第三章第三章DNA的生物合成的生物合成 中心法则中心法则 (The Central Dogma)遗传信息从遗传信息从DNADNA到蛋白质的传递规律到蛋白质的传递规律. .DNADNA的遗传信息转录为的遗传信息转录为RNARNA，RNARNA通过翻译指导合成蛋白质。通过翻译指导合成蛋白质。DNADNA还通过复制将遗传信息代代相还通过复制将遗传信息代代相传。传。19701970年发现年发现RNARNA能逆转录为能逆转录为DNADNA，是对中心法则的补充。，是对中心法则的补充。 逆转录逆转录 复制复制 DNADNA的的生物合成生物合成逆转录逆转录 复制（复制（replication）：）：以亲代以亲代DNADNA为模板合成两个相同子代为模板合成两个相同子代DNADNA的过程。的过程。DNA双螺旋结构双螺旋结构碱基配对规律碱基配对规律 第一节 复制的特征ParentalDNAPossible mechanisms for replication 半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)N N1414 一一. 半保留复制半保留复制 (semiconservative replication) 复制时，亲代的双链复制时，亲代的双链DNA解开成两条单链，解开成两条单链，分别分别作为模作为模板，板，以以dNTP(dATPdNTP(dATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP) )为原料为原料, , 按照碱基配对按照碱基配对(A(AT T、G GC)C)规律与模板上的碱基配对规律与模板上的碱基配对, ,经依赖经依赖DNADNA的的DNADNA聚合聚合酶酶(DNA-(DNA-polpol) )催化催化, ,合成一条与模板互补的新链合成一条与模板互补的新链, , 新形成的两个新形成的两个子代子代DNADNA分子与亲代分子与亲代DNADNA碱基序列碱基序列完全相同。每个完全相同。每个子代子代DNADNA分子分子中一股单链是从亲代完整地接受过来中一股单链是从亲代完整地接受过来, , 另一股单链是新合成的另一股单链是新合成的, ,故称为半保留复制。故称为半保留复制。 半保留复制的意义半保留复制的意义 按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNADNA与与亲亲代代DNADNA的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传传信信息息，体体现现了了遗遗传传的的保保守守性性。是是物物种种稳稳定定的的分分子子基基础础，但但是相对的，不是绝对的。是相对的，不是绝对的。 二二. 双向复制双向复制1. 复制起始点复制起始点 (origin, ori)：多数生物体内多数生物体内DNA分子两条链分子两条链同时复制。复制是在同时复制。复制是在DNA分子的特定位点开始，称为复制起分子的特定位点开始，称为复制起始点，常用始点，常用ori (origin)表示。表示。原核生物的原核生物的DNA只有一个只有一个Ori位点，位点， 复制从起点开始，到终点结束，完复制从起点开始，到终点结束，完 成整个成整个DNA分子的复制分子的复制,即原核生物即原核生物 的的DNA只有一个复制单位只有一个复制单位,为单复为单复 制子，称为复制体制子，称为复制体。 复制子：能独立完成复制的功能单位。复制子：能独立完成复制的功能单位。 真真核核生生物物染染色色体体DNA有有多多个个复复制制起起始始点点。同同时时形形成成多多个个复复制制单单位位，从从一一个个DNADNA复复制制起起始始点点起起始始的的DNA复复制制区区域域称称复复制制子子(replicon) ，每每个个复复制制子子在在一一个个细细胞胞分分裂裂周周期期中中必必须须起起动而且只能起动一次，真核生物染色体为多复制子。动而且只能起动一次，真核生物染色体为多复制子。 2.2.复制叉复制叉 (replication fork)(replication fork) 复制时，双链复制时，双链DNADNA由起始点处打开，沿两条张开的由起始点处打开，沿两条张开的 单链模板合成单链模板合成DNADNA新链，两侧形成的新链，两侧形成的Y Y型结构称为型结构称为复制叉复制叉(replication fork)(replication fork)。 3.3.双向复制双向复制 (bidirectional replication)(bidirectional replication) 复复制制是是从从一一个个起起始始点点开开始始，同同时时向向两两个个方方向向进行，称为进行，称为双向复制双向复制。三三. . 半不连续复制半不连续复制DNA双双螺螺旋旋结结构构的的两两条条链链走走向向相相反反，复复制制时时两两条条链链都都能能作作为模板合成子代为模板合成子代DNA。DNA的新链合成只能沿的新链合成只能沿53方向进行。方向进行。DNA解解链链并并开开始始复复制制后后，一一条条新新链链合合成成方方向向与与复复制制叉叉移移动动方方向向相相同同，即即以以35走走向向的的亲亲代代链链为为模模板板，因因此此该该链链可可沿沿53方向方向连续合成，连续合成，这条新链称为这条新链称为领头链。领头链。另另一一条条链链合合成成方方向向与与复复制制叉叉移移动动方方向向相相反反，新新链链不不能能连连续续合合成成称称为为随随从从链链。随随从从链链的的复复制制必必须须待待模模板板链链解解链链至至一一定定长长度度才才能能进进行行复复制制，随随复复制制叉叉延延伸伸过过程程，可可合合成成许许多多DNA片段片段(冈崎片段冈崎片段)，再经连接酶催化形成连续的新链。再经连接酶催化形成连续的新链。这这种种领领头头链链连连续续复复制制，随随从从链链不不连连续续复复制制的的方方式式称称DNA复复制的半不连续性。制的半不连续性。 领头链领头链 (leading strand)(leading strand) 顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行 的，得到一条连续的子链。的，得到一条连续的子链。 随从链随从链 (lagging strand)(lagging strand) 复制方向与解链方向相反，须等解开足够长复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。段所组成。 冈冈崎崎片段片段：19681968年日本生化学者冈崎利用电镜及放射自显影年日本生化学者冈崎利用电镜及放射自显影 技术，观察到技术，观察到DNADNA复制中出现一些不连续的片段复制中出现一些不连续的片段， 因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸， 真核生物约为数百个核苷酸。真核生物约为数百个核苷酸。 第二节第二节DNA复制的酶学复制的酶学 DNA复制体系复制体系 复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程, ,需要多种物质的共同参与需要多种物质的共同参与: : 底物：底物：dNTPdNTP ( (dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP) ) ； 聚合酶聚合酶(polymerase)(polymerase)：依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶， 简写为简写为DNA-DNA-polpol或或DDDPDDDP； 模板模板(template)(template)：解开成单链的解开成单链的DNADNA母链；母链； 引物引物(primer)(primer)：提供提供3-OH3-OH末端的寡核苷酸；末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子 一、一、DNA聚合酶聚合酶 催化催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是聚合到核酸链上的酶。是DNA复制复制的主要酶。全称叫的主要酶。全称叫依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或或DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），），均缩写为均缩写为DDDP。 ( (一一) DNA) DNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应1.1. 5 5至至33的聚合活性的聚合活性 催化四种催化四种dNTPdNTP一个一个地接到一个一个地接到DNADNA链上去。链上去。( (dNMP)dNMP)n n + + dNTPdNTP (dNMP) (dNMP)n+1n+1 + + PPiPPi 聚合反应机理聚合反应机理： 依赖于引物和模板依赖于引物和模板 催化核苷酸聚合有方向性：催化核苷酸聚合有方向性： 55 33 聚合反应的特点：聚合反应的特点：(1)以单链以单链DNA为模板为模板(2)以以dNTP为原料为原料(3)引物提供引物提供3-OH(4)聚合方向为聚合方向为53(5)形成形成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键 2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性3535外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸即时校读即时校读5353外切酶活性：外切酶活性： 切除引物切除引物 切除突变的片段切除突变的片段 ( (二二) DNA) DNA聚合酶的种类聚合酶的种类1. 1. 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5353聚合酶活性聚合酶活性+ + + +3535外切酶活性外切酶活性+ + + +5353外切酶活性外切酶活性+ +- -功功 能能切除引物切除引物填补空隙填补空隙修复合成修复合成不清不清复制的主复制的主要酶要酶活性最高活性最高 DNA-pol I:单一肽链的大分子，二级结构以单一肽链的大分子，二级结构以-螺旋为主，螺旋为主， 含含AR 18个个-螺旋。螺旋。曾被称为复制酶曾被称为复制酶(replicase)含量最多含量最多功能功能: 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。隙进行填补。proteaseN-terminalC-terminalProtease 小片段（小片段（323 A.A）：具有具有53外切酶活性外切酶活性大片段（大片段（604 A.A）：具有具有5 3聚合活性聚合活性和和35外切酶活性外切酶活性(Klenow 片段片段)是是实验室实验室常用的工具酶。常用的工具酶。可被水解成两个片段可被水解成两个片段 DNA-pol III:是是E.coli的复制酶，在复制延长中真正起聚合新的复制酶，在复制延长中真正起聚合新链作用的链作用的DNA聚合酶。聚合酶。由由10种亚基组成的不对称二聚体：种亚基组成的不对称二聚体： 核心酶核心酶 (,):3 5 外切酶活性和外切酶活性和5 3 聚合酶活性聚合酶活性 亚基亚基: sliding clamp protein -复合物复合物: 识别带引物的单链识别带引物的单链DNA，促进全酶组促进全酶组装至模板上，稳定酶结构，增强核心酶活性。装至模板上，稳定酶结构，增强核心酶活性。催化效率最高催化效率最高 2. 2. 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-DNA-polpol 引物酶活性，复制起始引发引物酶活性，复制起始引发DNA-DNA-polpol 没有其他没有其他DNA-DNA-polpol时才起作用时才起作用DNA-DNA-polpol 催化线粒体催化线粒体DNADNA的复制的复制DNA-DNA-polpol 复制中延长子链的主要酶，复制中延长子链的主要酶， 有解螺旋酶活性有解螺旋酶活性DNA-DNA-polpol 与原核生物的与原核生物的DNA-DNA-polIpolI相似，相似， 在复制中起校读、修复和填补在复制中起校读、修复和填补 缺口作用。缺口作用。 (三三)复制的保真性复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：至少依赖三种机制：1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3.复制中的即时校读功能。复制中的即时校读功能。 二、解旋解链酶类二、解旋解链酶类解开并理顺解开并理顺DNADNA双链，维持双链，维持DNADNA 处于单链状态。主要有处于单链状态。主要有解螺旋酶解螺旋酶、 DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶和和单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白。 ( (一一) ) 解螺旋酶解螺旋酶 ( (helicasehelicase) ) : : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对， 而碱基却埋在双螺旋的内部。只有而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把把DNADNA解开成单解开成单 链，它才能起模板作用。链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质， 当时称为当时称为reprep蛋白。作用是蛋白。作用是利用利用ATPATP供能，解开供能，解开DNADNA 双链。双链。 复制相关蛋白的基因复制相关蛋白的基因：dnaAdnaA、dnaBdnaB、 dnaCdnaC dnaXdnaX相应的表达产物蛋白质：相应的表达产物蛋白质：DnaADnaA、DnaBDnaB、 DnaCDnaC DnaXDnaX DnaDna A A：辨认复制起始位点辨认复制起始位点 DnaDna B B：解螺旋酶解螺旋酶 DnaDna C C：辅助解螺旋酶使其在起始点上辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。结合并打开双链。 ( (二二) ) 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(SSB)(SSB) : :大肠杆菌大肠杆菌SSBSSB是由是由177177个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的 同源四聚体，结合单链同源四聚体，结合单链DNADNA的跨度约的跨度约3232个核苷个核苷 酸单位。酸单位。 SSBSSB与解开的与解开的DNADNA单链紧密结合，防止单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制在复制 中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 ( (三三) DNA) DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 ( (topoisomerasetopoisomerase) ) 拓扑：拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物是指物体或图像作弹性移位而又保持物 体原有的性质。体原有的性质。 拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNADNA拓扑构象的酶。拓扑构象的酶。 对对DNADNA分子的作用是分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键既能水解、又能连接磷酸二酯键 可松弛可松弛DNADNA超螺旋，有利于超螺旋，有利于DNADNA解链。解链。 拓扑异构酶拓扑异构酶I I（topotopo I I）: : 在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。主要作用是切开主要作用是切开DNADNA双链中的一股，使双链中的一股，使 DNADNA解链旋转中不打结解链旋转中不打结，DNADNA变为松弛变为松弛 状态再封闭切口。状态再封闭切口。催化反应不需要催化反应不需要ATPATP。 拓扑异构酶拓扑异构酶IIII（ topotopo II II）: : 在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶( (gyrasegyrase) )。