第十七章高效液相色第十七章高效液相色谱谱分析分析17.1 概述概述17.2 HPLC仪器仪器 包包括括：高高压压输输液液装装置置; 进进样样系系统统; 分分离离系系统统; 检检测测系系统统;辅辅助系统助系统17.3 流动相和固定相简介流动相和固定相简介17.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 分分配配色色谱谱、吸吸附附色色谱谱、离离子子交交换换色色谱谱、尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱和和亲和色谱亲和色谱17.1 概述概述 高高效效液液相相色色谱谱(HPLC)是是以以溶溶剂剂液液体体为为流流动动相相的的色色谱谱方方法法。按按照照固固定定相相不不同同可可分分为为：液液液液分分配配色色谱谱；吸吸附附色色谱谱(液液固固色色谱谱)；离离子子交交换换色色谱谱；尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱(凝凝胶胶渗渗透透色色谱谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱薄层色谱)等。等。 早早期期液液相相色色谱谱，包包括括Tswett的的工工作作，都都是是在在直直径径15cm, 长长50500cm的的玻玻璃璃柱柱中中进进行行的的。为为保保证证有有一一定定的的柱柱流流速速，填填充充的的固固定定相相颗颗粒粒直直径径多多在在150200 m范范围围内内。即使这样，流速仍然很低即使这样，流速仍然很低(7时，该检测器不够灵敏。时，该检测器不够灵敏。其其 它它 检检 测测 器器 还还 包包 括括 ： MS、 IR、 Evaporative light scattering detector(光散射光散射)、极谱等。、极谱等。17.3 HPLC流动相和固定相简介流动相和固定相简介一、固定相载体一、固定相载体 由由于于各各种种HPLC分分离离方方法法的的流流动动相相均均为为液液体体，因因此此，HPLC通通常常是是按按照照固固定定相相载载体体或或固固定定液液的的不不同同来来分类的。分类的。1. 按承受压力按承受压力分分刚性固体刚性固体：SiO2为基质，耐压为为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱吸附、分配和键合色谱；硬硬 胶胶：以以聚聚合合物物为为基基质质(常常用用苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯苯苯交交联联而而成成)，耐耐压压上上限限为为3.5 108 Pa, 主主要要用用于于离离子子交交换换和和尺寸排阻色谱。尺寸排阻色谱。2. 按孔隙深度按孔隙深度分分表表面面多多孔孔型型：以以实实心心玻玻璃璃珠珠为为基基体体，在在基基体体表表面面覆覆盖盖一一层层多多孔孔活活性性材材料料(如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、离离子子交交换换剂剂、分分子子筛筛、聚聚酰酰胺胺等等)。表表面面多多孔孔型型固固定定相相的的颗颗粒粒大大(易易装装柱柱)、多多孔孔层层厚厚度度小小且且孔孔浅浅(渗渗透透性性好好，出出峰峰快快)；但但交交换容量小。适于常规分离分析。换容量小。适于常规分离分析。全全多多孔孔型型：全全部部由由硅硅胶胶或或氧氧化化铝铝微微粒粒聚聚集集而而成成，因因颗颗粒粒极极细细，因因而而孔孔径径小小、传传质质快快、 柱柱效效高高。特特别别适适于于复复杂混合物的分离。杂混合物的分离。二、流二、流动相相 与与GC流流动相不同，相不同，HPLC流流动相相为溶溶剂，它既有，它既有运运载作用，又和固定相一作用，又和固定相一样，参与，参与对组分的分的竞争，争，因此溶因此溶剂的的选择对分离十分重要。分离十分重要。 液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，离状况；亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。液液色谱法，极性柱也称正相柱。 