免疫荧光技术临床的应用天水市第一人民医院检验科 李杰 随着人们生活水平和意识的不断提高，各种因素的影响，近年来每31个人中就有一个人在受到自身免疫性疾病的折磨，临床表现复杂，不易早期发现。 自身免疫性疾病涉及多学科（风湿免疫科、内分泌科、血液科、妇产科、皮肤科、肾病科、消化科等等） 自身免疫性疾病涉及多病种(混合结缔组织病、系统性红斑狼疮、磷脂综合症、原发性系统性血管炎、韦格纳肉芽肿、坏死性新月体肾小球肾炎、显微多动脉炎、习惯性流产、干燥综合征、皮肌炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管炎等等） 自身免疫性疾病的共同特征：患者血清中有多种自身抗体或自身反应性致敏淋巴细胞存在，患者组织器官的病理特征为免疫炎症，用相同抗原在某些动物实验中可复制出相似的疾病模型，多数病因不明，疾病有重叠现象，即一个病人可同时患一种以上自身免疫病，病程一般较长，多迁延为慢性，有遗传倾向。鉴于自身免疫性疾病的共同特征，通过检测自身抗体可以有效准确的诊断自身免疫性疾病，为临床提供高效准确的诊断依据。 自身抗体检测的开展，不仅让我院在自身免疫性疾病诊断治疗上有很大的提高，还可为陇东南地区400万人口提供更准确、更专业的自身免疫性疾病诊断服务。节省患者去外院检测诊断所花费的时间和费用，使我院在整个地区具有一定的影响力，也会为医院带来可观的经济效益。鉴于此，我院完全有必要应用间接免疫荧光技术开展自身抗体项目的检测。2酶联免疫吸附法（ELISA） 1间接免疫荧光法（IFA Indirect Fluorescent Assay ）3免疫印迹法（IB）WesternblotLIA4其它：IDA、RIA等 间接免疫荧光法实验原理细胞、组织切片或纯化的、生化性质明确的物质均可作为检测自身抗体或病原体抗体的抗原基质。如标本为阳性，已稀释血清中的特异性抗体将与包被在固相上的抗原结合。第二步，已结合的抗体与荧光素标记的抗人抗体结合，然后在荧光显微镜下观察结果。阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最适稀释因子为3.162（10的平方根），这样，每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、1:32、1:100、1:320、1:1000、 1:3200, 1:10000等 间接免疫荧光法检测的特点特异性高：阳性与阴性标本的荧光强度差别明显。每种已结合的抗体在相应抗原的位置产生典型的荧光模型。基质中抗原谱完整，可检测多种抗体，并且检出率高。可在一种生物基质上同时检测多种抗不同生化特性抗原的抗体。当酶免试剂所需要的抗原难以制备或无法获得时，可选择间接免疫荧光法。自身抗体检测的标准和最经典的实验方法是间接免疫荧光检测法（IFA)。需要荧光显微镜。操作者需要一定的专业知识。操作者需要一定的工作经验。显微镜下的结果判断为综合知识的体现，到目前为止，尚没有任何仪器可取代人工读片。 国内现状自身抗体的测定不普遍自身抗体的测定不普遍欠规范欠规范对其意义了解尚少对其意义了解尚少缺乏研究缺乏研究 自身抗体种类繁多 常见自身抗体：抗核抗体谱(ANAS)检测抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）检测类风湿因子和抗CCP抗体自身免疫性肝病相关自身抗体检测 检验项目检验项目 试剂价格试剂价格收费标准收费标准抗核抗体抗核抗体 （ANA）18.918.943.843.8ANAANA谱谱3180180329.6329.6双链双链DNA222219.519.5角蛋白抗体（角蛋白抗体（AKA）29.529.519.519.5环瓜氨酸肽（环瓜氨酸肽（CCP）抗体）抗体393978.278.2肝抗原谱肝抗原谱9项项176176221.4221.4蛋白酶蛋白酶3 （PR3）、髓过氧化物酶）、髓过氧化物酶（MPO）、肾小球肾炎）、肾小球肾炎7878146.4146.4抗中性粒细胞浆抗体抗中性粒细胞浆抗体383897.697.6过敏原特应性组合过敏原特应性组合300300438438 抗核抗体（ANA）u定义以细胞核内物质为抗原的抗体ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、病 情判断和疗效观察的指标（SLE的筛查抗体）。在非结缔组织病（感染、慢肝、肺纤维化或肿瘤）中也可出现阳性。正常人中（特别是老年人）也可出现阳性，但滴度低，并且常表现为IgM型。高滴度ANA则高度提示自身免疫性疾病。目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。