第十二章 遗传工程第一节 遗传工程概述 遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义：基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 1985年转基因植物获得成功1996年克隆羊诞生。现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 基因工程的基本步骤：基因工程的基本步骤：1.1.目的基因的分离或合成目的基因的分离或合成2.2.将目的基因与载体将目的基因与载体DNADNA连接，构建重组连接，构建重组DNADNA分分 子子- -表达载体表达载体3.3.将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞，并获得具有外分子导入受体细胞，并获得具有外 源基因的个体源基因的个体4.4.转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定5.5.转基因生物的安全性评价转基因生物的安全性评价 第二节 基因的分离基因分离（克隆）包括3个步骤：1. 目标DNA片段（基因）的分离2. 目标基因克隆到载体上3. 载体导入宿主细胞并在其中大量 复制 一、工具酶1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能型酶：遗传工程中应用最广泛 型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的 型限制性酶的基本特性：型限制性酶的基本特性： 有特异识别和切割的序列部位有特异识别和切割的序列部位 DNADNA分子上两个单链断裂的部位通分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的常不是直接相对的 断裂所形成的断裂所形成的DNADNA片段常具有碱基片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端）互补的单链尾巴（粘性末端） 内切酶的切割和修饰功能由两个内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的活性和甲基化作用活性是分开的 限制性内切酶限制性内切酶EcoEcoRIRI的酶切位点及酶切产物连接的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列图12-1通过用相同的限制性内切酶切割形成一个重组DNA分子 限制性内切酶限制性内切酶SmaSmaI I的识别及酶切位点的识别及酶切位点平齐末端2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3 OH和5 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来 3、反转录酶 反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNA library） 4 4、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应(PCR)(PCR) PCRPCR是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA的方法的方法, ,由美国的由美国的Mullis(1986)Mullis(1986)发明发明, , 19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 PCRPCR可对特定可对特定DNADNA片段进行扩增，且可用痕量片段进行扩增，且可用痕量DNADNA作模板，对作模板，对DNADNA纯度要求也不高纯度要求也不高, ,可在几可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCRPCR反应在一种混合液中进行，该混合液包反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为括四种主要成分：两个引物（一般为20 20 bpbp）、模板）、模板DNADNA、热稳定的、热稳定的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶，在酶，在9595甚至更高的温度下活性稳定）和甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。四种脱氧核苷酸。PCRPCR反应在反应在PCRPCR仪上自动进仪上自动进行行PCRPCR反应从启动到结束称为一个循环，每个反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：循环包括三个步骤：1 1）变性：）变性：9595，DNADNA 双链分离成单链双链分离成单链2 2）退火）退火( (复性复性) )：5555 左右，引物与单链的左右，引物与单链的 模板模板DNADNA序列互补结合序列互补结合3 3）延伸：）延伸：7272左右，左右， TaqTaq酶通过在引物酶通过在引物 的的3-OH3-OH端增加碱基的端增加碱基的 办法使引物延伸办法使引物延伸表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824二、载体 1、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA 分子，是自然界中不存在的DNA分子重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为：1) 从细胞或组织获得DNA并纯化2) 用限制酶切割DNA3) 将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子4) 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大 量相同拷贝的重组DNA分子-克隆5) 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化6) 克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来 用于研究或商业开发。 图图 12-5 12-5 重组重组DNADNA技术流程技术流程2、载体 载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等载体特点： 在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子 ，有独立的复制起始位点 有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入 后随载体DNA分子一同进行复制或扩增 有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主 细胞 分子量小，多拷贝，易于操作 具有安全性等 （1 1）细菌质粒：广泛应用于基因工程）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6 质粒PUC18的结构及多克隆位点 TiTi质粒及其衍生载体质粒及其衍生载体TiTi质粒包括五个区域，质粒包括五个区域，1. LB1. LB与与RBRB之间的之间的T-DNAT-DNA，这段序列整合到植物基因组中；这段序列整合到植物基因组中； 2. 2. 质粒转移区质粒转移区(PT)(PT)；3. 3. 冠瘿碱代谢区；冠瘿碱代谢区；4. 4. 复制原点；复制原点；5. 5. 毒性区。毒性区。 T-DNAT-DNA区区域域内内的的所所有有基基因因与与转转移移无无关关，所所以以将将致致瘤瘤基基因因全全部部缺缺失失即即卸卸甲甲(disarmed)(disarmed)后后，将将细细菌菌抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因或或其其它它序序列列插插入入到到这这个个区区域域，形形成成的的T-DNAT-DNA仍仍可可将将RBRB至至LBLB内内的的序序列列转转移并整合到植物基因组。移并整合到植物基因组。