能切断能切断DNADNA双链，使螺旋松弛。在双链，使螺旋松弛。在ATPATP参参 与下，松弛与下，松弛的的DNADNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接 断端。断端。 三、引物酶和引发体三、引物酶和引发体 引物酶引物酶 ( (primaseprimase):): 依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶。聚合酶。 催化催化RNARNA引物的合成。引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是在大肠杆菌，引物酶是dnaGdnaG基因的产物。基因的产物。 RNARNA引物引物：在在DNADNA模板的复制起始部位由引物酶催模板的复制起始部位由引物酶催 化化NTPNTP的聚合，形成短片段的的聚合，形成短片段的RNARNA，为，为DNADNA 聚合提供聚合提供3-OH3-OH末端。末端。 引发体引发体 ( (primosomeprimosome):): 是由是由DnaBDnaB、DnaCDnaC等等蛋白因子一起形成复合体，蛋白因子一起形成复合体，再结合引物酶再结合引物酶( (DnaGDnaG) )形成较大的聚合体，结合形成较大的聚合体，结合到模板到模板DNADNA上。上。 复制开始时，在引发体的下游解开双链，复制开始时，在引发体的下游解开双链， 再由引物酶催化引物的合成。再由引物酶催化引物的合成。 四、四、DNADNA连接酶连接酶（DNA DNA ligaseligase）连接连接DNADNA链链3 3 -OH-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链链5 5 -P-P末端，形成磷酸二酯键，末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的从而把两段相邻的DNADNA链连接成完整的链。反应需要链连接成完整的链。反应需要ATP/NADATP/NAD+ +。只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的在的DNADNA或或RNARNA单链。单链。若若DNADNA两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接。两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接。 DNA连接酶在连接酶在复制、复制、DNA修复、修复、重组、剪接重组、剪接中均起中均起缝合缺口缝合缺口作用。作用。 是重要的是重要的工具酶工具酶之一。之一。 第三节第三节DNA生物合成过程生物合成过程 一、原核生物一、原核生物DNADNA的生物合成的生物合成（一）复制的起始（一）复制的起始1. 1. 识别复制起始点识别复制起始点2. 2. 解开解开DNADNA双链：双链： 由拓扑异构酶松弛超螺旋，由拓扑异构酶松弛超螺旋， 解螺旋酶解开双链，解螺旋酶解开双链， SSBSSB结合到单链上使其稳定。结合到单链上使其稳定。3. 3. 形成引发体和生成引物形成引发体和生成引物 Genome in E. coliE. coli 复制起始点复制起始点oriC的序列特征的序列特征 三组各三组各13bp的的串连重复序列（串连重复序列（Tandem repeats） 两对两对 9 bp反向重复序列（反向重复序列（inverted repeats）,富含富含AT，是是 DnaA蛋白的结合部位。蛋白的结合部位。 (1)DnaA(1)DnaA辨认并结合辨认并结合oriCoriC处处并使此并使此区域区域DNADNA解链。解链。(2)DnaB(2)DnaB在在DnaCDnaC协助下解开双链并协助下解开双链并沿解链方向移动，逐渐置换沿解链方向移动，逐渐置换DnaADnaA，SSBSSB结合于解开的单链结合于解开的单链DNADNA上。上。(3)(3)引物酶引物酶DnaGDnaG进入，形成由进入，形成由DnaBDnaB、DnaCDnaC、DnaGDnaG和和DNADNA起始复制区起始复制区构成的构成的引发体。引发体。 (4)(4)引发体的蛋白质在引发体的蛋白质在DNADNA链上链上可以移动可以移动, ,消耗消耗ATPATP。(5)(5)引物酶引物酶DnaGDnaG沿沿5353方方向催化向催化NTPNTP聚合，合成短链聚合，合成短链RNARNA引物。引物。引物长度约为十引物长度约为十几个到几十个核苷酸不等几个到几十个核苷酸不等。(6)(6)聚合酶聚合酶催化第一个催化第一个dNTPdNTP与引物与引物3 3-OH-OH生成磷酸二生成磷酸二酯键。酯键。(7)(7)拓扑酶作用拓扑酶作用, , 使解链顺利使解链顺利进行。进行。复制的起始大肠杆菌DNA复制的步骤参与复制起始的各种因子参与复制起始的各种因子DnaA蛋白蛋白辨认起始点辨认起始点解螺旋酶（解螺旋酶（DnaB蛋白，蛋白，rep蛋白）蛋白）解开解开DNA双链双链DnaC蛋白蛋白协助解螺旋酶协助解螺旋酶引物酶（引物酶（DnaG蛋白）蛋白）催化催化RNA引物生成引物生成SSB稳定解开的单链稳定解开的单链拓扑异构酶拓扑异构酶理顺理顺DNA链链oriC(245bp的的DNA组分组分)E.coli的复制起始点的复制起始点名称名称功能功能 （二）复制的延长（二）复制的延长 在在DNADNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTPdNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的为原料，进行聚合作用。即新进入的dNTPdNTP与引物或延与引物或延长中的子链上长中的子链上3 3 OHOH形成磷酸二酯键，由形成磷酸二酯键，由553 3 方向延长方向延长子链。子链。 半不连续复制：半不连续复制：（1 1）领头链合成方向与解链方向一致）领头链合成方向与解链方向一致, ,连续合成连续合成（2 2）随从链方向与解链方向相反）随从链方向与解链方向相反, 5, 5 33 不连续合成不连续合成 同一复制叉上，领头链先于随从链复制，同一复制叉上，领头链先于随从链复制， 但两链由同一但两链由同一DNA-DNA-polpol催化合成催化合成 （三）复制的终止（三）复制的终止原核生物为环状原核生物为环状DNADNA，双向复制，两个复制叉双向复制，两个复制叉的汇合点就是复制的终点的汇合点就是复制的终点(termination, (termination, TerTer) )E.coliE.coli的复制终点的复制终点(32(32位点位点) )位于环形染色体和位于环形染色体和OriCOriC相对处，有特异的相对处，有特异的 终止区序列，刚好把终止区序列，刚好把DNADNA 分成分成2 2个半圆个半圆, ,双向复制双向复制 进行进行180180度后在终点汇合。度后在终点汇合。 随从链不连续片段的连接随从链不连续片段的连接 1.1.引物水解引物水解: :前一个冈崎片段延长至后一片段时前一个冈崎片段延长至后一片段时,DNA-,DNA-polIpolI 水解引物；水解引物； 2.2.填补空隙填补空隙: :polpol利用前一个冈崎片段的利用前一个冈崎片段的3-OH,3-OH,催化催化 dNTPdNTP聚合填补空缺；聚合填补空缺； 3.3.片段连接片段连接:DNA:DNA连接酶连接二个连接酶连接二个DNADNA片段，形成完整的片段，形成完整的DNADNA链。链。领头链引物水解后的空隙由环状领头链引物水解后的空隙由环状DNADNA最后复制的最后复制的3-OH3-OH末端延末端延长填补并连接。长填补并连接。复制终止后复制终止后, 2, 2个子代个子代DNADNA分子相互铰链在一起分子相互铰链在一起, ,在拓扑酶在拓扑酶作作用下用下, ,将其分开。将其分开。 2222222 22 22 22222222333333333333333333333333333333333333333222222233333333333333333333333333333333333333332222222322222222 22 22 22 22 22 22 2真核生物细胞分裂的时相变化真核生物细胞分裂的时相变化真核生物细胞分裂的时相变化真核生物细胞分裂的时相变化细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期: : G1 phase: period growth of cell S phase: DNA合成期合成期 G2 phase: cells prepare for mitosis M phase: mitosis Go phase: nondividing cellsDNA replicate periodically二.