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其价值。因其价值。因其价值。因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星实验（实验（实验（实验（comet assaycomet assaycomet assaycomet assay）。 06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAUn n原理：原理：原理：原理：有核细胞的有核细胞的有核细胞的有核细胞的DNADNADNADNA分子量很大，分子量很大，分子量很大，分子量很大，DNADNADNADNA超螺旋结构附着在超螺旋结构附着在超螺旋结构附着在超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的细胞内的细胞内的细胞内的RNARNARNARNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核裂解液中，但核裂解液中，但核裂解液中，但核DNADNADNADNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNADNADNADNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（pH=8pH=8pH=8pH=8）中，核中，核中，核中，核DNADNADNADNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响并不影响并不影响并不影响DNADNADNADNA双螺旋大分子的连续性。只有当双螺旋大分子的连续性。只有当双螺旋大分子的连续性。只有当双螺旋大分子的连续性。只有当DNADNADNADNA双链断裂双链断裂双链断裂双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（pH13pH13pH13pH13）中，）中，）中，）中，先是先是先是先是DNADNADNADNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNADNADNADNA向阳向阳向阳向阳性迁移，形成性迁移，形成性迁移，形成性迁移，形成拖尾拖尾拖尾拖尾。细胞。细胞。细胞。细胞DNADNADNADNA受损愈重，产生的断链或碱受损愈重，产生的断链或碱受损愈重，产生的断链或碱受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的下迁移的下迁移的下迁移的DNADNADNADNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此部荧光强度增强，因此部荧光强度增强，因此部荧光强度增强，因此，通过测定，通过测定，通过测定，通过测定DNADNADNADNA迁移部分的光密度迁移部分的光密度迁移部分的光密度迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞或迁移长度可定量地测定单个细胞或迁移长度可定量地测定单个细胞或迁移长度可定量地测定单个细胞DNADNADNADNA损伤的程度。损伤的程度。损伤的程度。损伤的程度。06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU二 单细胞凝胶电泳基本过程 、制片、细胞裂解 、电泳、图象分析：06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第十二节 电泳检测技术n n一、染色一、染色n n1 1 、 一般染色法一般染色法n n、硝酸銀硝酸銀 (ammoniacal silver) (ammoniacal silver) 染色染色：n n、Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 染染色色：n n 、紫外线照射法紫外线照射法n n 3 3 、 KClKCl 沉淀法沉淀法n n 4 4 、活性染色法活性染色法n n 5 5 、放射放射自显影法自显影法 (autoradiography)(autoradiography)06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU第十三节：印迹技术n n英格兰爱丁堡大学英格兰爱丁堡大学英格兰爱丁堡大学英格兰爱丁堡大学E.M.SouthernE.M.Southern于于于于19751975年创立了一年创立了一年创立了一年创立了一种把凝胶电泳，固定化技术和分子杂交融为一体的新种把凝胶电泳，固定化技术和分子杂交融为一体的新种把凝胶电泳，固定化技术和分子杂交融为一体的新种把凝胶电泳，固定化技术和分子杂交融为一体的新方法。他把限制性内切酶硝化后的方法。他把限制性内切酶硝化后的方法。他把限制性内切酶硝化后的方法。他把限制性内切酶硝化后的DNADNA片段进行琼脂片段进行琼脂片段进行琼脂片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，再借助糖凝胶电泳分离，再借助糖凝胶电泳分离，再借助糖凝胶电泳分离，再借助毛细作用毛细作用毛细作用毛细作用把凝胶上的区带转把凝胶上的区带转把凝胶上的区带转把凝胶上的区带转移并吸附于移并吸附于移并吸附于移并吸附于硝酸纤维素滤纸硝酸纤维素滤纸硝酸纤维素滤纸硝酸纤维素滤纸上并使之上并使之上并使之上并使之固定固定固定固定化。最后用化。最后用化。最后用化。最后用特定的特定的特定的特定的放射性放射性放射性放射性RNARNA作为探针，使之和固定化纸上特异作为探针，使之和固定化纸上特异作为探针，使之和固定化纸上特异作为探针，使之和固定化纸上特异性区带进行性区带进行性区带进行性区带进行DNA-RNADNA-RNA杂交。通过杂交。通过杂交。通过杂交。通过放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影检出了检出了检出了检出了所需的所需的所需的所需的DNADNA片段，由于此过程类似于把墨汁吸到纸上片段，由于此过程类似于把墨汁吸到纸上片段，由于此过程类似于把墨汁吸到纸上片段，由于此过程类似于把墨汁吸到纸上而称为印迹术。而称为印迹术。而称为印迹术。而称为印迹术。n n目前有四种印迹术：目前有四种印迹术：目前有四种印迹术：目前有四种印迹术：DNADNA印迹术（印迹术（印迹术（印迹术（Southern Southern blotting);RNAblotting);RNA印迹术（印迹术（印迹术（印迹术（Northern blotting);Northern blotting);蛋白蛋白蛋白蛋白质印迹术（质印迹术（质印迹术（质印迹术（Western blotting);Western blotting);等电聚焦后双向印迹等电聚焦后双向印迹等电聚焦后双向印迹等电聚焦后双向印迹术术术术(Eastern blotting)(Eastern blotting)06 06 九月九月 2024 2024SWAUSWAU