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2 溶溶剂的特性参数的特性参数主要包括溶主要包括溶剂强度参数、溶解度参数和极性参数等，度参数、溶解度参数和极性参数等，具体具体见P357表表17.21 对流动相的要求对流动相的要求1）对待测物具一定极性和选择性；）对待测物具一定极性和选择性；2）使用）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么为什么？) ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；加；4）化学稳定性好；）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。1）、溶剂强度）、溶剂强度 在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而在吸附色谱中，通常固定相是极性的硅胶或氧化铝，而溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强溶剂是非极性的，或含有极性溶剂的混合溶剂。采用溶剂强度度0将溶剂排队，一般定义正戊烷的将溶剂排队，一般定义正戊烷的0为零，其它的见表。为零，其它的见表。0越大越大-溶剂极性越大溶剂极性越大-k越小。越小。2）、溶解度参数）、溶解度参数 在分配色谱中（例如为反相色谱），固定相是非极性的，在分配色谱中（例如为反相色谱），固定相是非极性的，溶剂是极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成溶剂是极性的，溶剂的作用更大，溶剂强度与溶剂的极性成反比。反比。 溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数更好地代表溶剂的极性。溶解度参数由四个部分组成溶解度参数由四个部分组成 = d + 0 + a + h其中：其中： d - -色散力色散力 o-偶极矩偶极矩 a , h -质子子给予、接受的一种量度予、接受的一种量度3)、选择性参数性参数 P= log(Kg)e+log(Kg)d+log(Kg)n P-极性参数极性参数 Kg-与溶与溶剂汽化自由能成比例的极性分布系数。它汽化自由能成比例的极性分布系数。它分分别根据乙醇（根据乙醇（e）二噁）二噁烷（d）和硝基甲）和硝基甲烷（n）中的数据中的数据计算。算。选择性参数性参数 xe= log(Kg)e/P xd = log(Kg)d/P xn = log(Kg)n/P 根据溶根据溶剂强度和极性参数分度和极性参数分类、排、排队，只代表，只代表k值，对于于难分离物分离物质对，要根据溶，要根据溶质与溶与溶剂之之间的特殊的特殊作用才能分离。作用才能分离。 每种溶每种溶剂可以得到可以得到xe、xd、和、和xn三个数据，根据三个数据，根据数数值在三角形平面坐在三角形平面坐标上找所在位置。位置不同分上找所在位置。位置不同分成八个区域，每个区域的溶成八个区域，每个区域的溶剂有有类似的性似的性质。见P359图17.113、流、流动相相选择 在在选择溶溶剂时，溶，溶剂的极性是的极性是选择的重要依据。的重要依据。 采用正相液采用正相液-液分配分离液分配分离时：首先：首先选择中等极性溶中等极性溶剂，若，若组分的保留分的保留时间太短，降低溶太短，降低溶剂极性，反极性，反之增加。之增加。 也可在低极性溶也可在低极性溶剂中，逐中，逐渐增加其中的极性溶增加其中的极性溶剂，使保留使保留时间缩短。短。常用溶常用溶剂的极性的极性顺序：序： 水水(最大最大) 甲甲酰胺胺 乙乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮 二氧六二氧六环 四四氢呋喃喃 甲乙甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酸乙乙酯 乙乙醚 异丙异丙醚 二二氯甲甲烷氯仿仿溴乙溴乙烷苯苯四四氯化碳化碳二硫化碳二硫化碳环己己烷己己烷煤油煤油(最小最小)17.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 按按分分离离原原理理可可将将HPLC分分为为分分配配色色谱谱、吸吸附附色色谱谱、离离子子交交换换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。