实验六、叶绿体色素的提取、分离、实验六、叶绿体色素的提取、分离、理化性质鉴定和定量测定理化性质鉴定和定量测定实验目的实验目的1. 1. 了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义学特性在光合作用中的意义; ;2. 2. 熟悉和掌握在未经分离的叶绿体色素溶液熟悉和掌握在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素中测定叶绿素a a和和b b的方法及其计算的方法及其计算; ;3. 3. 掌握分光光度计的原理与使用方法。掌握分光光度计的原理与使用方法。. 叶绿体色素的提取、分离、理化性质叶绿体色素的提取、分离、理化性质一、原理一、原理 叶绿体色素是由多种色素组成的。其主要组分叶叶绿体色素是由多种色素组成的。其主要组分叶绿素是双羧酸的酯（羧基分别被甲醇、绿醇基酯化），绿素是双羧酸的酯（羧基分别被甲醇、绿醇基酯化），脂溶性的，并可与碱发生皂化反应，产生的盐能溶于脂溶性的，并可与碱发生皂化反应，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝素分开。水，可用此法将叶绿素与类胡萝素分开。 叶绿素在光照下可产生暗叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光；叶绿素的化学红色的荧光；叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。白质分离后，破坏更快。 叶绿素中的镁可被氢离子叶绿素中的镁可被氢离子取代生成褐色的去镁叶绿素；取代生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐作用，则可成为绿色加入铜盐作用，则可成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。稳定，在光下不易破坏。 二、实验材料、试剂与仪器设备二、实验材料、试剂与仪器设备 1.1.实验材料实验材料: :大叶黄杨叶片。大叶黄杨叶片。2.2.试剂试剂: :碳酸钙、盐酸、醋酸铜、丙酮、乙醚、碳酸钙、盐酸、醋酸铜、丙酮、乙醚、80%80%丙丙酮酮、30%30% KOH- KOH-甲醇。甲醇。3.3.仪器设备仪器设备: :光照培养箱、天平、木夹子、分液漏斗、光照培养箱、天平、木夹子、分液漏斗、试管、酒精灯、移液管、量筒、漏斗、滤纸、研钵。试管、酒精灯、移液管、量筒、漏斗、滤纸、研钵。 三、实验步骤三、实验步骤 1. 1.叶绿体色素的提取：取新鲜的大叶黄杨叶片叶绿体色素的提取：取新鲜的大叶黄杨叶片1g1g，剪碎后放入研钵中，加纯丙酮剪碎后放入研钵中，加纯丙酮5ml5ml、少许、少许碳酸钙碳酸钙和石英砂，和石英砂，研磨成匀浆，再加纯丙酮研磨成匀浆，再加纯丙酮20ml20ml，漏斗过滤至试管中，即，漏斗过滤至试管中，即为色素提取液，放于暗处。为色素提取液，放于暗处。 2.2.叶绿素的荧光现象：分别观察上述试管在反射光叶绿素的荧光现象：分别观察上述试管在反射光和透射光一侧，提取液的颜色有何不同，描述叶绿素产和透射光一侧，提取液的颜色有何不同，描述叶绿素产生的荧光颜色。生的荧光颜色。 3. 3. 光对叶绿素的破坏作用：取上述色素提取液各光对叶绿素的破坏作用：取上述色素提取液各1.5ml1.5ml分装于两试管中，一支试管放在黑暗的烘箱中分装于两试管中，一支试管放在黑暗的烘箱中, ,另一试管放在强光另一试管放在强光( (光照培养箱光照培养箱) )下（最好是不加碳酸下（最好是不加碳酸钙），经钙），经2 23h3h后观察两支试管中溶液颜色有何不同。后观察两支试管中溶液颜色有何不同。 4. 4.铜代作用：取色素提取液铜代作用：取色素提取液2ml2ml于试管中，于试管中，加半滴浓加半滴浓盐酸盐酸直至溶液出现褐色，形成去镁叶绿素。然后加醋酸直至溶液出现褐色，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热，则又产生鲜亮的的绿色。