食品安全现场检测方法汇报人：汇报人： 王建龙王建龙汇报单位：西北农林科技大学汇报单位：西北农林科技大学 食品学院食品学院 食品安全问题不但危害国人健康，还会危及子孙后代，危害国家形象！食品安全问题不但危害国人健康，还会危及子孙后代，危害国家形象！*食品安全检测的重要性食品安全检测的重要性*肯定了质检机构的价值肯定了质检机构的价值*当前主要分析技术存在的问题当前主要分析技术存在的问题*薄层层析法薄层层析法*气相色谱法气相色谱法*反气相色谱法反气相色谱法*高效液相色谱高效液相色谱*质谱分析法质谱分析法*原子吸收原子吸收/荧光荧光*光谱法光谱法*GC/MASS 等等等等目前食品安全检测分析一般采用仪器分析法：目前食品安全检测分析一般采用仪器分析法：这些方法虽都属于国内外食品安全这些方法虽都属于国内外食品安全检测方法标准所确认的，但存在着：检测方法标准所确认的，但存在着：仪器价值昂贵、对操作人员有比较高的技仪器价值昂贵、对操作人员有比较高的技术要求，耗时、难于实现快速、简捷和高术要求，耗时、难于实现快速、简捷和高通量检测等缺陷，不适合现场快速测定和通量检测等缺陷，不适合现场快速测定和大量普及。大量普及。因此，仅靠常规的仪器检测已不能满足因此，仅靠常规的仪器检测已不能满足快速判定的需要。一些简便、灵敏、准快速判定的需要。一些简便、灵敏、准确、省力、省成本的快速检测方法越来确、省力、省成本的快速检测方法越来越多地被运用到食品安全性检测中越多地被运用到食品安全性检测中. 当前当前最常见的一些可以实现现场快速检测的分析方法最常见的一些可以实现现场快速检测的分析方法1. 电化学传感技术电化学传感技术2. 表面等离子体共振（表面等离子体共振（SPR）分析技术）分析技术3. 纳米金比色检测技术（视觉化检测技术）纳米金比色检测技术（视觉化检测技术）4. Elisa酶联免疫技术酶联免疫技术5. PCR等等 1. 电化学传感器电化学传感器 电化学生物传感器主要包括以下组件：手持电化学分析仪手持电化学分析仪 核心技术：核心技术： 工作电极的修饰工作电极的修饰通过输出转换信号的不同，电化学传感器通过输出转换信号的不同，电化学传感器可分为可分为: 电流型传感器电流型传感器 电位型传感器电位型传感器 电导型传感器电导型传感器电流型传感器电流型传感器(amperometric sensor) 电流型传感器是通过激励电压测量响应电流，从而获取待测物质浓度的电化学传感器。在一定的电极电压下，通过电极表面或其修饰层内氧化还原反应生成的电流随时间的变化来测量分析物。该电流直接测量的电子转移速度正比于待测物浓度。 电流型传感器是食品分析中使用最广的传感器，多为三电极系统，即工作电极、参比电极和对电极。应用：应用：食品中各种有害物分析如各种化食品中各种有害物分析如各种化学污染物、毒素、添加剂、微生物发酵过学污染物、毒素、添加剂、微生物发酵过程分析等；程分析等；苏丹红苏丹红I的电化学传感器的电化学传感器检测用时检测用时5min，检测样品浓度范围：，检测样品浓度范围：0.1到到1.5mg/L电位型传感器电位型传感器(potentiometric sensors) 是指将溶解于电解质溶液中的离子电极而产生的电动势作为传感器的输出而取出，从而实现离子的检测；离子选择性电极能斯特方程离子选择性电极 它是由敏感膜、内导体系、电极控件等部件组成，它能与溶液 （体液）中某种特定的离子产生选择性的响应。所谓响应是指离子选择性电极敏感膜在溶液中与特定离子接触后产生的膜电位值随溶液中该离子的浓度变化而变化。因此，被广泛的应用于食品中各种有机、无机离子的快速检测优点优点：简便快速、仪器设备简单、易实现自动化、直接检测离子活度，能用于在线快速检测。缺点缺点：精密度不很高（约2%）、工作曲线稳定性不很好原理：原理：是以被测物氧化或还原后电解质溶液电导的变化作为传感器的输出而取出，从而实现物质的检测。应用：应用：1996年 Yagiuda用电导法测定了尿中的吗啡.