细胞工程复习课课件细胞工程复习课课件植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较获得细胞获得细胞或细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白细胞的全能性细胞的全能性细胞群体细胞群体植物体植物体培养结果培养结果快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交和动物细胞融合比较最终目的最终目的诱导方法诱导方法细胞融合的方法细胞融合的方法原理原理比较项目比较项目获得杂种植株获得杂种植株物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）去除细胞壁后去除细胞壁后诱诱导原生质体融合导原生质体融合细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性植物体细胞杂交植物体细胞杂交主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体物理、化学方法物理、化学方法（灭活的仙台病毒）（灭活的仙台病毒）使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合细胞膜的流动性细胞膜的流动性动物细胞融合动物细胞融合生物方法：生物方法：几种杂交技术的比较几种杂交技术的比较项项目目杂交育杂交育种技术种技术植物体细胞植物体细胞杂交技术杂交技术动物细胞动物细胞融合技术融合技术分子杂分子杂交技术交技术原原理理方方法法用用途途基因重组基因重组细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞的全能性细胞膜的流动细胞膜的流动性、细胞增殖性、细胞增殖碱基互补配碱基互补配对原则对原则植物母本植物母本去雄去雄套袋套袋人工传粉人工传粉后后, ,套袋隔套袋隔离离物理法：离心电物理法：离心电刺激振荡等刺激振荡等 化学法：化学法：PEGPEG物化法：同左物化法：同左 生物法：生物法：灭活的仙台灭活的仙台病毒病毒标记的标记的单链单链DNADNA或或RNARNA探探针针培养新品种培养新品种克服远缘杂交不克服远缘杂交不亲和性的障碍亲和性的障碍制备单克隆制备单克隆抗体抗体用于克隆基因用于克隆基因的筛选、基因的筛选、基因组中序列的定组中序列的定性、基因诊断等性、基因诊断等几种类型生物的培养几种类型生物的培养比比较生物生物微生物培养微生物培养植物植物动物物细胞胞培养培养组织培养培养无土栽培无土栽培培养培养对象象培养基培养基成分成分培养基培养基类型型培养培养条件条件微生物个体微生物个体离体植物细胞离体植物细胞 完整植物个体完整植物个体 幼龄动物幼龄动物器官或胚胎器官或胚胎水、无机盐、水、无机盐、碳源、氮源、碳源、氮源、生长因子生长因子水、无机盐、水、无机盐、有机营养、有机营养、维生素、维生素、植物激素植物激素水、无机盐水、无机盐水、无机盐、水、无机盐、有机营养、有机营养、维生素、维生素、动物血清动物血清固体、半固体固体、半固体或液体或液体固体固体液体液体液体液体无菌、适宜无菌、适宜的温度等的温度等无菌、离体、无菌、离体、适宜的温度等适宜的温度等光照、光照、COCO2 2、适宜的温度等适宜的温度等无菌、适宜的无菌、适宜的温度等温度等右图为细胞融合的简略过程（只考虑两个细右图为细胞融合的简略过程（只考虑两个细胞的融合），请据图回答：胞的融合），请据图回答：若若A、B是基因型分别为是基因型分别为rrHH、RRhh两个烟两个烟草品种细胞的花粉，且这两对基因位于非同源草品种细胞的花粉，且这两对基因位于非同源染色体上，由于一对隐性纯合基因染色体上，由于一对隐性纯合基因(rr或或hh) 的的作用，在光照强度大于作用，在光照强度大于800勒克斯时，都不能勒克斯时，都不能生长。生长。（1）实验开始时必须用）实验开始时必须用 除去不利于原生质体融合的物质。除去不利于原生质体融合的物质。（2）实验中除获得杂种细胞外，还有基因）实验中除获得杂种细胞外，还有基因型为型为 的融合细胞。的融合细胞。（3）设计一方法（不考虑机械方法），从）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，方法：培养液中分离出杂种细胞，方法： 纤维素酶纤维素酶(或果胶酶或果胶酶) rrHH、RRhh 置大于置大于800勒克斯光照下培养，收集分化的细胞团勒克斯光照下培养，收集分化的细胞团 5、（、（2006 2006 年江年江苏卷）卷）(9(9分分) )下下图是是单克隆抗体制克隆抗体制备流程流程阶段示意段示意图。（1 1） 技技术是是单克隆抗体技克隆抗体技术的基的基础。（2 2）根据培养基的用途分）根据培养基的用途分类，图中中HATHAT培养基属于培养基属于 培养基。培养基。（3 3）单克隆抗体与常克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的的血清抗体相比，最大的优越性是越性是 . . （4 4）动物物细胞融合除了采用植物胞融合除了采用植物细胞原生胞原生质体融合常用的体融合常用的诱导剂外，外，还可以采可以采用用 。（5 5）选出的出的杂交瘤交瘤细胞既具胞既具备骨髓瘤骨髓瘤细胞的胞的 特点，又具特点，又具备淋巴淋巴细胞的胞的 特点。特点。（6 6）淋巴）淋巴细胞是由胞是由动物体物体 中的中的 细胞分化、胞分化、发育而来。育而来。