实验七实验七 猪伪狂犬病猪伪狂犬病PCRPCR诊断诊断1实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握猪伪狂犬病毒PCR检测的方法；实验内容：1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，2、猪伪狂犬病毒PCR检测。2什么是什么是PCR？ 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外序列体外引物定向酶促扩增技术。引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应的原理、方法及操作步骤3PCR原理原理 PCRPCR是是一一种种选选择择性性扩扩增增DNADNA或或RNARNA的的方方法法，其其基基本本原原理理是是依依据据体体内内细细胞胞分分裂裂中中的的DNADNA半半保保留留复复制制机机理理，以以及及在在体体外外DNADNA分分子子于于不不同同温温度度下下双双链链和和单单链链可可以以互互相相转转变变的的性性质质，人人为为地地控控制制体体外外合合成成系系统统的的温温度度，以以促促使使双双链链DNADNA变变成成单单链链；单单链链DNADNA与与人人工工合合成成的的引引物物退退火火，以以及及在在dNTPdNTP存存在在下下，耐耐高高温温的的DNADNA聚聚合合酶酶使使引引物物沿沿单单链链模模板板延延伸伸成成为为双双链链DNADNA。高高温温变变性性，低低温温退退火火，适适温温延延伸伸等等步步反反应应循循环环进进行行，使使目目的的DNADNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。4PCR原理原理PCRPCR技术在模板技术在模板DNADNA、dNTPdNTP、Mg2+Mg2+、合适、合适BufferBuffer等条件下，用耐热的等条件下，用耐热的TaqTaq聚合酶代替聚合酶代替DNADNA聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的DNADNA引物代替引物代替RNARNA引物，经过引物，经过DNADNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 3个个步骤的反复循环步骤的反复循环 （2525 3030次）过程，使目的次）过程，使目的DNADNA呈指数呈指数扩增扩增 。5反应程序反应程序变性：变性：93-94 2min93-94 2min变性：变性：93-94 30s93-94 30s复性：复性：55-65 30s55-65 30s延伸：延伸：72 30s72 30s延伸：延伸：72 2min72 2min3535个循环个循环6PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension7PCR productPCR product8标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul910酶及其浓度酶及其浓度目前有两种目前有两种 Taq DNA Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U 2.5U（指总反应体（指总反应体积为积为100 ul100 ul时）时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少物量减少11引物引物引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其设序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR PCR就可将模板就可将模板DNADNA在在体外大量扩增体外大量扩增12引物在线设计网址：引物在线设计网址：http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi131415PCRPCR产物分析产物分析 凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法 可可用用琼琼脂脂糖糖（AgroseAgrose）或或聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（PAGEPAGE）凝凝胶胶电电泳检测泳检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。 同同时时应应以以标标准准DNADNA分分子子量量作作平平行行对对照照，凝凝胶胶中中加加入入溴溴化化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。16二 猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒1718使用方法使用方法19注意事项：20作业作业1、叙述PCR反应的原理、操作方法及注意事项。2、叙述猪伪狂犬病毒感染PCR检测的方法及结果判定。21