一、分配色谱一、分配色谱1. 原理原理： 根根据据各各待待测测物物在在互互不不相相溶溶的的两两溶溶液液中中的的溶溶解解度度不不同同，因因而而具具有有不不同同的的分分配配系系数数。在在色色谱谱柱柱中中，随随着着流流动动相相的的移移动动，这这种种分分配配平平衡衡需需进进行行多多次次，造造成成各各待待测测物物的的迁迁移移速速率率不不同同，从从而而实实现现分分离离的过程。的过程。2. 流动相流动相: HPLC分分析析中中，为为防防止止固固定定相相的的流流失失，流流动动相相与与固固定定液液应应尽尽量量不不互互溶溶，或或者者说说二二者者的的极极性性相相差差越越大大越越好好。因因此此，根根据据流流动动相相与与固固定定相相极极性性的的差差别别程程度度，可可将将液液液液色色谱谱分分为为正正相相分分配配色色谱谱（流流动动相相极极性性小小于于固固定定相相极极性性，极极性性小小的的先先流流出出，适适于于极极性性组组分分分分离离）和和反反相相分分配配色色谱谱（流流动动相相极极性性大大于于固固定定相相极极性性，极极性性大大的的先先流流出出，适于非极性组分分离）。适于非极性组分分离）。正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系3. 固定相固定相 原原则则上上，用用于于GC的的固固定定相相也也可可用用于于HPLC作作固固定定相相。但但HPLC固固定定液液易易流流失失，因因此此常常用用的的只只有有几几种种，按按极极性性由由高高到到低低为为： , -氧氧二二丙丙腈腈(ODPN)、聚聚乙乙二二醇醇(PEM)、三三甲甲撑撑二二醇醇(TMG)、十十八八烷烷(C18)、角鲨烷角鲨烷(SQ)。 根根据据涂涂渍渍方方法法的的不不同同，可可将将固固定定相相分分为为机机械械涂涂渍渍型型和和化化学学键键合合型型，后者应用更为广泛。后者应用更为广泛。1）机机械械涂涂渍渍固固定定相相：将将固固定定液液通通过过机机械械混混合合的的方方法法涂涂渍渍到到表表面面多多孔孔型型(0.5-1.5%涂涂布布量量)或或全全多多孔孔型型载载体体(5-10%涂涂布布量量)上上形形成成的的液液液液色色谱谱固固定定相相。该该种种固固定定相相最最大大的的不不足足是是固固定定液液易易流流失失、分分离离稳稳定定性性及及重重现性差，不适合梯度淋洗。现性差，不适合梯度淋洗。 为为减减少少固固定定液液的的流流失失，通通常常在在柱柱前前加加一一根根很很短短的的前前置置柱柱，该该柱柱涂涂有有与与分分析析柱柱相相同同但但有有更更高高含含量量的的固固定定液液，使使流流动动相相进进入入分分析析柱柱之之前前，预先被固定液饱和。预先被固定液饱和。2）化学键合固定相）化学键合固定相 化化学学键键合合固固定定相相是是通通过过化化学学反反应应将将有有机机分分子子键键合合在在载载体体表表面面所所形形成成的的柱柱填填充充剂剂，具具有有稳稳定定、流流失失小小、适适于于梯梯度度淋淋洗洗等等特特点点。这这种种固固定定相相分分离离机机理理既既不不是是简简单单的的吸吸附附，也也不不是是单单一一的的液液液液分分配配，而而是是二二者者兼兼而而有有之之。化化学学键键合合的的表表面面覆覆盖盖度度决决定定哪哪种种机机理理起起主主要要作作用用。对对多多数数键键合合相相来来说说，以以分配机理分配机理为主。为主。 通通常常，化化学学键键合合相相的的载载体体主主要要是是硅硅胶胶（表表面面有有硅硅醇醇基基）。二、化学二、化学键合相色合相色谱法（法（CBPC） 采用化学采用化学键合相的液相色合相的液相色谱称称为化学化学键合相色合相色谱法，法，简称称键合相色合相色谱。由于。由于键合固定相非常合固定相非常稳定，在使用中不易流失，定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子适用于分离容量因子k值范范围宽的的样品。由于品。由于键合到合到载体表面的官能体表面的官能团可以是各种极性的，因此可以是各种极性的，因此它适用于种它适用于种类繁多繁多样品的分离。品的分离。1键合固定相合固定相类型型 用来制用来制备键合固定相的合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基的硅醇基(Si一一OH)与有机分子成与有机分子成键,即可得到各种性能的固定即可得到各种性能的固定相。