真核生物DNA的生物合成真核生物真核生物DNADNA复制的特点复制的特点真真核核染染色色质质DNADNA结结构构庞庞大大，DNADNA复复制制有有多多个个起起始始点点，通通过过许许多多独独立立复复制制子子完完成成。每每个个复复制制子子有有固固定定复复制制起起点点，双双向向复复制。制。各起点复制起始不同步。各起点复制起始不同步。真核生物真核生物DNADNA聚合酶有聚合酶有DNA-DNA-polpol、。DNA-DNA-polpol 在复制延长中起催化作用，在复制延长中起催化作用，有有解螺旋酶活性解螺旋酶活性。DNA-DNA-polpol 有有引物酶活性。引物酶活性。拓扑异构酶拓扑异构酶复制因子复制因子(Replication factor, RF): RFA, RFC(Replication factor, RF): RFA, RFC等等. .增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear (Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)antigen,PCNA)聚合聚合DNADNA速度比原核速度比原核DNA-DNA-polpol慢，但总体速度不慢。慢，但总体速度不慢。随随后后链链也也是是不不连连续续合合成成，冈冈崎崎片片段段比比原原核核细细胞胞的的短短，只只有有数百个核苷酸。数百个核苷酸。真核生物线性染色体真核生物线性染色体: :多个复制起点，复制叉到达下一个起点或分子末端时即终止。多个复制起点，复制叉到达下一个起点或分子末端时即终止。真核真核DNADNA复制的同时复制的同时, ,组蛋白、非组蛋白同时合成组蛋白、非组蛋白同时合成, ,复制完成复制完成后后, , 装配成核蛋白装配成核蛋白, , 组成染色体。组成染色体。DNA ligaseDNA polymeraseRNase HRemove RNA primerFill the gapJoin DNA fragmentsDNA pol DNA ligase 真核生物复制的终止真核生物复制的终止 染色体染色体DNADNA呈线性，复制在末端停止。呈线性，复制在末端停止。 端粒与端粒酶端粒与端粒酶 端粒端粒(telomere)(telomere)是位于真核细胞线性是位于真核细胞线性 染色体末端的特殊结构染色体末端的特殊结构, ,由一段串联由一段串联 重复的富含重复的富含T T、G G的的DNADNA短序列与端粒结合蛋白构成；短序列与端粒结合蛋白构成； 端粒具有稳定染色体，防止末端降解和融合的功能；并维持端粒具有稳定染色体，防止末端降解和融合的功能；并维持 DNADNA复制的完整性。复制的完整性。 端粒端粒DNADNA序列在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相序列在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相 似，由长似，由长5-10bp5-10bp的重复单位串联而成，人的重复单位串联而成，人类类的重复序列为的重复序列为 TTAGGGTTAGGG，长约长约15kb15kb； 端粒平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短端粒平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短, , 端粒端粒DNADNA逐渐变短而消失逐渐变短而消失, ,可导致染色体稳定性下降，可导致染色体稳定性下降，细胞随细胞随 之衰老。之衰老。荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下）荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下）荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下）荧光原位杂交显示的端粒（上）和端粒序列（下） 端粒酶端粒酶 (telomerase)由由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白复合体，和蛋白质构成的一种核糖核蛋白复合体，RNA分子分子含复制端粒含复制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白质部分具有逆转所需的核苷酸模板，其蛋白质部分具有逆转录酶活性。能以自身的录酶活性。能以自身的RNA为模板逆转录合成端粒为模板逆转录合成端粒DNA，维维持端粒的长度。持端粒的长度。 人类端粒酶含三部分：人类端粒酶含三部分： 端粒酶端粒酶RNA (Human telomerase RNA, hTR)、 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白 (Human telomerase associated protein1, hTP1)、 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶 (Human telomerase reverse transcriptase, hTRT).除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外,大多数正常人体大多数正常人体细胞检测不到端粒酶活性。细胞检测不到端粒酶活性。恶性肿瘤细胞中恶性肿瘤细胞中, 85%90%端粒酶强阳性。端粒酶强阳性。端粒酶可作为端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点肿瘤标志和肿瘤治疗靶点. . 爬行模型：爬行模型： 端粒及端粒酶的意义：端粒及端粒酶的意义： 端端粒粒的长短及的长短及端粒酶端粒酶活性变化与细胞水平活性变化与细胞水平的的老化老化(aging)(aging)及及肿瘤肿瘤的发生有一定关系。的发生有一定关系。第四节第四节 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式一一. .逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒和逆转录酶 逆转录逆转录 (reverse transcription)(reverse transcription) 以以RNARNA为模板，为模板，dNTPdNTP为原料为原料, ,在逆转录酶催化下在逆转录酶催化下, ,合成与合成与RNARNA互补的互补的DNADNA的过程。的过程。 逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase,(reverse transcriptase,依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶) ) 1. RNA 1. RNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 2. RNA2. RNA水解酶活性水解酶活性 3. DNA3. DNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性3D model of 3D model of HIVHIV reverse transcriptase reverse transcriptase 逆转录过程：逆转录过程： 逆转录酶催化的逆转录酶催化的DNADNA合成反应也是合成反应也是5353方向方向。 需要的需要的引物引物是病毒本身的一种是病毒本身的一种tRNAtRNA。