何肖娟生物化学与分子生物学实验教学中心血清清蛋白、g-球蛋白的别离、提纯与鉴定2021年秋季学期年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心内内 容容实验目的实验目的1实验原理实验原理2实验材料实验材料3实验过程实验过程45本卷须知本卷须知2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心实验目的1.掌握盐析法别离蛋白质的原理和根本方法掌握盐析法别离蛋白质的原理和根本方法2.掌握凝胶层析法别离蛋白质的原理和根本方法掌握凝胶层析法别离蛋白质的原理和根本方法3.掌握离子交换层析法别离蛋白质的原理和根本方法掌握离子交换层析法别离蛋白质的原理和根本方法4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和根本方法掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和根本方法5.了解柱层析技术了解柱层析技术2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心实验原理v蛋白质的别离和纯化是研究蛋白质化学及蛋白质的别离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。其生物学功能的重要手段。v不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差异，可别都有所不同。利用这些性质的差异，可别离纯化各种蛋白质。离纯化各种蛋白质。2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心 蛋白质的理化性质与常用的别离纯化方法蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质常用的纯化方法常用的纯化方法分子质量分子质量透析、超滤透析、超滤凝胶层析凝胶层析离心离心溶解度溶解度调整调整pH调整离子强度调整离子强度降低介电常数降低介电常数电荷电荷电泳电泳等电聚焦等电聚焦离子交换层析离子交换层析特异结合部位特异结合部位亲和层析亲和层析其他性质其他性质吸附层析吸附层析液相层析液相层析气相层析气相层析2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心球球 蛋蛋 白白 1 2 等电点等电点4.885.065.065.126.857.3相对分子量相对分子量（104）6.9203091515.630含量（）含量（）576725496.2121220血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白清蛋白 A2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心1. 粗提盐析法v由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。所需的盐浓度也不一样。v调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而到达别离的目的。到达别离的目的。血清清蛋白血清清蛋白球蛋白球蛋白半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解球蛋白沉淀，蒸馏水溶解2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心2. 脱盐凝胶层析v盐析别离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须盐析别离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。先脱盐后才能进一步纯化。v脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。v凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其别离的技术。小的不同而将其别离的技术。2021年秋季学期凝胶层析别离示意图凝胶层析别离示意图2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心凝凝胶胶层层析析别别离离化化合合物物示示意意图图2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心3.纯化离子交换层析v离子交换层析是指流动相中的离子和固定离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行别离的电荷性质及电荷量不同进行别离R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-2021年秋季学期0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白清蛋白pI 4.9，带，带负电荷多负电荷多 、 球蛋白球蛋白pI 5.05.2，带带负电荷少负电荷少 、 球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及清蛋白及 、 球蛋白的球蛋白的pI6.5 ，带，带负电荷负电荷 球蛋白球蛋白pI 6.5，带带正电荷正电荷清蛋白及清蛋白及 、 球蛋白球蛋白被层析柱吸附被层析柱吸附, -球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱清蛋白被洗脱2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心4.纯度鉴定电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心三、实验材料v人血清人血清v葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-25)层析柱层析柱vDEAE纤维离子交换层析柱纤维离子交换层析柱v饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液v20%磺基水杨酸磺基水杨酸v1%BaCl2溶液溶液v电泳仪、电泳槽电泳仪、电泳槽2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心四、实验过程v盐析粗别离盐析粗别离v葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐vDEAE纤维素离子交换层析纯化纤维素离子交换层析纯化v醋酸纤维素薄膜电泳纯度鉴定醋酸纤维素薄膜电泳纯度鉴定2021年秋季学期用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 取取血血清清0.8ml，边边摇摇边边缓缓慢慢滴滴加加饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液0.8ml，混匀室温放置混匀室温放置10min，4000r/min离心离心10min沉淀含球蛋白加水沉淀含球蛋白加水 0.6ml溶解溶解上清液含清蛋白、少量上清液含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白和球蛋白约球蛋白约0.8ml用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 凝凝 胶胶 柱柱 层层 析析 除除 