(Yagiuda K,Hemmi A , Ito S , et al . Development of conductivity- based immunosensor for sensitive detection of methamphetamine (stimulant drug) in human urineJ .Biosens Bioelectrion ,1996 ,11 (8) :703-707.)2001年 Diiksma 用交流阻抗法测定了干扰素,下限达到0.02 fg/ ml。(Diiksma M, Kamp B , Hoogvliet J C , et al . Development of an electrochemical immunosensor for direct detection of interferon- at the attomolar level J . Anal Chem,2001 ,73 (3) :901-907)电导法易受被测样品离子强度和缓冲液容积的影响,并且难以克服非特异吸附电导型传感器电导型传感器电化学检测优缺点分析：电化学检测优缺点分析：优点：优点：简单，快速，易操作，能够实现现场分析缺点缺点：电极性能差别较大，检测结果有一定偏差，可用于初步分析，为精确分析提供基本数据随着电极性能提高，在食品检随着电极性能提高，在食品检测领域有非常广阔的应用前景测领域有非常广阔的应用前景2. 表面等离子体共振（表面等离子体共振（SPR）分析技术）分析技术基本原理：基本原理： SPR是一种物理光学现象。利用光在玻璃界面处发生全内反射时的消失波, 可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体子。在入射角或波长为某一适当值的条件下, 表面等离子体子与消失波的频率和波数相等, 二者将发生共振, 入射光被吸收, 使反射光能量急剧下降, 在反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值) 。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时, 共振峰位置将不同。1.光源具有双重作用。光路不经本体光源具有双重作用。光路不经本体溶液溶液,因此背景信号很小。因此背景信号很小。2. SPR是基于衰减全反射原理，消失是基于衰减全反射原理，消失波电场在界面处会放大，因此，具波电场在界面处会放大，因此，具有较高的灵敏度。有较高的灵敏度。3.在分子识别及其相互作用分析中有在分子识别及其相互作用分析中有一些独特的优点。一些独特的优点。 不仅可鉴别和测量分子的浓度和质不仅可鉴别和测量分子的浓度和质量，而且可实时量，而且可实时,原位原位,灵敏的监测反应灵敏的监测反应的动态过程的动态过程, 直接给出动力学常数。直接给出动力学常数。 可直接分析未经纯化的样品。可直接分析未经纯化的样品。 待测物不需标记。待测物不需标记。 由于消失波有效渗透深度由于消失波有效渗透深度约约200nm, 特适合于超薄膜分析。特适合于超薄膜分析。 可多通道同时检测，且光路可聚焦到可多通道同时检测，且光路可聚焦到很小很小(um甚至甚至nm)的范围的范围 内，因此非内，因此非常适合于制备陈列纳米常适合于制备陈列纳米SPR传感器。传感器。优点优点:Applications:SPR技术在食品品质与安全检测中的应用技术在食品品质与安全检测中的应用食品领域应用非常广泛，检测对象主要包括：食品领域应用非常广泛，检测对象主要包括：病原体、毒素、药物残留、维生素、荷尔蒙、抗体、化学污染物、过敏源和蛋白等等。