1.Aretrovirus-specificcellulartRNAhybridizeswithacomplementaryregioncalledtheprimer-bindingsite(PBS).2. A DNA segment is extended from tRNA based on the sequence of the retroviralgenomicRNA.3.TheviralRandU5sequencesareremovedbyRNaseH.4.Firstjump:DNAhybridizeswiththeremainingRsequenceatthe3end.5.ADNAstrandisextendedfromthe3end.6.MostviralRNAisremovedbyRNaseH.7.AsecondDNAstrandisextendedfromtheviralRNA.8.BothtRNAandtheremainingviralRNAareremovedbyRNaseH.9.Secondjump:ThePBSregionofthesecondstrandhybridizeswiththePBSregionofthefirststrand.10.ExtensiononbothDNAstrands.LTRstandsforlongterminalrepeat.RNARNA病毒经逆转录成为双病毒经逆转录成为双链链DNADNA，能整合入宿主细能整合入宿主细胞基因组，并随宿主细胞胞基因组，并随宿主细胞复制和表达复制和表达, ,可能使宿主可能使宿主细胞发生癌变。细胞发生癌变。Atypical,minimalretrovirusconsistsof:1. an outer envelope which was derived from theplasmamembraneofitshost2.manycopiesofanenvelopeproteinembeddedinthelipidbilayerofitsenvelope3.acapsid;aproteinshellcontaining4.twomoleculesofRNAand5.moleculesoftheenzymereversetranscriptaseHuman Immunodeficiency Virus (HIV)Human Immunodeficiency Virus (HIV) Reverse transcription in virus分子生物学研究可应用逆转录酶合成分子生物学研究可应用逆转录酶合成DNADNA。以以mRNAmRNA为模板，经逆转录合成的与为模板，经逆转录合成的与mRNAmRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA链，称为链，称为互补互补DNADNA ( ( complementary complementary DNA,DNA,cDNAcDNA) )cDNA 二二. . 滚环复制和滚环复制和D D环复制环复制 一些简单低等生物或染色体以外的一些简单低等生物或染色体以外的DNADNA复制的特殊形式。复制的特殊形式。D环复制滚环复制线粒体DNA为D环复制D D环复制的特点是环复制的特点是复制起点不在双复制起点不在双链链DNADNA同一位点，同一位点，内、外环复制有内、外环复制有时序差别时序差别 第四节第四节 DNA损伤与修复损伤与修复 突变突变(mutation)：是指遗传物质结构改变而引起是指遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变，也称为的遗传信息的改变，也称为DNA损伤损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。分子上碱基的改变。 一、突变的意义一、突变的意义(一一)突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础进化过程是突变的不断发生所造成的。没进化过程是突变的不断发生所造成的。没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传学家认为：没有突变就不会有遗传学。学家认为：没有突变就不会有遗传学。大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，叫自发突变或自然突变（叫自发突变或自然突变（spontaneousmutation）。）。 (二二)突变导致基因型改变突变导致基因型改变这种突变只有基因型的改变，而没有可察这种突变只有基因型的改变，而没有可察觉的表型改变。觉的表型改变。多态性多态性(polymophism)：是用来描述个体是用来描述个体之间的基因型差别现象。利用之间的基因型差别现象。利用DNA多态性多态性分析技术，可识别个体差异和种、株间差分析技术，可识别个体差异和种、株间差异。异。 (三三)突变导致死亡突变导致死亡突变发生在对生命至关重要的基因上，可突变发生在对生命至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。导致个体或细胞的死亡。 (四四)突变是某些疾病的发病基础突变是某些疾病的发病基础包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。有包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。有些已知其遗传缺陷所在。但大多数尚在研些已知其遗传缺陷所在。但大多数尚在研究中。究中。镰状细胞贫血 是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。因-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。 二、引发突变的因素二、引发突变的因素大量的突变属自发突变，发生频率大量的突变属自发突变，发生频率为为10-9。用生活环境中导致突变的因素，在实用生活环境中导致突变的因素，在实验室可以诱发突变，称为诱变，导致验室可以诱发突变，称为诱变，导致突变的因素称为诱变剂。主要有物理突变的因素称为诱变剂。主要有物理和化学因素。和化学因素。 物理因素：物理因素：紫外线和各种辐射紫外线和各种辐射二聚体的形成影响了二聚体的形成影响了DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构, , 使复制和转录受阻使复制和转录受阻 化学因素：化学因素：常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别分子改变分子改变碱基碱基类似物类似物 ( (如：如：5-BU)5-BU)A5-BU GA5-BU G羟胺类羟胺类 (NH(NH2 2OH)OH)T CT C亚硝酸盐亚硝酸盐 (NO(NO2 2- -) )C UC U烷化烷化剂剂 ( (如：氮芥类如：氮芥类) )G G m mG G 三、突变的类型三、突变的类型( (一一) )错配（错配（点突变）点突变）指指DNADNA分子上一个碱基的变异（置换）。分子上一个碱基的变异（置换）。1. 1. 转换转换 (transition)(transition)：发生在同型碱基之间的置换发生在同型碱基之间的置换 嘌呤嘌呤 嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 嘧啶嘧啶2. 2. 颠换颠换 ( (transversiontransversion) )：发生在异型碱基之间的置换发生在异型碱基之间的置换 嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 镰形红细胞贫血病人的镰形红细胞贫血病人的HbHb ( (HbSHbS) )与正常成人的与正常成人的HbHb ( (HbAHbA) )比较比较HbSHbA 基因模板链基因模板链CACCTC mRNA mRNAGUGGAG 肽链肽链第第6 6位位氨基酸氨基酸ValGlu ( (二二) )缺失缺失(deletion)(deletion)和和插入插入(insertion)(insertion)1. 1. 缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNADNA 大分子上缺失大分子上缺失2. 2. 插入：插入：DNADNA大分子上插入一个碱基或一大分子上插入一个碱基或一 段核苷酸链段核苷酸链 框移框移突变突变 (frame-shift mutation):(frame-shift mutation):缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。通常使基因产物完全失活，出现终止码会使翻译提前终止。