（7 7）杂交瘤交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是 。动物细胞培养动物细胞培养 选择选择 特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高 灭活的病毒灭活的病毒 在体外大量增殖在体外大量增殖 分泌特异性抗体分泌特异性抗体 骨髓骨髓 造血干造血干 主动运输主动运输 外植体外植体愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体脱分化脱分化再分化再分化一一、植植物物组组织织培培养养的的过过程程（分化）（分化）（未分化）（未分化）（分化）（分化）幼芽或幼根？幼芽或幼根？条条件件？优优点点？特点？特点？考点胡萝卜的组织培养技术及植物细胞工程的实际应用1细胞的全能性细胞的全能性(1)细胞全能性的基础：生物体的每一个细胞都含细胞全能性的基础：生物体的每一个细胞都含有本物种的全套遗传物质，都有发育成完整个体的全有本物种的全套遗传物质，都有发育成完整个体的全套基因。套基因。(2)细胞全能性实现的条件：离体、提供营养物质、细胞全能性实现的条件：离体、提供营养物质、激素及其他适宜条件。激素及其他适宜条件。(3)细胞全能性高低的比较：受精卵卵细胞体细胞全能性高低的比较：受精卵卵细胞体细胞；植物体细胞动物体细胞；细胞；植物体细胞动物体细胞；胚胎干细胞其他胚胎干细胞其他干细胞体细胞。干细胞体细胞。2胡萝卜的组织培养技术(1)实验原理：离体的植物组织、器官、细胞表现出植物细实验原理：离体的植物组织、器官、细胞表现出植物细胞的全能性，发育成新个体胞的全能性，发育成新个体。(2)实验流程：制备外植体实验流程：制备外植体接种接种脱分化培养脱分化培养再分化培再分化培养养移栽培养成正常植株移栽培养成正常植株。(3)注意事项注意事项选材：根尖、茎尖、形成层等最容易诱导脱分化。选材：根尖、茎尖、形成层等最容易诱导脱分化。无菌：培养基一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与无菌：培养基一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养，而且还会产生大量对培养物有害的物质。培养物争夺营养，而且还会产生大量对培养物有害的物质。光照：脱分化过程不需要光照，再分化过程一定要有光光照：脱分化过程不需要光照，再分化过程一定要有光照照。激素的使用激素的使用a生生长素类细胞分裂素类：诱导植物组织脱分化和根原长素类细胞分裂素类：诱导植物组织脱分化和根原基形成基形成。b生生长素类细胞分裂素类：诱导愈伤组织再分化和芽原长素类细胞分裂素类：诱导愈伤组织再分化和芽原基形成。基形成。c赤赤霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。3植物细胞工程的实际应用植物细胞工程的实际应用二二、植植物物体体细细胞胞杂杂交交过过程程植物细胞植物细胞 A A（大豆）（大豆）植物细胞植物细胞 B B（花生）（花生）原生质体原生质体 A A原生质体原生质体 B B再生出细胞壁再生出细胞壁方法？方法？促融方法？促融方法？类型？类型？遗传物质？遗传物质？优点？优点？去除细胞壁去除细胞壁原生质体融合原生质体融合杂种植株杂种植株( (大豆花生大豆花生) )细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种细胞杂种细胞植物体细胞杂交的过程：植物体细胞杂交的过程： 小小 结结D.筛选和组织培养。筛选和组织培养。C. 植物细胞植物细胞A和植物细胞和植物细胞B杂交时，产生了杂交时，产生了AB和和AA、BB型融合细胞。型融合细胞。B.诱导融合：注意物理方法的类型和化学方法的药诱导融合：注意物理方法的类型和化学方法的药剂剂聚乙二醇。聚乙二醇。A.制备原生质体：用纤维素酶、果胶酶分解细制备原生质体：用纤维素酶、果胶酶分解细胞壁。胞壁。E.打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。育作物新品种。考点植物体细胞杂交技术 细胞融合完成的标志细胞融合完成的标志：新的细胞壁的生成。：新的细胞壁的生成。 植物体细胞杂交的终点植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束。株，而不是形成杂种细胞就结束。杂种植株特征杂种植株特征：具备两种植物的遗传特征。：具备两种植物的遗传特征。原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。质。(1)体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管染色体、体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管染色体、基因组还是染色体组都采用直接相加的方法。基因组还是染色体组都采用直接相加的方法。若一植物细胞含若一植物细胞含有有 2X 条染色体，条染色体，2 个染色体组，基因型为个染色体组，基因型为 Aabb，另一植物细，另一植物细胞含有胞含有 2Y 条染色体，条染色体，2 个染色体组，基因型为个染色体组，基因型为 ccDd，则新植，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为株应为四倍体，其体细胞中染色体数为 2X 2Y ，基因型为，基因型为AabbccDd。