抗核抗体（抗核抗体（ANAANA）系统性红斑狼疮活动期95100%非活动期80100%药物诱导的红斑狼疮100%混合性结缔组织病（MCTD、Sharp综合征）100%类风湿性关节炎2040%进行性系统性硬化症2050%多发性肌炎及皮肌炎8595%干燥综合征3050%慢性活动性肝炎7080%溃疡性结肠炎3040%其它风湿病26%正常人5-10%抗核抗体（抗核抗体（ANAANA）u方法间接免疫荧光法u结果判断: 滴度1：100为阳性 常见核型5种 不同核型的临床意义不同ANA常见五种核型及临床意义u核膜型与抗ds-DNA有关， 多见于SLE，特别是有肾炎者u均质型与AHA、抗DNA有关，引起LE形成 主要见于SLE、药物性狼疮u斑点型与抗ENA有关，应进一步查特异性抗体u核仁型多见于硬皮病u着丝点型多见于CREST综合征 核膜型核膜型 与抗与抗ds-DNA有关，有关， 多见于多见于SLE，特别是有肾炎者，特别是有肾炎者 均质型均质型与与AHAAHA（抗组蛋白抗体（抗组蛋白抗体）、抗、抗DNADNA有关，有关，引起引起LELE形成主要见于形成主要见于SLESLE、药物性狼疮、药物性狼疮 斑点型斑点型 与抗与抗ENA有关，应进一步查特异性抗体有关，应进一步查特异性抗体核仁型核仁型多见于硬皮病多见于硬皮病 着丝点型着丝点型多见于多见于CREST综合征综合征 抗核抗体谱（ANAs）项目包含nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA M2，共15项。抗抗nRNPnRNP抗体抗体：高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率为95-100%，抗体滴度与疾病活动性相关，在30-40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有Sm抗体。抗抗SmSm抗体抗体： 抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10%。抗抗Ro-52Ro-52抗体抗体：与其它抗体（如：SS-A）同时出现时则高度提示（SS-A）的相关疾病。抗抗Scl-70Scl-70抗体抗体：见于25-75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症），在局限型硬化症患者中未检出该抗体。 抗核抗体谱（ANAs）抗抗SS-ASS-A抗体：抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-80%）、也见于系统性红斑狼疮（30-40%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）中，偶见于慢性活动性肝炎。此处，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。抗抗SS-BSS-B抗体抗体：几乎仅见于干燥综合征（40-80%）和系统性红斑狼疮（10-20%）的女性患者中，男女比例为1：29。在干燥综合征中SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。抗Jo-1抗体：见于多肌炎、阳性率为25-30%。常与合并肺间质纤维化相关。抗着丝点抗体（抗着丝点抗体（CENP BCENP B）：与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。在原发性胆汁性肝硬化患者中也可检测到该抗体（阳性率为10-30%。还可出现于雷诺氏综合征中。抗核抗体谱（ANAs）抗抗dsDNAdsDNA抗体抗体：对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA抗体也可做为该病的一个血清学标志，阳性率40-90%，且与疾病的活动度相关，可用于疗效监测。抗核小体抗体抗核小体抗体：系统性红斑狼疮患者血清中的阳性率为50-95%，特异性几乎为100%。核小体是细胞染钯体的功能亚单位，由DNA和组蛋白以特殊的且成。在系统性红斑狼疮的早期抗核小体抗体比抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体更早出现，对系统性红斑狼疮的诱因和致病有重要作用。组蛋白抗体：组蛋白抗体：一种或几种组蛋白抗体或抗H2A-H2B复合物抗体在药物（普鲁卡因胺、肼酞嗪以及其它药物）诱导的药斑狼疮中比较常见（阳性率95%）。另外，在30-70%的系统性红斑狼疮和15-50%的类风湿性关节炎患者中也可检出抗组蛋白抗体。抗核糖体抗核糖体P P蛋白抗体蛋白抗体：是系统性红斑狼疮的特异性标志，阳性率为5-15%。