说明铜晶体少许，慢慢加热，则又产生鲜亮的的绿色。说明颜色变化的原因。颜色变化的原因。 5. 5.黄色素与绿色素的分离：取上述色素黄色素与绿色素的分离：取上述色素提取液约提取液约10ml10ml，加到盛有，加到盛有20ml20ml乙醚的分液漏乙醚的分液漏斗中，摇动并沿斗中，摇动并沿分液漏斗边缘加入分液漏斗边缘加入30ml30ml蒸馏蒸馏水，水，轻轻轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素全部转入上层乙醚中，弃下分为两层。色素全部转入上层乙醚中，弃下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1212次。然后于色素乙醚溶液中加入次。然后于色素乙醚溶液中加入5ml5ml的的30%30% KOHKOH甲醇甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10min10min，再加蒸馏水约，再加蒸馏水约10ml10ml，摇动后静置分，摇动后静置分离，则得到黄色素和绿色素层。离，则得到黄色素和绿色素层。解释每一现象产生原理。解释每一现象产生原理。叶绿素是一种酯，因此叶绿素是一种酯，因此不溶于水不溶于水。通常用含有少量。通常用含有少量水的有机溶剂如水的有机溶剂如8080的丙酮，的丙酮，或者或者95%95%乙醇，或丙酮乙醇，或丙酮乙醇乙醇水水4.54.514.54.51的混合液的混合液来提取叶片中的叶绿素，用来提取叶片中的叶绿素，用于测定叶绿素含量。于测定叶绿素含量。 叶绿素的提取叶绿素的提取叶绿素的提取叶绿素的提取研磨法提取研磨法提取研磨法提取研磨法提取光合色素光合色素光合色素光合色素提取方法提取方法提取方法提取方法研磨法研磨法浸提法浸提法0.1g0.1g叶叶+10ml+10ml混合液浸提混合液浸提 之所以要用含有水的有之所以要用含有水的有机溶剂提取叶绿素，这是因机溶剂提取叶绿素，这是因为叶绿素与蛋白质结合牢，为叶绿素与蛋白质结合牢，需要经过水解作用才能被提需要经过水解作用才能被提取出来。取出来。浸提法.叶绿素叶绿素a a、b b含量的测定含量的测定一一. .原理原理 如果混合液的两个组分的光谱吸收峰虽有明显差异，如果混合液的两个组分的光谱吸收峰虽有明显差异，但吸收曲线彼此有重叠，可根据但吸收曲线彼此有重叠，可根据Lambert-BeerLambert-Beer定律定律(A=CL(A=CL，当溶液浓度，当溶液浓度C C以以% %为单位，液层厚度为单位，液层厚度L L为为1cm1cm时，时，为该物质的吸光系数为该物质的吸光系数) )计算出两组分含量。计算出两组分含量。 叶绿素叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b在红光区的最大吸收峰分别位于在红光区的最大吸收峰分别位于663nm663nm和和645nm645nm；且在波长；且在波长663nm663nm下，叶绿素下，叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的的80%80%丙酮溶液的比吸收系数分别为丙酮溶液的比吸收系数分别为82.0482.04和和9.279.27，而在，而在波长波长645nm645nm下，分别为下，分别为16.7516.75和和45.645.6。A663=82.04Ca+9.27Cb,A645=16.75Ca+45.6Cb;解方程得解方程得:Ca=12.7A663-2.69A645，Cb (mg/L) =22.9 A645-4.68A663 二、实验材料、试剂与仪器设备二、实验材料、试剂与仪器设备 1.1.实验材料：大叶黄杨叶片实验材料：大叶黄杨叶片2.2.试剂：碳酸钙、石英砂、丙酮、试剂：碳酸钙、石英砂、丙酮、80%80%丙酮。丙酮。3.3.仪器设备：离心机、新悦仪器设备：离心机、新悦T2T2分光光度计、天平、分光光度计、天平、研钵、移液管、离心管、容量瓶。