(2)该培育新品种的过程中，该培育新品种的过程中，遗传物质的传递不遵循孟德尔遗传物质的传递不遵循孟德尔的遗传定律，的遗传定律，只有有性生殖进行减数分裂过程中才符合遗传定只有有性生殖进行减数分裂过程中才符合遗传定律，而体细胞杂交未有此过程。律，而体细胞杂交未有此过程。（2006年重年重庆卷）植物甲、乙是两种卷）植物甲、乙是两种濒危危药用植物（二倍体）。用植物（二倍体）。请按要求按要求回答回答问题：(1)以植物甲、乙的茎尖和叶片以植物甲、乙的茎尖和叶片为材料，通材料，通过组织培养培养获得了再生植株，解得了再生植株，解决了自然繁殖率低的决了自然繁殖率低的问题。这表明植物表明植物细胞具有胞具有_。由叶片等材。由叶片等材料形成的愈料形成的愈伤组织的形的形态结构特点是构特点是_。（2）题31图1和和题31图2分分别是植物甲、乙的萌是植物甲、乙的萌发花粉粒和未受精胚珠的示花粉粒和未受精胚珠的示意意图。在分离珠被在分离珠被细胞的原生胞的原生质体体时，通常使用，通常使用纤维素素酶和果胶和果胶酶破除破除细胞壁。胞壁。其原理是利用了其原理是利用了酶的的_性性质。 全能性全能性 排列疏松无规则排列疏松无规则,高度液泡化而无定型状态的薄壁细胞高度液泡化而无定型状态的薄壁细胞专一性专一性 动物细胞培养动物细胞培养 细胞培养按细胞的来源不同可以分为原代培养和细胞培养按细胞的来源不同可以分为原代培养和传代培养。传代培养。1.为什么将组织取出后，要用胰蛋白酶处理分散成单为什么将组织取出后，要用胰蛋白酶处理分散成单个细胞？个细胞？卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞骨髓瘤细胞？骨髓瘤细胞？选出能产特定抗体细胞群、继续培养选出能产特定抗体细胞群、继续培养体外培养体外培养从培养液从培养液中获取中获取促融方法？促融方法？单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程抗原？抗原？淋巴细胞？淋巴细胞？体内培养体内培养从腹水中提取从腹水中提取单克隆抗体单克隆抗体细胞融合细胞融合、筛选、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养物理法物理法化学法化学法生物法：生物法： 灭活的病毒灭活的病毒动物细胞培养技术应用动物细胞培养技术应用n克隆器官：皮肤、耳朵克隆器官：皮肤、耳朵n检测有毒物质检测有毒物质 n细胞治疗：干细胞细胞治疗：干细胞n蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、酶、激素、蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、酶、激素、生长因子、单抗生长因子、单抗单抗的应用和特点单抗的应用和特点n诊断、治疗和预防疾病诊断、治疗和预防疾病n治疗癌症等病（生物导弹）治疗癌症等病（生物导弹）n特异性强、灵敏度高、纯度高特异性强、灵敏度高、纯度高考点动物细胞培养和动物细胞克隆1动动物细胞培养物细胞培养(1)流程流程幼龄动物组织或胚胎幼龄动物组织或胚胎细胞贴壁生长细胞贴壁生长单个细胞细胞悬液细胞悬液细胞株或细胞系选用幼龄动物组织或胚胎的原因：它们的细胞分化程度选用幼龄动物组织或胚胎的原因：它们的细胞分化程度低，增殖能力很强，更易于培养。低，增殖能力很强，更易于培养。进行动物细胞传代培养时用进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶胰蛋白酶分散细胞，不用胃分散细胞，不用胃蛋白酶的原因：胃蛋白酶作用的适宜蛋白酶的原因：胃蛋白酶作用的适宜pH 约为约为 2，当，当 pH 大于大于 6时，胃蛋白酶就会失去活性。而胰蛋白酶作用的适宜时，胃蛋白酶就会失去活性。而胰蛋白酶作用的适宜pH 为为7.28.4，多数动物细胞培养的适宜，多数动物细胞培养的适宜 pH 为为7.27.4，因此胰蛋白酶，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时细胞间质适用于细胞培养时细胞间质(主要为蛋白质主要为蛋白质)的分解。的分解。(2)细胞贴壁和接触抑制细胞贴壁和接触抑制细胞贴壁细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。接触抑制接触抑制：细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长：细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。(3)动物细胞培养条件动物细胞培养条件营养：微量元素、无机盐、糖类、营养：微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。氨基酸、促生长因子、血清等。适宜的温度：适宜的温度：36.5 0.5 。适宜的适宜的 pH：7.27.4。气体环境气体环境O2：有氧呼吸、细胞代谢有氧呼吸、细胞代谢( (95%的空气的空气) )CO2：维持：维持 pH( (5%) )无菌、无毒环境：培养液和培养用具杀菌消毒，无菌、无毒环境：培养液和培养用具杀菌消毒，培养过程加抗生素杀菌，定期更换培养液，清除培养过程加抗生素杀菌，定期更换培养液，清除代谢产物。代谢产物。(4)动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用生产生物制品：疫苗、干扰素、抗体等。生产生物制品：疫苗、干扰素、抗体等。