一般可分三相。一般可分三类（1）疏水基疏水基团 如不同如不同链长的的烷烃（C8和和C18）和苯基等）和苯基等（2）极性基极性基团 如氨丙基，如氨丙基，氰乙基、乙基、醚和醇等。和醇等。（3）离子交离子交换基基团 如作如作为阴离子交阴离子交换基基团的胺基，季的胺基，季铵盐,作作为阳离子交阳离子交换 基基团的磺酸等。的磺酸等。时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。2键合固定相的制合固定相的制备（1）硅酸硅酸酯（Si一一OR）键合固定相合固定相,它是最先用它是最先用于液相色于液相色谱的的键合固定相。用醇与硅醇基合固定相。用醇与硅醇基发生生酯化反化反应： SiOHROHSiORH20 由于由于这类键合固定相的有机表面是一些合固定相的有机表面是一些单体，具体，具有良好的有良好的传质特性特性,但但这些些酯化化过的硅胶填料易水的硅胶填料易水解且受解且受热不不稳定，因此定，因此仅适用于不含水或醇的流适用于不含水或醇的流动相。相。 共共价价键健健合合固固定定相相不不易易水水解解，并并且且热稳定定较硅硅酸酸酯好好。缺缺点点是是格格氏氏反反应不不方方便便；当当使使用用水水溶溶液液时，必必须限制限制pH在在48范范围内。内。（2）SiC或或Si一一N共价共价 键合固定相，制备反应：键合固定相，制备反应： （3）硅）硅烷化（化（SiOSiC）键合固定相合固定相制制备反反应： 这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在点。能在70以下，以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛范围内正常工作，应用较广泛. 3. 正相和反相正相和反相键合色合色谱法法4.离子型离子型键合相色合相色谱法法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基基质，化学，化学键合各合各种离子交种离子交换基基团，如一，如一SO3H 一一CH2NH2、COOH、一一CH2N(CH3) Cl等等时，就形成了离子性，就形成了离子性键合相色合相色谱的的固定相；流固定相；流动相一般采用相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子冲溶液。其分离原理与离子交交换色色谱类同。同。 三、液一固吸附色三、液一固吸附色谱法法(LSAC) 液一固吸附色液一固吸附色谱是以是以固体吸附固体吸附剂作作为固定相，吸附固定相，吸附剂通常是些多孔的固体通常是些多孔的固体颗粒物粒物质，在它，在它们的表面存在吸附中的表面存在吸附中心。液固色心。液固色谱实质是根据物是根据物质在固定相上的吸附作用不同在固定相上的吸附作用不同来来进行分离的。行分离的。1分离原理分离原理 当流当流动相通相通过固定相（吸附固定相（吸附剂）时，吸附，吸附剂表面的活表面的活性中心就要吸附流性中心就要吸附流动相分子。同相分子。同时，当，当试样分子（分子（X）被）被流流动相相带入柱内，只要它入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流要取代数目相当的已被吸附的流动相溶相溶剂分用）于是，在分用）于是，在固定相表面固定相表面发生生竞争吸附争吸附: X + nSad = Xad + nS达平衡时,有 其中其中Kad为吸附平衡常数为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。难于洗脱。Kad值小值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。值可通过吸附等温线数据求出。 2固定相固定相 吸附色吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性所用固定相多是一些吸附活性强弱不等弱不等的吸附的吸附剂，如硅胶、氧化，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的、聚酸胶等。由于硅胶的优点点较多，如多，如线性容量性容量较高，机械性能好，不溶高，机械性能好，不溶胀，与大多数与大多数试样不不发生化学反生化学反应等，因此，以硅胶用得等，因此，以硅胶用得最多。