发酵过程优化与控制发酵过程优化与控制发酵发酵狭义厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。广义微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。发酵是一个很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素： 菌种性能、培养基组成、原料质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等菌种生产性能越高，其生产条件越难满足。发酵过程技术原理发酵过程技术原理分批发酵分批发酵补料补料-分批发酵分批发酵半连续发酵半连续发酵连续发酵连续发酵分批发酵分批发酵几个重要参数：几个重要参数：为比生长速率,h-1；-qs 为比基质消耗速率,(g/g)/h；qp 为比产物形成速率,(g/g)/h 。生长周期：工业生产从发酵产率和发酵指数及避免染菌考虑，要尽量缩短适应期。对数生长期max最大，其长短取决于培养基，包括溶氧可利用性和有害代谢产物的积累；稳定期积累大量次级代谢产物， （比死亡速率）根据产物的形成是否与菌体生长同步根据产物的形成是否与菌体生长同步关联关联生长关联型通常是初级代谢产物的形成。非生长关联型产物形成只与细胞的积累量有关。次级代谢产物如某些抗生素的合成。Yp/x为以生长为基准的产物得率； qp为比产物生产速率，即基于细胞生 长量的产物合成速率。 qp随u的增长而提高。为比例系数。基质初始浓度对菌生长的影响基质初始浓度对菌生长的影响基质初始浓度稳定期的菌浓ABCDX=Y(S0St)S0为初始基质浓度；St为经培养时间t的基质浓度；Y为得率系数。AB区域，当生长停止时，St等于0；CD区域，菌的进一步生长受到有害代谢物的限制。 此方程可用于预测用多少此方程可用于预测用多少初始基质能得到相应的菌量。初始基质能得到相应的菌量。分批发酵的优缺点分批发酵的优缺点优点优点 操作简单、周期短、染菌机会少、生产过程容易控制缺点缺点 不适用于测定过程动力学（基质抑制、二次生长等）补料补料-分批发酵分批发酵在分批发酵过程中补入新鲜料液，克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。准稳态：补入的基质等于细胞消耗的基质，故虽然培养液中的总菌量随时间延长增加，但菌浓度并未提高，即dx/dt=0。恒化器的稳态和补料-分批发酵的准稳态主要区别在于恒化器的u是不变的，而补料-分批发酵的u是降低的。优点：能在系统中维持很低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏和减缓有害代谢物的不利影响。分批补料的优化：通过一描述比生长速率与比生产速率之间关系的数学模型，借最大原理可获得比生长速率的最佳方案。半连续发酵半连续发酵在补料分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液（带放）。放掉的发酵液和其它正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。补充养分，同时解除/消弱代谢产物的抑制。不足：丢失了未利用的养分和处于生长旺盛期的菌体；送去提炼的发酵液体积更大；丢失代谢产生的前体物；利于非产生菌突变株的生长。实施：海洋微藻合成藻红素和EPA。需要摸索最佳的培养基更新速率。连续发酵连续发酵发酵过程中一面补入新鲜的料液，一面以相同的流速放料，维持发酵液原来的体积。（恒化培养）单级连续发酵多级连续发酵：增加罐的级数和将菌体运回罐内。 利于多种碳源的利用和次级代谢物的生产，如利用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷白氏菌，在第一级罐内只利用葡萄糖，第二级罐内利用麦芽糖，积累次级代谢产物。 但系统复杂，用于研究和实际生产有困难。连续发酵达到稳态后，非生产时间少，因此设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定，可及时排出有害代谢产物。污染杂菌：时间长，不断供给系统培养基。 了解杂菌在什么条件下发展成为主要的菌群？（通过计算菌的积累速率） 在分批培养中任何能在培养液中生长的杂菌将存活和增长，但连续培养杂菌能否积累取决于它在培养系统中的竞争能力。菌种突变： 工业用菌株通常是经过改造的菌株，回复突变的倾向性很大，发酵时不够稳定。如果突变的结果使细胞获得高速生长能力，但失去生长能力，则最终低产突变株将取代高产突变株。 连续培养时间越长，形成的突变株数目越多，发酵过程失败的可能性越大。解决方案：建立一种不利于低产突变株的选择性生产条件。 如，L-苏氨酸产生菌：多重遗传缺陷的异亮氨酸渗漏高产菌株，可使补入的培养基中不含异亮氨酸。与产物回收结合的培养与产物回收结合的培养解决产物反馈阻遏的问题： 在发酵过程中产物积累时将产物及时从发酵液中分离与回收。 将传统的分离手段与发酵过程耦合。P241，表5-1。膜分离与发酵耦合：有机酸（乳酸/醋酸等），乙醇，丙酮，丁醇发酵；抗生素；酶制剂等溶剂萃取与发酵耦合：乙醇，丙酮，丁醇，乳酸和赤霉素的发酵吸附发酵：发酵适当时机添加一种能选择性吸附产物而对生产菌无害的吸附剂。