正常正常 5GCAGUACAUGUC丙丙缬缬组组缬缬缺失缺失C5GAGUACAUGUC谷谷酪酪蛋蛋丝丝 ( (三三) )重排重排(rearrangement)(rearrangement)DNADNA分子内发生较大片段的交换，也称为分子内发生较大片段的交换，也称为重组。重组。 移位的移位的DNADNA可以在新位点上颠倒方向反置可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体（倒位），也可以在染色体 之间发生交换重组。之间发生交换重组。第四章：第四章：DNA的突变、损伤和修复的突变、损伤和修复第一节：突变第一节：突变（mutation)mutation)一、突变的主要类型 突变是突变是DNADNA碱基序列水平上的永久的、可遗传的改变。碱基碱基序列水平上的永久的、可遗传的改变。碱基序列的变化可以分为下面几种类型序列的变化可以分为下面几种类型 ： 碱基替换（碱基替换（base substitutionbase substitution），即），即DNADNA分子中一个碱基被分子中一个碱基被另一个碱基替代；插入（另一个碱基替代；插入（insertioninsertion），涉及一个或多个碱基插），涉及一个或多个碱基插入到入到DNADNA序列中；缺失（序列中；缺失（deletiondeletion），涉及），涉及DNADNA序列上一个或多序列上一个或多个碱基的缺失；个碱基的缺失；第一节：突变第一节：突变（mutation)mutation)重复（重复（duplicationduplication），一段碱基序列发生一次重复；），一段碱基序列发生一次重复；倒位（倒位（inversioninversion），一段碱基序列发生倒转，但仍保），一段碱基序列发生倒转，但仍保留在原来的位置上；易位（留在原来的位置上；易位（translocationtranslocation），一段碱），一段碱基序列从原来的位置移出，并插入到基因组的另一位基序列从原来的位置移出，并插入到基因组的另一位置。置。 1. 1. 碱基替换碱基替换 碱基替换又称为点突变（碱基替换又称为点突变（point mutationpoint mutation），是一），是一种最简单的突变。碱基替换可以分为转换种最简单的突变。碱基替换可以分为转换（transitiontransition）和颠换（）和颠换（transversiontransversion）两种类型。）两种类型。转换是指嘌呤与嘌呤之间，或嘧啶与嘧啶之间的替换；转换是指嘌呤与嘌呤之间，或嘧啶与嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤与嘧啶之间的替换。颠换是指嘌呤与嘧啶之间的替换。2. 2. 缺失、插入、移码突变缺失、插入、移码突变基基因因的的编编码码序序列列中中插插入入或或者者缺缺失失一一个个或或两两个个碱碱基基，会会使使DNADNA的的阅阅读读框框架架发发生生改改变变，导导致致插插入入或或缺缺失失部部位位之之后后的的所所有有密密码码子子都都跟跟着着发发生生变变化化，结结果果产产生生一一种种截截短短的的或或 异异 常常 的的 多多 肽肽 链链 ， 这这 种种 突突 变变 称称 为为 移移 码码 突突 变变（frameshiftframeshift mutationsmutations）。移移码码突突变变常常常常完完全全破破坏坏了了编编码码蛋蛋白白质质的的功功能能，除除非非移移码码突突变变发发生生在在靠靠近近读读码码框的远端的地方。框的远端的地方。 3. DNA重排 DNA DNA重排包括缺失、倒位、易位和重复。基因组中重排包括缺失、倒位、易位和重复。基因组中相似序列之间的配对，以及随后发生的重组可以造成相似序列之间的配对，以及随后发生的重组可以造成DNADNA的重排。如图，同一的重排。如图，同一DNADNA分子的两个同向重复序列分子的两个同向重复序列之间的配对和重组将使两个重复序列之间的部分形成之间的配对和重组将使两个重复序列之间的部分形成一个独立的环，从原来的一个独立的环，从原来的DNADNA分子上释放出来。原来的分子上释放出来。原来的DNADNA分子则产生相应的缺失。分子则产生相应的缺失。 图表示同一图表示同一DNADNA分子上的两个反向重复序列发生配分子上的两个反向重复序列发生配对形成的茎环结构。配对后的重组将导致反向重复序列对形成的茎环结构。配对后的重组将导致反向重复序列之间的部分发生倒位。例如，大肠杆菌染色体含有之间的部分发生倒位。例如，大肠杆菌染色体含有7 7个个拷贝的拷贝的rRNArRNA基因。有一些大肠杆菌菌株，染色体上两个基因。有一些大肠杆菌菌株，染色体上两个rRNArRNA操纵子之间的序列发生了倒位。这些菌株能够存活操纵子之间的序列发生了倒位。这些菌株能够存活，但生长速度比正常的菌株要慢一些。，但生长速度比正常的菌株要慢一些。 第二部分：第二部分：突变的修复突变的修复一、光一、光 复复 活（活（ PhotoreactivationPhotoreactivation ）在可见光存在的情况下，在可见光存在的情况下，DNADNA光解酶（光解酶（DNA DNA photolyasephotolyase）把环丁烷嘧啶二聚体分解为单体。）把环丁烷嘧啶二聚体分解为单体。DNADNA光光解酶解酶, ,又称光复活酶（又称光复活酶（photoreactivatingphotoreactivating enzyme enzyme）。）。光解酶在暗中结合到环丁烷二聚体上，吸收光解酶在暗中结合到环丁烷二聚体上，吸收300300350 350 nmnm的光后被激活，裂解二聚体后与的光后被激活，裂解二聚体后与DNADNA分子脱离。从光分子脱离。从光复活修复过程可以看出，光解酶不是将嘧啶二聚体替换复活修复过程可以看出，光解酶不是将嘧啶二聚体替换掉，而是将两个嘧啶环之间的非正常化学键切开，恢复掉，而是将两个嘧啶环之间的非正常化学键切开，恢复到原来的形式。由于这种修复作用只在可见光下才可发到原来的形式。由于这种修复作用只在可见光下才可发生，所以这种修复机制称为光复活。生，所以这种修复机制称为光复活。 ( (一一) )光修复光修复 (lightrepairing)二、烷基的转移 核苷酸切除修复需要移去一段包括损伤在内的核核苷酸切除修复需要移去一段包括损伤在内的核苷酸序列，然后再通过苷酸序列，然后再通过DNADNA合成把余下的单链缺口合成把余下的单链缺口填补上。它可以修复一系列损伤，包括环丁烷二聚填补上。它可以修复一系列损伤，包括环丁烷二聚体、体、6 64 4光产物和链间交联等引起的光产物和链间交联等引起的DNADNA变形变形（major distortionmajor distortion）。尽管这些损伤也可以通过）。尽管这些损伤也可以通过途径进行修复，但途径进行修复，但NERNER是它们的主要修复手段。其是它们的主要修复手段。其他能够引起他能够引起DNADNA产生显著变形的损伤也可以通过该产生显著变形的损伤也可以通过该途径进行修复。但是，这种机制不能修复途径进行修复。但是，这种机制不能修复DNADNA上的上的错配碱基，以及仅造成错配碱基，以及仅造成DNADNA微小变形的碱性类似物微小变形的碱性类似物和甲基化碱基。和甲基化碱基。三、核苷酸切除修复三、核苷酸切除修复修复过程需要多种酶的一系列作用，其中包括修复过程需要多种酶的一系列作用，其中包括UvrAUvrA, , UvrBUvrB, , UvrCUvrC 和和 UvrDUvrD。由。由2 2个个UvrAUvrA亚基和亚基和1 1个个UvrBUvrB亚基亚基构成的复合体，非特异性地结合在构成的复合体，非特异性地结合在DNADNA分子上，并沿分子上，并沿DNADNA分子滑动，对分子滑动，对DNADNA进行扫描，其中进行扫描，其中UvrAUvrA负责检测螺负责检测螺旋中的扭曲，一旦抵达扭曲部位，旋中的扭曲，一旦抵达扭曲部位，UvrAUvrA就会退出复合就会退出复合体。体。UvrBUvrB募集募集UvrCUvrC, , UvrCUvrC具有核酸内切酶活性，它切具有核酸内切酶活性，它切断损伤位点两侧的磷酸二酯键，断损伤位点两侧的磷酸二酯键，3切割点距损伤位点切割点距损伤位点4 45 5个核苷酸，个核苷酸，5切割点距损伤位点切割点距损伤位点8 8个核苷酸。个核苷酸。UvrDUvrD与与5端的端的切点结合。切点结合。