最多。 在高效液相色在高效液相色谱法中，法中，表面多孔型表面多孔型和和全多孔型全多孔型都都可作吸附色可作吸附色谱中的固定相，它中的固定相，它们具有填料均匀、粒度具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于型由于试样容量容量较小，目前最广泛使用的小，目前最广泛使用的还是全多孔是全多孔型微粒填料。型微粒填料。3、流、流动相相 一般把吸附色一般把吸附色谱中流中流动相称作相称作洗脱洗脱剂。在吸附。在吸附色色谱中中对极性大的极性大的试样往往采用极性往往采用极性强的洗脱的洗脱剂；对极性弱的极性弱的试样宜用极性弱的洗脱宜用极性弱的洗脱剂。洗脱。洗脱剂的极性的极性强弱可用溶弱可用溶剂强度参数（度参数（ 0 ）来衡量。）来衡量。 0越大，表示越大，表示洗脱洗脱剂的极性越的极性越强。表表17-4列出一些常用溶列出一些常用溶剂在氧化在氧化铝吸附吸附剂中的中的0值。在硅胶吸附。在硅胶吸附剂中中0值的的顺序相同，序相同，数数值可可换算（算（0硅胶硅胶=0770氧化氧化铝）。）。 (四）离子交四）离子交换色色谱法（法（IEC） 此法是利用离子交此法是利用离子交换原理和液相色原理和液相色谱技技术的的结合来合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能析方法。凡在溶液中能够电离的物离的物质，通常都可，通常都可用离子交用离子交换色色谱法法进行分离。它不行分离。它不仅适用无机离适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，等生物大分子。因此，应用范用范围较广。广。 1离子交离子交换原理原理 离子交离子交换色色谱法是利用不同待法是利用不同待测离子离子对固定相固定相亲和力的和力的差差别来来实现分离的。其固定相采用分离的。其固定相采用离子交离子交换树脂脂，树脂上脂上分布有固定的分布有固定的带电荷基荷基团和可游离的平衡离子。当待分析和可游离的平衡离子。当待分析物物质电离后离后产生的离子可与生的离子可与树脂上可游离的平衡离子脂上可游离的平衡离子进行行可逆交可逆交换，其交，其交换反反应通式如下：通式如下：阳离子交阳离子交换： 阴离子交换：阴离子交换： 一般形式：一般形式： R一一AB RBA达平衡达平衡时，以，以浓度表示的平衡常数（离子交度表示的平衡常数（离子交换反反应的的选择系数）：系数）： 式中式中Ar，Br 分分别代表代表树脂相中洗脱脂相中洗脱剂离子（离子（A）和和试样离子（离子（B）的）的浓度，度，A、B则代表它代表它们在溶在溶液中的液中的浓度。离子交度。离子交换反反应的的选择性系数性系数见从表示从表示试样离子离子B对于于A型型树脂脂亲和力的大小：和力的大小：KB/A越越大大，说明明B离子交离子交换能力越能力越大大，越易保留而，越易保留而难于洗脱。一般于洗脱。一般说来，来，B离子离子电荷越荷越大大，水合离子半径越，水合离子半径越小小，KB/A值就越就越大大。 对于典型的磺酸型阳离子交于典型的磺酸型阳离子交换树脂，脂，一价离子的一价离子的KB/A值按以下按以下顺序：序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的二价离子的顺序序为：Ba 2+Pb 2+Sr 2+Ca 2+Cd 2+Cu 2+，Zn 2+Mg 2+对于季胺型于季胺型强碱阴离子交碱阴离子交换树指，各阴离子的指，各阴离子的选择性性顺序序为： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相固定相 作作为固定相的离子交固定相的离子交换剂，其基，其基质大致有三大大致有三大类：合成合成树脂脂（聚苯乙（聚苯乙烯）、）、纤维素素和和硅胶硅胶。而离子交。而离子交换剂又有又有阳离阳离子子和和阴离子阴离子之分。再根据官能基的之分。再根据官能基的离解度大小离解度大小还有有强弱之弱之分分按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。1）多孔型）多孔型： 聚聚苯苯乙乙烯烯+二二乙乙烯烯苯苯交交联联，分分微微孔孔型型和和大大孔孔型型。交交换换基基团团多多交交换换容容量量大大，稳稳定定。但但易易溶溶胀胀，传传质质慢慢、柱柱效低、分析速度慢。