细胞的高密度培养细胞的高密度培养一般指微生物细胞密度达到100 g/L以上。主要解决的问题主要解决的问题：基质的限制或抑制；付产物的积累；高CO2与热的释放速率；高的氧需求及培养基粘度的不断增加达到高密度培养的手段达到高密度培养的手段：可采用一些特殊的生物反应器，如透析膜反应器，陶瓷膜反应器等；但工业上还是多采用一般的搅拌罐和补料工艺进行。要达到高密度培养要达到高密度培养：菌种本身；过程优化混合共培养系统混合共培养系统乙酸的生产：乙酸的生产：运动发酵单孢菌与醋酸杆菌混合培养由葡萄糖生产乙醇的生产：乙醇的生产：毕赤酵母和酿酒酵母以葡萄糖和木糖化合物生产PHB的生产的生产：德氏乳杆菌和真养产碱杆菌以葡萄糖生产发酵条件的影响及其控制发酵条件的影响及其控制常规发酵条件：常规发酵条件：温度、搅拌转速、空气流量、罐压、补料、液位、加糖或前体、通氨速率等能表征过程性质的状态参数能表征过程性质的状态参数:直接参数：溶氧、pH、溶解CO2、氧化还原电位、尾气中的氧和CO2、底物和产物浓度、中间代谢产物浓度、菌浓间接参数：比生长速率、摄氧率、CO2释放速率、氧体积传质速率、基质消耗速率、产物合成速率等培养基对发酵的影响培养基对发酵的影响 养分的需求养分的需求碳源氮源矿物盐特殊养分复合培养基工业发酵通常用农副产品，如鱼肉加工下脚，谷物和纤维加工的付产物等。培养基组成优化培养基组成优化种子培养基发酵培养基优化培养基的数学方法：优化培养基的数学方法：布列可特-博曼（Plackett-Burman）响应面设计均匀设计正交实验设计灭菌情况灭菌情况温度越高，对养分的破坏作用越大；温度越高，对养分的破坏作用越大；葡萄糖不宜与其他组分一起灭菌葡萄糖不宜与其他组分一起灭菌例如，葡萄糖氧化酶的发酵，灭菌温度比灭菌时间对产酶的影响更大。种子质量种子质量发酵期间生产菌种生长的快慢和产物合成的多寡在很大程度上取决于种子的质量。 （1）种龄 （2）接种量510温度温度温度对产物合成的影响： 温度高，生长速率快，生产期提前，但菌体容易衰老，影响产量； 温度亦影响生物合成方向：金色链霉菌低于30C时主要合成金霉素，而35C下只产生四环素。分阶段控温pH的影响的影响发酵过程中pH变化规律： 与微生物的代谢有关：以无机氨盐作为氮源时，发酵液pH下降；以NO3为氮源时，发酵液pH会上升；代谢付产物有机酸等的积累pH变化会影响酶活，菌对基质的利用效率和细胞结构，从而影响菌的生长和产物的合成。选择最适发酵pH的原则是获得最大比生产速率和适当的菌量。 分阶段pH控制策略如何控制发酵液pH？ 基础培养基的配方；通过加酸碱或中间补料 例如，青霉素发酵，通过调节加糖速率来控制pH；链霉素的生产，补充NH3来控制pH，同时为产物合成提供氮源。培养液培养液pH可反映菌的生理状况可反映菌的生理状况：pH上升超过最适值，意味着菌处于饥饿状态，可加糖调节；糖的过量又使pH下降；用氨水中和有机酸需防止微生物中毒，可通过监测培养液种溶氧浓度的变化来控制。氧的供需对发酵过程的影响氧的供需对发酵过程的影响DO的表征单位： 氧分压或张力，以大气压或mmHg表示（医疗单位）； 绝对浓度，以mg O2/ L纯水或ppm表示（主要用于环保单位）； 空气饱和度（）（发酵行业）呼吸临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度；产物合成临界氧：不影响产物合成所允许的最低浓度。培养过程中并非维持DO越高越好。某些操作故障或事故：某些操作故障或事故：搅拌停止、空气未能与液体充分混合等。中间补料的判断：中间补料的判断：赤霉素发酵，如补料时机不对并且间隔过密，会导致长时间DO处于较低水平，产生乙醇并与代谢中的有机酸反应，形成一种带有酒香味的酯类，称为“发酸”。污染杂菌：污染杂菌：DO迅速跌到零，并长时间不回升。溶氧作为发酵异常的指标溶氧的控制：搅拌、通气、加糖或补料速率（粘度）、发酵温度等工业上，在关键时刻，采用富氧气体以改善供氧状况。加糖、补料对发酵的影响加糖、补料对发酵的影响补料：补料： 消除底物抑制；消除底物抑制； 防止细胞生长过旺造成供氧不足。防止细胞生长过旺造成供氧不足。补料方式补料方式： 一次性大量；多次少量；一次性大量；多次少量； 连续流加（快速、恒速、连续流加（快速、恒速、指数和变速流加）指数和变速流加）补料的时机：补料的时机： 菌的形态、DO浓度、尾气中的O2和CO2含量； 残糖浓度（对于次级代谢产物，还原糖浓度一般控制在5g/L）； 产物形成（现代酵母发酵借助自动测量尾气中的微量乙醇控制糖蜜的流加）泡沫对发酵的影响泡沫对发酵的影响泡沫的副作用泡沫的副作用： 降低了发酵罐的装料系数降低了发酵罐的装料系数 增加了菌群的非专一性增加了菌群的非专一性 增加了染菌的几率增加了染菌的几率 引起引起“逃液逃液”，产物流失，产物流失 消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼工序带来麻烦。消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼工序带来麻烦。染菌的防治染菌的防治染菌的途径染菌的途径 种子包括进罐前菌种室出现问题种子包括进罐前菌种室出现问题 培养基配制和灭菌不彻底培养基配制和灭菌不彻底 空气除菌不彻底空气除菌不彻底 设备过程操作疏漏设备过程操作疏漏染菌的判断染菌的判断 镜检镜检 无菌实验无菌实验 DO变化变化