VirVir区区的的毒毒性性基基因因是是T-DNAT-DNA转转移移所所必必需需的的，毒毒性性基基因因可可以以顺顺式式及及反反式式两两种种方式控制方式控制T-DNAT-DNA转移。转移。TiTi质质粒粒是是约约150-200kb150-200kb的的环环状状DNADNA分分子子，很很难难直直接接使使用用，故故需需对对其其加加以以改改造造，构构建建出出TiTi质质粒粒的的衍衍生生载载体体系系统统，广广泛泛用用作作植物基因工程中的载体：植物基因工程中的载体：（1 1）双元载体）双元载体(binary vectors(binary vectors）如如pBin19pBin19载载体体，具具有有原原核核生生物物的的卡卡那那霉霉素素抗抗性性基基因因( (AphAph)作作为为细细菌菌选选择择标标记记，真真核核生生物物的的卡卡那那霉霉素素抗抗性性基基因因( (nos-nos-NptNpt)作作为为植植物物的的选选择择标标记记，pUC19pUC19的的多多克隆位点及克隆位点及-互补显色标记互补显色标记（2 2）共整合载体）共整合载体(integrated vectors)(integrated vectors) （2） 噬菌体噬菌体载体载体1 1、 噬菌体；噬菌体； 2 2、 噬菌体噬菌体DNADNA； 3 3、 噬菌体噬菌体DNADNA中间中间基因簇；基因簇；4 4、将连接物、将连接物体外包装后感体外包装后感染细菌，制备染细菌，制备基因库基因库（用于（用于基因库构建）基因库构建）（3 3）克隆大片段）克隆大片段DNADNA的载体的载体 粘粒载体粘粒载体 克隆外源克隆外源 片段的长片段的长 度在度在15 45kb之间之间细菌人工染色体细菌人工染色体( (BACBAC) )上述的几种载体都不能携带大于上述的几种载体都不能携带大于50kb50kb的的外源外源DNADNA片段，片段，而很多真核生而很多真核生物基因长度在物基因长度在50kb50kb以上。以上。细细菌人工染色体菌人工染色体载体就是为载体就是为克隆更大的外克隆更大的外源源DNADNA片段而设片段而设计构建的计构建的图12-9 细菌人工染色体载体pBAC 108L 及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段 酵母酵母人工染色体人工染色体（YAC）YAC载体可以插入载体可以插入大片段的大片段的DNA（1-2Mb），成为），成为人类基因组计划（人类基因组计划（HGP）的一种重要）的一种重要工具工具 三、基因分离方法 一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。 利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。 1、基于文库的基因分离方法 基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因文库（1）构建基因文库 基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组DNA群体cDNA文库：以mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成cDNA，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成的基因库。克隆特定基因 （2 2）筛选基因库）筛选基因库大大多多数数方方法法是是利利用用一一段段核核苷苷酸酸序序列列(DNA(DNA，cDNAcDNA或或寡寡核核苷苷酸酸) )作作探探针针(probe)(probe)，用用放放射射性性同同位位素素或或非非放放射射性性同同位位素素标标记记探探针，也可用抗体作探针，筛选基因库针，也可用抗体作探针，筛选基因库如如：筛筛选选噬噬菌菌体体构构建建的的库库常常利利用用菌菌落落杂杂交交法法：将将经经重重组组噬噬菌菌体体( (来来自自基基因因库库) )感感染染的的宿宿主主细细菌菌细细胞胞与与培培养养基基混混合合后后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑 图 12-11 菌落杂交技术 （3 3）阳性克隆的分析与鉴定）阳性克隆的分析与鉴定 从从基基因因库库中中筛筛选选出出的的阳阳性性克克隆隆，还还需需进进一一步步分分析析、鉴鉴定定，才才能能得得到到目目的基因的基因 生物信息分析生物信息分析功能预测功能预测 、功能鉴定、功能鉴定2 2、T-DNAT-DNA标签克隆基因标签克隆基因 利用利用T-DNAT-DNA插入突变插入突变创造突变体，获取目创造突变体，获取目标基因或克隆标基因或克隆T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图12-12 T-DNA标签克隆基因的基本原理 3、基于PCR的基因克隆 PCR可在数小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，可代替一些经载体克隆基因的方法。其原理是根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究 4、基因的人工合成 对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成 四、重组DNA分子第三节 外源基因的导入一、农杆菌介导的遗传转化1、根癌农杆菌(Ti质粒) 2、发根农杆菌(Ri质粒)发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根(发状根)Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括T区的左右边界序列;TL-DNA区;TR-DNA区。 图12-15 棉花转基因植株生产过程F1. 共培养2. 在选择培养基上筛选3. 筛选获得的抗性愈伤 5. 胚萌发成苗6. 转基因植株移栽大田4. 抗性愈伤分化成胚状体二 、农杆菌介导的遗传转化 基因枪法生物弹法微粒枪法微粒轰击法依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术。其优点是该方法无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究 第四节第四节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定 PCR PCR Southern blotSouthern blotNorthern blotNorthern blotWestern blotWestern blot性状性状 （表型）鉴定（表型）鉴定M 1 2 3 4 5 6 7 8 9PCRSouthern blot第五节第五节 基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程的应用一、基因工程的应用1 1、转基因植物、转基因植物抗除草剂、抗虫、抗病、抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推很多已经大面积种植推广。广。20022002年年50005000万公顷：万公顷：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、水稻、马铃薯、番茄、水稻、马铃薯、番茄、小麦等小麦等2 2、转基因动物：羊、牛、转基因动物：羊、牛 3 3、基因工程工业、基因工程工业 生产胰岛素等生产胰岛素等 在细菌中产生胰岛素的方法4 4、遗传疾病诊断、遗传疾病诊断RFLPRFLP法（镰刀性贫血病）法（镰刀性贫血病） 5 5、基因治疗、基因治疗 利用基因工程技术，将特异基因导入并利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病以治疗遗传疾病 基因治疗的载体和重组基因治疗的载体和重组DNADNA分子分子 6 6、DNADNA芯片芯片 DNADNA芯片芯片(DNA chips)(DNA chips)是将核酸分子杂交是将核酸分子杂交的原理和方法的原理和方法, ,与半导体技术结合而发与半导体技术结合而发展形成的一门新技术展形成的一门新技术 二、安全问题二、安全问题 1 1、转基因植物成为杂草转基因植物成为杂草2 2、导致新的病虫害，威胁生物、导致新的病虫害，威胁生物 多样性多样性3 3、食品安全性、食品安全性