目前在国际食品安全机构有目前在国际食品安全机构有3000余台余台Biacore Q产品在线运行（仅日本就有产品在线运行（仅日本就有1000台），成为国际食品专业检测服务机构（如德国欧陆坊科技集团、美国台），成为国际食品专业检测服务机构（如德国欧陆坊科技集团、美国Leatherhead食品国际等）的权威检测方法和制定新标准的依据；成为跨国食品国际等）的权威检测方法和制定新标准的依据；成为跨国食品巨头（如雀巢、惠氏食品跨国公司等）质量控制和新产品开发手段；成食品巨头（如雀巢、惠氏食品跨国公司等）质量控制和新产品开发手段；成为国际重要科研机构（英国大不列颠中心科学实验室、加拿大食品检验署、为国际重要科研机构（英国大不列颠中心科学实验室、加拿大食品检验署、荷兰荷兰DRIKILT食品安全研究院、泰国家畜发展部、日本食品研究实验室等）食品安全研究院、泰国家畜发展部、日本食品研究实验室等）技术创新的平台；成为发达国家（如欧盟、日本、美国、澳大利亚等）提升技术创新的平台；成为发达国家（如欧盟、日本、美国、澳大利亚等）提升食品进口标准，建立食品贸易技术壁垒和国内食品安全监管的有效工具。食品进口标准，建立食品贸易技术壁垒和国内食品安全监管的有效工具。PrincipleDetection process赭曲霉毒素赭曲霉毒素A的快速的快速SPR检测技术检测技术 SPR检测优缺点分析：检测优缺点分析：优点：简单，快速，灵敏、实时在线、易操作，能够实现样品现场分析。缺点：芯片被国外垄断检测，价值昂贵，测定成本较贵。随着芯片制备技术的普及，应用前景广阔。3. 纳米金比色检测技术（视觉化检测技术）纳米金比色检测技术（视觉化检测技术）基本原理： 主要利用胶体金本身的显色反应来实现待分析物的视觉化测定，无需仪器进行分析，特别适合于样品的定性与半定量分析。根据检测方式的不同，可分为：（1）溶液中胶体金的比色视觉化测定（2）胶体金免疫层析分析，即试纸条检测技术（1）溶液中胶体金的比色视觉化测定）溶液中胶体金的比色视觉化测定溶液中胶体金团聚前后颜色变化溶液中胶体金团聚前后颜色变化溶胶金纳米粒子是酒红色的，而聚集的金纳米粒子是紫色或蓝色，其吸收光谱发生红移，这种由于周围环境改变而引起的颜色改变构成了以金纳米粒子进行比色法检测的基础，广泛应用于构造化学生物传感器来检测各种分析物。通常，金纳米粒子要被修饰上寡聚核苷酸、抗体、或者其它的配体来选择性的识别被测物。这样分析物可以和表面功能基团结合，导致金纳米粒子聚集起来，伴随清楚的颜色改变。溶液中胶体金的比色视觉化测定在食品领域的应用比较广溶液中胶体金的比色视觉化测定在食品领域的应用比较广泛，现在主要用于测定食品中的重金属离子和一些小分子泛，现在主要用于测定食品中的重金属离子和一些小分子有害物以及一些特定微生物。有害物以及一些特定微生物。（2）胶体金免疫层析分析，即试纸条检测技术）胶体金免疫层析分析，即试纸条检测技术胶体金免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种免疫分析方法，它是在单克隆抗体技术胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项以膜为固相载体的快速检测技术。现在国内外销售的金标免疫快速检测的成品多达几十种。胶体金标记免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断和检测技术, 不仅具有敏感、特异、便捷、快速等特点, 而且适合基层和现场使用。其核心原理是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛其核心原理是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管电涌作用，滴加在膜一端的液体慢慢向另一端移动，细管电涌作用，滴加在膜一端的液体慢慢向另一端移动，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应，检测通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应，检测相应分析物。