效低、分析速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+树脂薄层树脂薄层(1-2 m) 多多孔孔型型=惰惰性性核核+硅硅胶胶微微球球+树树脂脂薄薄层。层。 克克服服了了多多孔孔型型离离子子交交换换树树脂脂的的不不足，但交换容量低，柱子易超负荷。足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离离子子交交换换键键合合相相：利利用用化化学学反反应应将将离离子子交交换换基基团团键键合合到到惰惰性性载载体体表表面面。载载体体可可以以是是薄薄壳壳玻玻珠珠，也也可可以以是是多多孔孔硅硅胶胶微微粒粒。使使用用后后者者为为载载体体，可可得得到到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆3. 流动相流动相 离离子子交交换换色色谱谱流流动动相相为为盐盐类类缓缓冲冲溶溶液液(有有一一定定pH和和离离子子强强度度) ，通通过过改改变变pH、缓缓冲冲剂剂类类型型、离离子子强强度度、加加入入有有机机试试剂剂和和配配位位剂剂等等条条件件来来控控制制分分配配比比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值值：影影响响酸酸或或碱碱的的离离解解平平衡衡，控控制制组组分分离离子子形形式式所所占占的的分分数数。当当组组分分以以分分子子形形式式存存在在时时，则则不不被被保保留留；离离子子分分数数越越高高，保保留留值值越越大大。常常用用的的有有柠柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离离子子强强度度I：对对保保留留值值的的影影响响比比pH更更大大。组组分分保保留留值值受受流流动动相相中中盐盐类类总总浓浓度度控控制制。增增加加外外加加阴阴或或阳阳离离子子将将增增加加它它们们对对R+或或R-的的竞竞争争能能力力，使使组组分分保保留留值值减减小小。通通过过加加入入不不同同种种类类的的盐盐，可可影影响响柱柱的的选选择择性性，因因为为不不同同物物质质对交换剂的亲和能力不同。对交换剂的亲和能力不同。有有机机溶溶剂剂：外外加加有有机机溶溶剂剂通通常常减减小小组组分分的的保保留留值值。其其极极性性越越小小，保保留留值值越越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量：当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。五、离子色五、离子色谱法（法（IC） 离离子子色色谱法法是是由由离离子子交交换色色谱法法派派生生出出来来的的一一种种分分离离方方法法。由由于于离离子子交交换色色谱法法在在无无机机离离子子的的分分析析和和应用用受受到到限制。限制。 为了了解解决决这一一问题，1975年年Small等等人人提提出出一一种种能能同同时测定定多多种种无无机机和和有有机机离离子子的的新新技技术。他他们在在离离子子交交换分分离离柱柱后后加加一一根根抑抑制制柱柱，抑抑制制柱柱中中装装填填与与分分离离柱柱电荷荷相相反反的的离离子子交交换树脂脂。通通过分分离离柱柱后后的的样品品再再经过抑抑制制柱柱，使使具具有有高高背背景景电导的的流流动相相转变成成低低背背景景电导的的流流动相相，从从而而用用电导检测器器可可直直接接检测各各种种离离子子的的含含量量。这种种色色谱技技术称称为离离子子色色谱。若若样品品为阳阳离离子子，用用无无机机酸酸作作流流动相相，抑抑制制柱柱为高高容容量量的的强碱碱性性阴阴离离子子交交换剂。当当试样经阳阳离离子子交交换剂的的分分离离往往后后，随随流流动相相进入入抑抑制制柱柱，在在抑抑制制柱柱中中发生生两个重要反两个重要反应： R+OH-H+Cl- R+Cl十十H2O R+一一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反由反应可可见：经抑制柱后，一方面将大量酸抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，很小的水，消除了流消除了流动相本底相本底电导的影响。同的影响。