UvrDUvrD是一种解旋酶（又称是一种解旋酶（又称DNA DNA helicasehelicase II II），它解开两个切点之间的），它解开两个切点之间的DNADNA双螺旋，双螺旋，导致一段短的带有损伤的导致一段短的带有损伤的ssDNAssDNA和和UvrCUvrC被释放出来，被释放出来，此时此时UvrBUvrB仍结合于另一条单链仍结合于另一条单链DNADNA分子上，可能是防分子上，可能是防止单链被降解止单链被降解, ,也可能是指导也可能是指导DNADNA聚合酶聚合酶I I与缺口的与缺口的3 3 OHOH结合，合成一段新的核苷酸片断填补缺口，同时释结合，合成一段新的核苷酸片断填补缺口，同时释放出放出UvrB, ,最后一个磷酸二酯键由最后一个磷酸二酯键由DNADNA连接酶催化形成。连接酶催化形成。四、碱基切除修复四、碱基切除修复 DNADNA糖基化酶（糖基化酶（glycosylasesglycosylases）能够切断脱氨碱）能够切断脱氨碱基、甲基化碱基和氧化碱基等非正常碱基与脱氧核基、甲基化碱基和氧化碱基等非正常碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，在糖之间的糖苷键，在DNADNA上产生一个无嘌呤上产生一个无嘌呤（apurinicapurinic）或无嘧啶（）或无嘧啶（apyrimidinicapyrimidinic）位点（）位点（APAP位点）。细胞胞内的位点）。细胞胞内的APAP核酸内切酶，附着在核酸内切酶，附着在APAP位点位点上，并在上，并在APAP位点的位点的5 5- -端切断磷酸二酯键，形成一端切断磷酸二酯键，形成一个游离的个游离的3 3OHOH末端。末端。DNADNA聚合酶聚合酶I I利用其利用其5 5-3-3外切酶活性切去外切酶活性切去APAP位点以及其下游的一段核苷酸序位点以及其下游的一段核苷酸序列，同时延伸列，同时延伸3 3-OH-OH末端填补缺口。最后的切口由末端填补缺口。最后的切口由DNADNA连接酶封闭。连接酶封闭。五、错配修复（五、错配修复（mismatch repairmismatch repair） DNADNA聚合酶的聚合酶的3 355外切酶活性可将错误掺入的外切酶活性可将错误掺入的核苷酸去除。聚合酶的这种校正功能将核苷酸去除。聚合酶的这种校正功能将DNADNA复制的忠复制的忠实度提高实度提高100100倍。然而，倍。然而，DNADNA聚合酶的校正作用并非聚合酶的校正作用并非绝对安全，有些错误插入的核苷酸会逃脱检测，并绝对安全，有些错误插入的核苷酸会逃脱检测，并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。在下一在新合成的链与模板链之间形成错误配对。在下一轮复制时错误插入的核苷酸将指导与其互补的核苷轮复制时错误插入的核苷酸将指导与其互补的核苷酸插入到新合成的链中，结果导致酸插入到新合成的链中，结果导致DNADNA序列中产生一序列中产生一个永久性改变。个永久性改变。由于复制中出现的错配碱基存在于子链中，因此该系由于复制中出现的错配碱基存在于子链中，因此该系统必须在复制叉通过之后有一种能够识别亲本链与子统必须在复制叉通过之后有一种能够识别亲本链与子链的方法，以保证只从子链中纠正错配的碱基。链的方法，以保证只从子链中纠正错配的碱基。 当新合成的当新合成的DNADNA链上出现错配的碱基对时，链上出现错配的碱基对时，2 2分子的分子的MutSMutS识识别并结合错配的碱基对。接着别并结合错配的碱基对。接着2 2分子的分子的MutLMutL蛋白结合到蛋白结合到MutSMutSDNADNA复合体上。复合体上。DNADNA分子通过分子通过MutSMutSMutLMutL复合体在两个方向上复合体在两个方向上的滑动形成一个回环。一旦遇到半甲基化的的滑动形成一个回环。一旦遇到半甲基化的GATCGATC序列，序列，MutSMutSMutLMutL便募集便募集MutHMutH。MutHMutH在子链在子链GATCGATC序列的序列的5 5端切断磷酸二端切断磷酸二酯键，产生一个酯键，产生一个3 3羟基末端和一个羟基末端和一个5 5磷酸末端磷酸末端(.pN-(.pN-3-OH + 3-OH + pGpApTpCpGpApTpC.).)。核酸外切酶在解旋酶（核酸外切酶在解旋酶（UvrDUvrD）及）及SsbSsb蛋白的协作下，从切口处蛋白的协作下，从切口处开始去除一段包括错配碱基在内的一段碱基序列。如果切口位开始去除一段包括错配碱基在内的一段碱基序列。如果切口位于错配位点的于错配位点的3 3端，此步骤由外切核酸酶端，此步骤由外切核酸酶I I负责完成。如果切负责完成。如果切口位于错配位点的口位于错配位点的5 5端，则由能够从端，则由能够从5 5至至3 3方向降解核酸方向降解核酸链的外切核酸酶链的外切核酸酶VIIVII或或RecJRecJ执行。最后，执行。最后，DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII和和DNADNA连连接酶根据亲本链的序列填补子链上被切除的部分，包括错配的接酶根据亲本链的序列填补子链上被切除的部分，包括错配的碱基。碱基。CH3GATCCTAGGTGATC53CTAG35GTCH3CH3GATCCTAGGTMutHMutSMutL切口切口CH3GATCCTAGGT53CH3GATC53CTAG35TGDNADNA解链酶解链酶 核酸外切酶核酸外切酶 SSBSSBdNMPsCH3GATCCTAGGT53DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA连接酶连接酶dNTPsCH3GATCCTAGGC3.2DNA错配修复的模型配修复的模型六、重组修复（六、重组修复（recombinationalrecombinational repair repair） 在讨论重组修复机制之前，有必要先分析一下胸在讨论重组修复机制之前，有必要先分析一下胸腺嘧啶二聚体对腺嘧啶二聚体对DNADNA复制的影响。当聚合酶复制的影响。当聚合酶IIIIII遇到遇到胸腺嘧啶二聚体时，会在二聚体位点停顿下来。胸腺嘧啶二聚体时，会在二聚体位点停顿下来。这这时，细胞会时，细胞会在二聚体的下游开始下一个冈崎片段的合在二聚体的下游开始下一个冈崎片段的合成，新生链在二聚体对应的位置上出现一个缺口。成，新生链在二聚体对应的位置上出现一个缺口。通过重组过程可填补新生链上的缺口。缺口可用图通过重组过程可填补新生链上的缺口。缺口可用图所示的所示的DNADNA重组方式填补：重组方式填补：受损受损DNADNA复制时，一条复制时，一条子代子代DNADNA分子在损伤的对应部位出现缺口。分子在损伤的对应部位出现缺口。另一条子代另一条子代DNADNA分子完整的母链与有缺口的子链分子完整的母链与有缺口的子链DNADNA进进行重组交换，母链行重组交换，母链DNADNA上相应的片段被用于填补子链上上相应的片段被用于填补子链上的缺口，而母链的缺口，而母链DNADNA出现又出现一个新的缺口。出现又出现一个新的缺口。母链母链上的缺口再以另一条子链上的缺口再以另一条子链DNADNA为模板，经为模板，经DNADNA聚合酶催化聚合酶催化合成一新合成一新DNADNA片段进行填补，最后由片段进行填补，最后由DNADNA连接酶连接，完连接酶连接，完成修补。成修补。 一个双链损伤变成两个单链损伤一个双链损伤变成两个单链损伤 重组修复并不能去除损伤，损伤仍然保留在原来的重组修复并不能去除损伤，损伤仍然保留在原来的位置。但是重组修复能使细胞完成位置。但是重组修复能使细胞完成DNADNA复制，并且新合复制，并且新合成的子链是完整的。经多次复制后，损伤就被成的子链是完整的。经多次复制后，损伤就被“冲淡冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNADNA的。的。重组修复机制对于细胞处理不易被修复或者不能被修重组修复机制对于细胞处理不易被修复或者不能被修复的损伤有着特殊的意义。复的损伤有着特殊的意义。Recombinational Repair (Post-Replication Repair)DNA replicationStructuraldistortionExcise patch from intact strand and insert in gapRepair gapExcision repair?