普遍认为ARPA的滴度与SLE的活动性相关，还与SLE的中枢神经系统症状、肾脏或肝脏受累相关。抗ds-DNA抗体u临床意义临床意义 对对SLESLE的诊断有较高特异性的诊断有较高特异性 滴度与滴度与SLESLE活动相关，可作为病情监测及疗效观察指标活动相关，可作为病情监测及疗效观察指标 与与SLESLE肾损害有关肾损害有关u检测方法检测方法 放免法（放免法（Farr)Farr)敏感，有利于早期预测敏感，有利于早期预测 检测高亲合力的抗检测高亲合力的抗dsds-DNA-DNA 间接免疫荧光法间接免疫荧光法(IF)(IF)特异特异 ELISAELISA可检测低亲合力的抗可检测低亲合力的抗dsds-DNA-DNA 有助于中枢狼疮的病情监测有助于中枢狼疮的病情监测 金标免疫斑点法金标免疫斑点法抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP）u瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微丝蛋白相关 抗体的主要抗原决定簇u对RA诊断具有高度特异性（98%）u可在RA早期出现u预测早期关节炎发展为RAuRA关节侵蚀破坏的早期识别及预测我科开展的自身免疫肝炎系列抗体包括：我科开展的自身免疫肝炎系列抗体包括：抗肝细胞膜抗体(抗LMA)抗肝肾微粒体抗体（抗LKM抗体）抗肝-胰抗体(抗LPLP抗体)抗可溶性肝细胞抗体（抗SLA）抗线粒体抗体（AMA）肝抗原谱肝抗原谱9项项SLA/LP：抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体；是AIH的最特异诊断指标，阳性率10-30%，特异性100%。RO-52：不具有疾病特异性AIH其他诊断指标其他诊断指标：1）ANA30-40%；2）ASMA抗平滑肌抗体（F-肌动蛋白）40-90%3）肝细胞膜抗原抗体35%4）去唾液酸糖蛋白受体80-90%PBC其他诊断指标：其他诊断指标：1）AMA-M4 55%2）AMA-M8 55%3）AMAM9 35-85%4）核点30 %PSC（原发性硬化性胆管炎）（原发性硬化性胆管炎）：在PSC中最常见的自身抗体为PANCA（阳性率为70-80%）重叠综合征重叠综合征（主要发生于自免性肝病之间）( (一一) )类风湿关节炎（类风湿关节炎（RARA）u类风湿因子（RF）u早期诊断的系列指标抗RA33/36抗体抗核周因子（APF）抗角蛋白抗体（AKA）抗Sa抗体抗环瓜氨酸抗体（抗CCP） (二)系统性红斑狼疮（SLE）u是一种临床表现有多系统损害症状的慢性系统性自身免疫性疾病，其血清有以抗核抗体为主的大量不同的自身抗体u自身抗体（1）抗核抗体谱ANA、抗ds-DNA、抗ENA抗体（2）抗磷脂抗体（3）抗组织细胞抗体抗RBC抗体 抗血小板相关抗体 抗神经元抗体（4）其它RF、p-ANCA(三)皮肌炎/多发性肌炎（PM/DM）u免疫学检查ANAENA抗Jo-1阳性u其它检查肌酶谱肌酸磷酸激酶（CPK）: MM-心肌和骨骼肌 MB-心肌 BB-平滑肌和脑内乳酸脱氢酶（LDH）谷草转氨酶（AST）谷丙转氨酶（ALT）碱性磷酸酶（ALP）(四)干燥综合征（SS）uANA阳性率40%70%uENA抗SSA抗体阳性率70%96% 抗SSB抗体阳性率50%87%u抗-Fordrin对于pSS或sSS的诊断有一 定意义，但特异性和敏感性并不理想。uRF阳性率75%100%u高球蛋白血症uWBC下降(五)系统性硬化病（pSS）uANA阳性率50%55%uENA抗Scl-70阳性率15%40%u抗着丝点抗体(ACA)阳性(六)混合性结缔组织病（MCTD）uANA阳性uENA抗RNP高滴度阳性（七）血管炎（七）血管炎 抗中性粒细胞胞浆抗体（抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAANCA）荧光图谱分型主要抗原成分胞浆型cANCA核周型pANCA蛋白酶3（PR3）髓过氧化物酶（MPO）非典型型（cANCA）不清ANCA的临床意义uc-ANCA和PR3-ANCA 对韦格纳肉芽肿有高度特异性（95%），敏感性80% 与病情活动性相关 常作为判断药物疗效和病情复发的指标up-ANCA和MPO-ANCA 不如c-ANCA具有诊断特异性 阳性者血管炎程度较高，其滴度也与病情活动相关 主要与显微镜下多血管炎 坏死性新月体肾小球肾炎 变应性肉芽肿性血管炎 相关 自身免疫性肝病是一种不明原因的、肝脏 的慢性炎性病变。u自身免疫性肝炎（AIH） ANA 抗平滑肌抗体（SMA） 抗肝肾微粒体抗体u原发性胆汁性肝硬化（PBC） 抗线粒体抗体（AMA）M2u原发性硬化性胆管炎 ANCA阳性（八）自身免疫性肝病（八）自身免疫性肝病 谢谢 谢谢！