同时，又将，又将样品阳离子品阳离子M+转变成相成相应的碱，由于的碱，由于OH-离子的淌度离子的淌度为Cl-离子的离子的26倍，提高了所倍，提高了所测阳离阳离子子电导的的检测灵敏度。灵敏度。对于阴离子于阴离子样品也有相似的作用机理。品也有相似的作用机理。 该法法的的不不足足之之处在在于于：抑抑制制柱柱要要定定期期再再生生、谱峰峰在在经过抑抑制制柱柱后后会会展展宽，降降低低分分离离度度。因因此此有有人人提提出出了了使使用用电导率率很很低低的的溶溶液液(如如苯苯甲甲酸酸盐稀溶液稀溶液)作流作流动相。相。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称亦称为抑制型离子色抑制型离子色谱或称双或称双柱离子色柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通在通过抑制柱后会抑制柱后会加加宽，降低了分离度。后来，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了体系，而采用了电导率极低的溶液，例如率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸苯甲酸盐或或邻苯二甲酸苯二甲酸盐的稀溶液作流的稀溶液作流动相，称相，称为非抑制型非抑制型离子色离子色谱或或单柱离子色柱离子色谱。六、离子对色谱法（六、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离离子对色谱主要用来分离强极性强极性有机酸和有机碱。有机酸和有机碱。1. 原原理理：将将与与待待测测物物离离子子A电电荷荷相相反反的的离离子子B（称称为为对对离离子子或或反反离离子子）加加入入到到流流动动相相（常常为为有有机机相相）中中，使使待待测测离离子子A与与对对离离子子B形形成成离离子子对对AB，该该AB离离子子对对的的性性质质与与A离离子子或或B离离子子的的性性质质不不同同，即即间间接接改改变了待测离子的保留特性。变了待测离子的保留特性。例例如如：固固定定相相为为非非极极性性键键合合相相，流流动动相相为为水水溶溶液液，于于流流动动相相中中加加入入与待测离子与待测离子A-有相反电荷的离子有相反电荷的离子B+： 由由于于离离子子对对AB具具有有疏疏水水性性，因因而而被被非非极极性性固固定定相相提提取取。其其它它待待测测离离子子A1，A2，A3.因因与与B离离子子间间的的成成对对能能力力不不同同，而而形形成成不不同同疏疏水水性性的的离离子子对对，使使得得各各待待测测物物在在柱柱内内的的保保留留值值不不同同，从从而而达达到到分分离的目的。离的目的。2键合相反相离子合相反相离子对色色谱法法 离子离子对色色谱法法类型很多，根据流型很多，根据流动相和固定相的极性可分相和固定相的极性可分为反相反相离子离子对和和正相正相离于离于对色色谱法。其中以法。其中以键合反相合反相离子离子对色色谱法最重要。法最重要。这种色种色谱法的固定相采用法的固定相采用非极性非极性的的疏水疏水键合合相如十八相如十八烷基基键合相（合相（ODS）等，流）等，流动相相为加有加有平衡离平衡离子（反离子）子（反离子）的的极性极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。 根据离子根据离子对生成反生成反应式，平衡常数式，平衡常数 KAB可表示可表示为 根据定义，溶质的分配系数根据定义，溶质的分配系数 根据上两式，有根据上两式，有式中式中为相比率。容量因子相比率。容量因子k随随KAB和和B+水相的增大水相的增大而增大。而增大。 键合相反相离子合相反相离子对色色谱法操作法操作简便，只要改便，只要改变流流动相的相的pH值、平衡离子的、平衡离子的浓度和种度和种类，就可在，就可在较大范大范围内改内改变分离的分离的选择性，能性，能较好解决好解决难分离混合物的分离混合物的分离分离问题。此法。此法发展迅速，展迅速，应用用较广泛广泛.（七）尺寸排阻色（七）尺寸排阻色谱法（法（SEC）尺寸排阻色尺寸排阻色谱法又称法又称凝胶色凝胶色谱法法，主要用于，主要用于较大分子大分子的分离。的分离。与其他液相色与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交子交换作用机理，而是基于作用机理，而是基于试样分子的尺寸分子的尺寸和和形状形状不同来不同来实现分离的。