实验七实验七-1细胞荧光染色观察与荧光显微细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用镜的使用（示范：细胞形态观察与暗视（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）野显微镜的使用）实验目的与教学要求实验目的与教学要求1.掌握荧光显微镜的成像基本原理及其掌握荧光显微镜的成像基本原理及其使用；使用；2.掌握暗视野显微镜的成像基本原理及掌握暗视野显微镜的成像基本原理及其使用。其使用。荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。一、荧光显微镜的成像原理一、荧光显微镜的成像原理什么是荧光什么是荧光 ? ?n物质中的电子吸收光的能量由低能状物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。释放出的光。n即：物质吸收短波光，发射出的长波即：物质吸收短波光，发射出的长波光。光。保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光的性质荧光的性质优点：优点：检出能力高检出能力高对细胞的刺激小对细胞的刺激小能进行多重染色能进行多重染色用途：用途：物体构造的观察物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途荧光素的特性光素的特性1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究。量研究。2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用二、暗视野显微镜的成像原理二、暗视野显微镜的成像原理通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到样品上，由样品表面的绕射光线入射射到样品上，由样品表面的绕射光线入射到物镜内，产生样品的衍射图象。到物镜内，产生样品的衍射图象。三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙、洋葱、人正常肝青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝切片和脂肪肝组织切片切片HE染色）染色）甲醇、甲醇、1 丫丫啶橙、橙、滤纸、吸管、吸管、载玻片玻片荧光光显微微镜、暗、暗视野野显微微镜、普通光学、普通光学显微微镜四、实验内容和实验步骤四、实验内容和实验步骤1.蛙血蛙血细胞染色胞染色观察：取少察：取少许蛙血蛙血 常常规血涂片血涂片 凉干凉干 甲醇固定甲醇固定10 min 1 丫丫啶橙染色橙染色5 min 水洗水洗 室室温干燥温干燥滤纸擦干玻片底面）擦干玻片底面） 荧光光显微微镜观察先低倍察先低倍后高倍后高倍观察）察） （可在同一玻片上（可在同一玻片上观察未察未荧光染色的血光染色的血细胞）胞）2.取洋葱取洋葱撕取一小片内表皮撕取一小片内表皮平面平面单层铺展于玻片上展于玻片上室温室温凉干凉干1丫丫啶橙染色橙染色5min 水洗用吸管，小心掉片）水洗用吸管，小心掉片） 室温干燥或用室温干燥或用滤纸擦干）擦干） 荧光光显微微镜观察察3.暗暗视野野显微微镜观察蛙血察蛙血细胞示范）胞示范）4.观察人正常肝察人正常肝组织切片和脂肪肝切片和脂肪肝组织切片切片HE染色）染色）1.荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。察。2.使用荧光显微镜时要注意不要直接观察使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。激发光源，保护眼睛。3.暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。观察。 五、本卷须知五、本卷须知六、作业与思考题：六、作业与思考题：描述在荧光显微镜下所观察到的描述在荧光显微镜下所观察到的实验现象。实验现象。绘图比较人正常肝组织细胞和脂绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝组织细胞。肪肝组织细胞。实验七实验七-2 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用应用 实验目的与要求实验目的与要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。原理及其在生命科学中的应用。Laser Scanning Confocal Microscope1.普通普通荧光光显微微镜的不足的不足2. 使用使用荧光物光物质标记细胞中的特定成分或胞中的特定成分或结构，构，不不仅图像与像与对比度增比度增强，而且由于，而且由于许多多荧光光显微微镜的光源使用短波的光源使用短波长的紫外光，大大提高了的紫外光，大大提高了分分辩率率=0.61 / NA ）。但当所）。但当所观察的察的荧光光标本稍厚本稍厚时，普通，普通荧光光显微微镜不不仅接收焦平面上接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物光也被物镜接收，接收，这些来自焦平面以外的些来自焦平面以外的荧光光使使观察到的察到的图像反差和分辨率大大降低即焦像反差和分辨率大大降低即焦平面以外的平面以外的荧光光结构模糊、构模糊、发虚，原因是大多虚，原因是大多数生物学数生物学标本是本是层次区次区别的重叠的重叠结构）。构）。一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。Confocal Principle每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把切片。把X-Y平面焦平面扫描与平面焦平面扫描与Z轴光轴轴光轴扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。图像。观察方式：以荧光为主观察方式：以荧光为主光源：激光紫外、可见光、近红外）光源：激光紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察多重染色样品的观察LSCM的基本特点3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、细胞结构、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞骨架蛋白等基因表达产物）、骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等等细胞膜流动性荧光光漂白恢复技术）细胞膜流动性荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度变化细胞内钙离子浓度变化膜电位膜电位三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 DAPI 、甘油、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载封片剂、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜四、实验步骤四、实验步骤取涂有细胞的载玻片细胞涂在中间），冷丙取涂有细胞的载玻片细胞涂在中间），冷丙酮酮40C固定固定10 min;PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室温孵育室温孵育30 min; PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片剂封片剂(pH8.5，PBS:甘油甘油=1:9，v/v)封片封片;激光扫描共聚焦显微镜观察。激光扫描共聚焦显微镜观察。五、本卷须知五、本卷须知注意染色时间注意染色时间注意避光注意避光六、作业与思考题：六、作业与思考题：试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描述实验中所观察的现象原理，并描述实验中所观察的现象思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什么比普通的荧光显微镜到的图象为什么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？的清晰度、层次感要强许多？