作为基因工程中的受体细胞。作为基因工程中的受体细胞。检测有毒物质及毒性。检测有毒物质及毒性。科研方面：筛选抗癌药物、治疗和预防疾病等。科研方面：筛选抗癌药物、治疗和预防疾病等。2动物核移植技术和克隆动物动物核移植技术和克隆动物(1)动物核移植技术可以分为动物核移植技术可以分为胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植和体细胞核和体细胞核移植，前者移植，前者比较容易比较容易。(2)如上图所示，注入去核卵母细胞中如上图所示，注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞。的不是供体细胞核，而是整个细胞。伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点构特点具有具有一定的流动性一定的流动性。(3)该技术形成的重组细胞发育成一个新个体，该技术形成的重组细胞发育成一个新个体，体现了体现了细胞核的全能性细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。而非动物细胞的全能性。a卵卵母细胞质内存在激发细胞母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。核全能性表达的物质。b卵母细胞体积大，便于操作。卵母细胞体积大，便于操作。c卵黄多，营养物质丰富等。卵黄多，营养物质丰富等。(4)用卵母细胞作受体细胞的原因用卵母细胞作受体细胞的原因1975197519751975年年年年KohlerKohlerKohlerKohler和和和和MilsteinMilsteinMilsteinMilstein的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图10101010示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：示意图。请据图回答下列问题：示意图。请据图回答下列问题：示意图。请据图回答下列问题：（1 1 1 1）该技术是在动物细胞培养）该技术是在动物细胞培养）该技术是在动物细胞培养）该技术是在动物细胞培养技术和技术和技术和技术和 技术的基础技术的基础技术的基础技术的基础上发展起来的。上发展起来的。上发展起来的。上发展起来的。（2 2 2 2）图）图）图）图10101010中细胞中细胞中细胞中细胞A A A A体外培养体外培养体外培养体外培养不具有分裂能力，但能分泌不具有分裂能力，但能分泌不具有分裂能力，但能分泌不具有分裂能力，但能分泌 ，细胞，细胞，细胞，细胞B B B B体外体外体外体外培养能够培养能够培养能够培养能够 。（3 3 3 3）动物细胞融合常用的）动物细胞融合常用的）动物细胞融合常用的）动物细胞融合常用的方法是方法是方法是方法是 。图10动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合 分泌特异性抗体分泌特异性抗体分泌特异性抗体分泌特异性抗体无限增殖无限增殖无限增殖无限增殖PEGPEGPEGPEG（灭活的病毒、电激）（灭活的病毒、电激）（灭活的病毒、电激）（灭活的病毒、电激）图10（4 4 4 4）细胞融合是随机的过程，）细胞融合是随机的过程，）细胞融合是随机的过程，）细胞融合是随机的过程，在在在在HATHATHATHAT培养基中培养，要筛选出培养基中培养，要筛选出培养基中培养，要筛选出培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过细胞。在细胞培养过细胞。在细胞培养过细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入常向培养液中加入常向培养液中加入常向培养液中加入 ( ( ( (激素激素激素激素) ) ) ) （5 5 5 5）培养）培养）培养）培养2 2 2 2周后，即测定培养周后，即测定培养周后，即测定培养周后，即测定培养细胞的特征，筛选出细胞的特征，筛选出细胞的特征，筛选出细胞的特征，筛选出 细胞置于不细胞置于不细胞置于不细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操同孔内（如图所示）培养。此操同孔内（如图所示）培养。此操同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到作前要将培养细胞稀释到作前要将培养细胞稀释到作前要将培养细胞稀释到7 7 7 710101010个细胞个细胞个细胞个细胞/ml/ml/ml/ml，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是 。（6 6 6 6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行进行进行进行 培养。培养。培养。培养。保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）一细胞培养以保证抗体的纯度）一细胞培养以保证抗体的纯度）一细胞培养以保证抗体的纯度）体外或体内体外或体内体外或体内体外或体内杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素 特异性分泌抗特异性分泌抗特异性分泌抗特异性分泌抗X X X X蛋白抗体的蛋白抗体的蛋白抗体的蛋白抗体的结束结束