(RecA)六、六、SOSSOS反应（反应（SOS responsesSOS responses）1.SOS1.SOS反应：反应：当当DNADNA受到严重损伤时，染色体的受到严重损伤时，染色体的DNADNA复制复制被抑制，进而诱导细胞产生被抑制，进而诱导细胞产生SOSSOS反应：大约反应：大约2020个参与个参与DNADNA损损伤修复和伤修复和DNADNA复制功能恢复的基因的表达水平升高，细胞复制功能恢复的基因的表达水平升高，细胞的的DNADNA修复能力得到加强，甚至出现修复能力得到加强，甚至出现DNADNA的跨损伤的跨损伤（tanslesiontanslesion synthesis synthesis）合成。）合成。2.LexA:2.LexA: 在正常的细胞内，在正常的细胞内，SOSSOS基因的诱导表达被阻遏蛋基因的诱导表达被阻遏蛋白白LexALexA抑制。抑制。LexALexA以二聚体的形式与以二聚体的形式与SOSSOS基因启动基因启动子区的子区的SOSSOS框（框（SOS boxSOS box，5 5-CTG-ten bases-CTG-ten bases-CAG-3CAG-3, , TACTGTATATATATACAGTA-3）结）结合阻遏了基因的转录起始。然而，此时细胞中的合阻遏了基因的转录起始。然而，此时细胞中的某些某些SOSSOS基因产物也维持在相当高的水平，这是因基因产物也维持在相当高的水平，这是因为有些基因具有另一个不受为有些基因具有另一个不受LexALexA调控的启动子，调控的启动子，或者基因的或者基因的SOSSOS框的碱基序列与一致序列的出入比框的碱基序列与一致序列的出入比较大，较大，LexALexA与之结合得不是十分牢固。与之结合得不是十分牢固。 3.SOS3.SOS反应的诱导：反应的诱导： 当当DNADNA受到严重损伤后，由于细胞内的切除修复受到严重损伤后，由于细胞内的切除修复和重组修复致使和重组修复致使DNADNA单链部分在细胞中积累。单链部分在细胞中积累。RecARecA蛋白因与单链蛋白因与单链DNADNA结合而被活化，活化后的结合而被活化，活化后的RecARecA蛋蛋白再与白再与LexALexA结合，引起结合，引起LexALexA的自切，解除的自切，解除LexALexA对对SOSSOS基因的阻遏作用。基因的阻遏作用。 4.SOS4.SOS基因：基因： 在在SOSSOS反应中，反应中，SOSSOS基因是按照一定的顺序被诱导表基因是按照一定的顺序被诱导表达的。达的。SOSSOS基因的表达时间由基因的表达时间由LexALexA与基因的与基因的SOSSOS框的亲框的亲和力决定。按照在和力决定。按照在SOSSOS反应中的表达时期，可以大致把反应中的表达时期，可以大致把SOSSOS基因分为基因分为3 3组。首先被诱导的组。首先被诱导的SOSSOS基因是一些参与单基因是一些参与单链损伤修复的基因（比如，链损伤修复的基因（比如，uvrAuvrA， uvrBuvrB，uvrDuvrD）或者）或者与损伤耐受性有关的基因（比如，与损伤耐受性有关的基因（比如，polBpolB）。编码）。编码LexALexA和和DinIDinI的基因也在这一时期被诱导表达。的基因也在这一时期被诱导表达。DinIDinI的功能的功能是延迟激活跨损伤的是延迟激活跨损伤的DNADNA合成。合成。 如果参与单链修复的基因不能帮助恢复正常的如果参与单链修复的基因不能帮助恢复正常的DNADNA合合成速度，参与重组修复的基因便被诱导表达，它们成速度，参与重组修复的基因便被诱导表达，它们包括包括recArecA和和recNrecN。如果出现大范围的。如果出现大范围的DNADNA损伤，依靠损伤，依靠提高重组修复的能力仍不能克服损伤对提高重组修复的能力仍不能克服损伤对DNADNA复制的抑复制的抑制作用，以制作用，以sfiAsfiA和和umuDCumuDC为代表的第为代表的第3 3组基因被激活。组基因被激活。umuDCumuDC操纵子被激活后细胞会进行操纵子被激活后细胞会进行DNADNA跨损伤复制。跨损伤复制。SfiASfiA的作用是抑制细胞的分裂。的作用是抑制细胞的分裂。如果如果DNADNA的复制速度的复制速度恢复到正常，这恢复到正常，这3 3类基因按照与激活相反的次序依次类基因按照与激活相反的次序依次被关闭。相反，如果细胞仍不能修复被关闭。相反，如果细胞仍不能修复DNADNA损伤，原噬损伤，原噬菌体被诱导裂解细胞。菌体被诱导裂解细胞。geneGene product/functionn. of copy/cellBasal levelSOS induced cellExpressed firstlexALexA/SOS repressor1,3001uvrAUvrABC excinuclease/excision repair20250uvrBUvrABC excinuclease/excision repair2501,000uvrDHelicase II/excision repair, fidelity of recombinational repair5,0008,00025,00065,000polBDNA polymerase II/translesion DNA synthesis40300ruvASubunit of RuvAB helicase/recombinational repair7005,600ruvBSubunit of RuvAB helicase/recombinational repair2001,600dinIInhibition of UmuD processing5002,300Expressed secondrecARecA coprotease, synaptase/SOS derepressor, recombinational repair1,00010,000100,000recNRecN/recombinational repair?Expressed lastsfiASfiA (SulA)/cell division inhibitor?umuDSubunit of UmuDC/translesion DNA synthesis1802,400umuCSubunit of UmuDC/translesion DNA synthesis02005. SOS5. SOS诱导突变诱导突变 umuC C和和umuD（UV-induced mutagenesis, UV-induced mutagenesis, umu），），它们属于同一个操纵子，转录方向是它们属于同一个操纵子，转录方向是D CD C。如上。如上所述，与其他所述，与其他SOSSOS基因一样，基因一样，umuCumuC和和umuDumuD基因在正常基因在正常情况下被情况下被LexALexA阻遏。当阻遏。当DNADNA受损受损、复制、复制受阻时，与单受阻时，与单链链DNADNA结合的结合的RecARecA不但促进不但促进LexALexA自体切割，同样也能自体切割，同样也能促进促进UmuDUmuD的自体切割，只是的自体切割，只是RecARecA促进促进UmuDUmuD切割的效切割的效率相当低，这就保证了率相当低，这就保证了UmuDUmuD在在SOSSOS反应的晚期才会发反应的晚期才会发生自体切割，形成生自体切割，形成UmuDUmuD。两分子。两分子UmuDUmuD与一分子与一分子的的UmuCUmuC组成的三聚体称为组成的三聚体称为DNADNA聚合酶聚合酶V V。在损伤位点，在损伤位点，DNADNA聚合酶聚合酶V V取代停顿下来的取代停顿下来的DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII复制复制DNADNA的损伤区。这种的损伤区。这种DNADNA聚合酶的一个重要性聚合酶的一个重要性质是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们向新生链质是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们向新生链的的3 3末端添加核苷酸时并不依赖碱基配对原则，因末端添加核苷酸时并不依赖碱基配对原则，因此此DNADNA聚合酶聚合酶V V又称为差错倾向聚合酶（又称为差错倾向聚合酶（error-prone error-prone polymerasepolymerase）。在损伤位点的另一侧，）。在损伤位点的另一侧，DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII迅速取代迅速取代DNADNA聚合酶聚合酶V V进行进行DNADNA合成。尽管这类合成。尽管这类DNADNA聚合聚合酶在进行跨损伤酶在进行跨损伤DNADNA合成时不遵循碱基配对原则，但合成时不遵循碱基配对原则，但是插入的核苷酸仍不是随机的。是插入的核苷酸仍不是随机的。