分离的。尺寸排阻色尺寸排阻色谱被广泛被广泛应用于用于大分子的分析大分子的分析，即用来分析大分子，即用来分析大分子物物质相相对分子分子质量的分布。它具有其他液相色量的分布。它具有其他液相色谱所没有的所没有的特点：特点：(1) 保留保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些构的某些信息。信息。(2) 保留保留时间短，短，谱峰窄，易峰窄，易检测，可采用灵敏度，可采用灵敏度较低的低的检测器器(3) 固定相与分子固定相与分子间作用力极弱，作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命保留分子，因此柱寿命长。(4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子分子质量差量差别必必须大于大于10才能得以分离。才能得以分离。1分离原理分离原理 尺寸排阻色尺寸排阻色谱是按分子大小是按分子大小顺序序进行分离的一种行分离的一种色色谱方法。其固定相方法。其固定相为化学情性多孔物化学情性多孔物质凝胶，凝胶，它它类似于分子似于分子筛，但孔径比分子，但孔径比分子筛大。凝胶内具有大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体早地被淋洗出来；中等体积的分子的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。后由柱中流出。2. 固定相固定相3流动相流动相流流动动相相的的要要求求：能能溶溶解解样样品品且且与与凝凝胶胶相相似似(润润湿湿凝凝胶胶)、粘度小粘度小(增加扩散速度增加扩散速度)。以以水溶液水溶液为流动相的凝胶色谱适用于为流动相的凝胶色谱适用于水溶性水溶性样品样品以以有机溶剂有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性非水溶性样品。样品。 八、亲和色谱八、亲和色谱 主主要要用用于于生生物物大大分分子子与与固固定定相相之之间间的的特特异异亲亲合合力力进进行行选择性分离及纯化的方法。选择性分离及纯化的方法。分分离离原原理理：于于载载体体表表面面先先键键合合具具有有一一般般反反应应性性能能的的环环氧氧或或联联氨氨（称称为为间间隔隔臂臂），然然后后再再连连接接上上配配基基，如如酶酶、抗抗原原或或激素。激素。 当当含含有有复复杂杂混混合合试试样样的的流流动动相相流流经经这这种种经经固固定定化化的的配配基基时时，其其中中具具有有亲亲和和力力特特性性的的生生物物大大分分子子与与配配基基相相互互作作用用而而被被保保留留，无无此此作作用用的的则则被被洗洗出出；随随后后，改改变变流流动动相相pH或或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点特点：选择性过滤、纯化效果好。：选择性过滤、纯化效果好。九、分离类型的选择九、分离类型的选择 1 1根据相对分子质量选择根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是色谱）最适合的相对分子质量范围是20O20O20002000。对于相对。对于相对分子质量大于分子质量大于20002000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。的样品，则用尺寸排阻法为最佳。 2 2根据溶解度选择根据溶解度选择 弄弄清清样样品品在在水水、异异辛辛烷烷、苯苯、四四氯氯化化碳碳、异异丙丙醇醇中中的的溶溶解解度度是是很很有有用用的的。如如果果样样品品可可溶溶于于水水井井属属于于能能离离解解物物质质，以以采采用用离离子子交交换换色色谱谱为为佳佳；如如样样品品可可溶溶于于烃烃类类（如如苯苯或或异异辛辛烷烷），则则可可采采用用液液一一固固吸吸附附色色谱谱；如如样样品品溶溶解解于于四四氯氯化化碳碳，则则多多采采用用常常规规的的分分配配和和吸吸附附色色谱谱分分离离；如如样样品品既既溶溶于于水水又又溶溶于于异异丙丙醇醇时时，常常用用水水和和异异丙丙醇醇的的混混合合液液作作液液一一液液分分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。