研钵、移液管、离心管、容量瓶。 663nm645nm 1. 1.色素的提取：取新鲜的大叶黄杨叶片色素的提取：取新鲜的大叶黄杨叶片0.1g0.1g，剪碎，剪碎后放入研钵中加入后放入研钵中加入纯丙酮纯丙酮2.5ml2.5ml、少许碳酸钙和石英砂，、少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加研磨成匀浆，再加80%80%丙酮丙酮5ml5ml，将匀浆转入离心管，并，将匀浆转入离心管，并用适量用适量80%80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后离心后弃弃沉淀，上清液用沉淀，上清液用80%80%丙酮定容至丙酮定容至25ml25ml。 2.2.测定光密度：以测定光密度：以80%80%丙酮为对照，分别测定上述色丙酮为对照，分别测定上述色素提取液素提取液663nm663nm、645nm645nm处的光密度值（如值过大请稀释）处的光密度值（如值过大请稀释）。 3.3.按照公式计算出色素按照公式计算出色素a a、b b和和a+ba+b的含量：的含量：叶绿素含量叶绿素含量(mg/g)=(mg/g)=(叶色素浓度叶色素浓度提取液体积提取液体积 稀释倍数）稀释倍数）样品鲜重。样品鲜重。三、实验步骤三、实验步骤 注意事项注意事项: : 1. 1. 本实验使用的试剂多为强挥发性的，在实验操作本实验使用的试剂多为强挥发性的，在实验操作本实验使用的试剂多为强挥发性的，在实验操作本实验使用的试剂多为强挥发性的，在实验操作中，应适当提高速度，并在取用完试剂后，迅速将试中，应适当提高速度，并在取用完试剂后，迅速将试中，应适当提高速度，并在取用完试剂后，迅速将试中，应适当提高速度，并在取用完试剂后，迅速将试剂瓶的盖子盖上，以防溶剂过度挥发；剂瓶的盖子盖上，以防溶剂过度挥发；剂瓶的盖子盖上，以防溶剂过度挥发；剂瓶的盖子盖上，以防溶剂过度挥发； 2. 2. 在进行离心时务必将试管平衡后再放放离心机中在进行离心时务必将试管平衡后再放放离心机中在进行离心时务必将试管平衡后再放放离心机中在进行离心时务必将试管平衡后再放放离心机中离心；离心；离心；离心； 3. 3. 提取叶绿素时应避免直射光，操作要迅速；提取提取叶绿素时应避免直射光，操作要迅速；提取提取叶绿素时应避免直射光，操作要迅速；提取提取叶绿素时应避免直射光，操作要迅速；提取出的叶绿素应立即测定，以免光氧化使含量下降；出的叶绿素应立即测定，以免光氧化使含量下降；出的叶绿素应立即测定，以免光氧化使含量下降；出的叶绿素应立即测定，以免光氧化使含量下降； 4. 4. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差相差相差相差1nm1nm，则叶绿素，则叶绿素，则叶绿素，则叶绿素a a的测定误差为的测定误差为的测定误差为的测定误差为2 2，叶绿素，叶绿素，叶绿素，叶绿素b b为为为为1919，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。思考题思考题: 1 1用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿水丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？体色素往往效果不佳，原因何在？ 2 2研磨提取叶绿素时加入研磨提取叶绿素时加入CaCOCaCO3 3，有什么，有什么作用？作用？ 3 3叶绿素叶绿素a a、b b在蓝色区也有吸收峰，能在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？为什么？ 作业作业: 1.1.描述实验描述实验步骤步骤2 25 5的现象，并解释的现象，并解释原因；原因； 2.2.测定并计算大叶黄杨叶片中叶绿素测定并计算大叶黄杨叶片中叶绿素a a、b b和和a+ba+b的含量。的含量。