相应分析物。胶体金免疫层析法分为以下二种主要类型胶体金免疫层析法分为以下二种主要类型 双抗体夹心法原理及结果判定示意图双抗体夹心法原理及结果判定示意图竞争抑制法反应原理及结果判定示意图竞争抑制法反应原理及结果判定示意图 在食品领域的主要应用在食品领域的主要应用(1). 在食品质量控制领域的应用在食品质量控制领域的应用食品的主要成分是蛋白质、糖类、脂肪、水分、矿物质、维生素,其中大部分有机高分子物质,如蛋白质、生物活性肽、多糖、脂类,都可以用免疫学方法进行检测。对于那些不需要精确定量检测,但需要快速得出检测结果的成分分析,胶体金免疫层析技术尤为适用,此类检测多要求进行半定量分析. 例如，利用胶体金试纸条来检测IgG含量来评价牛初乳及其制品生物活性的良好指标。(2). 在食品安全检测领域的应用在食品安全检测领域的应用胶体金免疫层析技术操作简单、检测时间短、便于现场操作,可以为现场执法带来科学依据。目前、国内的研究主要集中在这一领域,此类检测通常需要进行定性分析或简单的半定量分析。第一大类的检测物为有害微生物，已有的检测对象包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等。第二大类的检测物为食品中农药、兽药残留以及生物毒素，已有的检测对象包括磺胺甲噁唑，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，氯霉素等，(3). 食品中违禁药物的检测食品中违禁药物的检测近年来,一些食品经营者为诱使食用者成瘾,牟取暴利,无视国家食品卫生的相关法律法规,将罂粟壳加到火锅汤料、调料等食品中,危害了公众健康。罂粟壳中含有吗啡、罂粟碱、可卡因等成分,因而可以以此类物质作为判断食品中是否掺入罂粟壳的指标。这类物质同样属于小分子物质,对其的检测方法跟检测农药、兽药等的残留类似。2004年,任辉 19 采用竞争免疫层析法检测食品中的吗啡,最小检测质量为45g /mL。方邢有等人 20 于2005 年同样采用竞争性免疫层析技术检测食品中的罂粟碱, 得到的试纸条检出限为0.2g/mL,正确检出率约为97%。胶体金试纸技术展望胶体金试纸技术展望 目前,国内这一领域的研究仍处于实验室阶段,国内还没有国产的成型产品。而市售的免疫层析产品均系进口国外散件国内组装或直接代销的国外产品。由于食品快速检测产品的市场巨大,在国内开展这一领域的研究,尽快研制出多品种、高质量的免疫层析产品,不仅可避免国内资金的大量外流,并且对改善食品质量与安全,提高我国国民健康水平,将起到不容忽视的作用。 在检测实验室中，依据国家标准和行业标准装备的大型检测仪在检测实验室中，依据国家标准和行业标准装备的大型检测仪器有很多优点：精度高、可以定量和定性器有很多优点：精度高、可以定量和定性(确证确证)分析，但是高昂的价分析，但是高昂的价格和较长的耗时及要求较高的使用技能是它的软肋。据了解，色谱仪格和较长的耗时及要求较高的使用技能是它的软肋。据了解，色谱仪一般每台十几万元，色一般每台十几万元，色质联用仪则需要几十万甚至上百万元，检测质联用仪则需要几十万甚至上百万元，检测一个样品成本从几百元到两千元不等，而且样本提取和净化步骤等前一个样品成本从几百元到两千元不等，而且样本提取和净化步骤等前处理比较费时；但市场上一台速测仪加配套设备不到处理比较费时；但市场上一台速测仪加配套设备不到1万元，从取样万元，从取样到检测只需到检测只需1020分钟，检测一个样品成本在分钟，检测一个样品成本在2元左右，对操作人员元左右，对操作人员的技术水平要求也不高。的技术水平要求也不高。以上情况决定了快速检测技术目前在我国仍有重要地位，而且只以上情况决定了快速检测技术目前在我国仍有重要地位，而且只有发展快速筛查检测技术才能实现从源头进行监控。有发展快速筛查检测技术才能实现从源头进行监控。食品安全快速检测方法小结食品安全快速检测方法小结