盐盐继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液冲液(2ml)洗脱，流出液量约洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继继续续用用0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液洗涤约洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱1.07cm过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱1.07cm继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液洗脱，流出液量约冲液洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继继续续用用0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液洗涤约洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡盐盐析析操作流程操作流程离子交换柱层析纯化离子交换柱层析纯化加样加样加样加样2021年秋季学期用用1ml 0.0mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清洗层析柱内壁清洗层析柱内壁, 离 子 交 换 柱 层 纯 化除盐后收集的清蛋白除盐后收集的清蛋白用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲冲液液清清洗层析柱内壁洗层析柱内壁, 取取浓浓度度最最高高的的1管管作作纯纯度度鉴鉴定定醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法继继续续用用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓缓冲液冲液(3ml)洗脱，流出液量约洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收收集集含含有有蛋蛋白白质质的的洗洗脱脱液液每管每管10d，连续收集，连续收集3管管DEAE-纤纤维维素素柱柱不不用用再再生生，可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白除盐后收集的球蛋白除盐后收集的球蛋白过过DEAE-纤维素层析柱纤维素层析柱（1.06cm）过过DEAE-纤维素层析柱纤维素层析柱1.06cm用用约约mL 0.06mol/L NH4AC缓缓冲冲液液流流洗洗，除去除去球蛋白和球蛋白和球蛋白球蛋白用用0.3mol/L NH4AC缓缓冲冲液液(约约3ml)洗洗脱脱，流出液量约流出液量约2.5ml磺基水杨酸检测蛋白质收收集集含含有有清清蛋蛋白白的的洗洗脱脱液液每管每管10d，连续收集，连续收集2管管DEAE-纤纤维维素素柱柱先先用用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶溶液液流流洗洗，再再用用10ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲液流洗再生平衡冲液流洗再生平衡离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定2管均作纯度鉴定管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法)2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心五、本卷须知v所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。v使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。v上样时，滴管应沿柱上端内壁参加样品，动作应轻、慢，上样时，滴管应沿柱上端内壁参加样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。v洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。并注意层析柱不要流干，进入空气。v切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的的BaCl2混淆，混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。v葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,防止损耗，严禁倒掉防止损耗，严禁倒掉!2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心醋酸纤维素薄膜电泳原理 血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们别离为清蛋白们别离为清蛋白Albumin)、1-球蛋白、球蛋白、2-球球蛋白、蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白5条区带。条区带。2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心醋酸纤维素薄膜电泳1. 点样点样(粗面粗面)8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）点样线点样线尽量点得细窄而均匀尽量点得细窄而均匀, ,宁少勿多宁少勿多小组标记小组标记样品标记样品标记2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心2. 电泳电泳薄膜粗面向下粗面向下点样端置阴极端点样端置阴极端两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平膜应轻轻拉平注意：注意：切勿使点样处与电泳槽接触切勿使点样处与电泳槽接触电压：电压：110V时间：时间：50min。2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心3. 染色和漂洗染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中直接浸于染色液中5min。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色一般更换液中浸洗脱色一般更换2次，至背景颜次，至背景颜色脱净为止。色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。取出膜，用滤纸吸干即可。2021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心思考题v1.硫酸铵盐析一步硫酸铵盐析一步,为什么是为什么是0.8ml血清加血清加0.8ml饱饱和硫酸铵和硫酸铵?v2.为什么实验中为什么实验中DEAE纤维素柱别离纤维素柱别离-球蛋白后不球蛋白后不用再生用再生,可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白?v3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定别离纯化后的血应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定别离纯化后的血清清蛋白和清清蛋白和-球蛋白的纯度球蛋白的纯度,根据什么来确定它是根据什么来确定它是清蛋白还是清蛋白还是-球蛋白球蛋白?判定它们纯度的依据是什么判定它们纯度的依据是什么?2021年秋季学期南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心2021年秋季学期年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心 实验预期结果-+血清血清清蛋白第清蛋白第1管管清蛋白第清蛋白第2管管-球蛋白管球蛋白管点点样线A-122021年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心2021年秋季学期