分光光度分析法分光光度分析法 Spectrophotometry 一、实验目的一、实验目的1、了解分光光度法的基本原理，理解何谓了解分光光度法的基本原理，理解何谓吸收曲线吸收曲线。2、掌握朗伯、掌握朗伯比尔定律，理解何谓比尔定律，理解何谓标准（工作）曲线标准（工作）曲线。3、了了解解显显色色反反应应及及其其影影响响因因素素，了了解解测测量量条条件件的的选选择择。掌握光度法测定的条件及方案的拟定方法。掌握光度法测定的条件及方案的拟定方法。4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法；、了解分光光度计的性能、结构及使用方法；二、分光光度法基本原理简介二、分光光度法基本原理简介 分分光光光光度度法法（spectrophotometry）是是基基于于物物质质分分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。 按按物物质质吸吸收收光光的的波波长长不不同同，可可分分为为紫紫外外分分光光光光度度法、可见分光光度法及红外分光光度法。法、可见分光光度法及红外分光光度法。特点：特点：* 灵敏度较高灵敏度较高，适用于，适用于微量组分微量组分 ( (110 gL-1) )的测定；的测定；* 误差较大误差较大，相对误差相对误差达到达到25%。 电磁波谱：电磁波谱： X射线射线 0.1100 nm 远紫外光远紫外光 10200 nm 近紫外光近紫外光 200400 nm 可见光可见光 400760 nm 近红外光近红外光 7502500 nm 中红外光中红外光 25005000 nm 远红外光远红外光 500010000 nm 微微 波波 0.1100 cm 无线电波无线电波 11000 m1 1、物质的颜色与吸收光的关系、物质的颜色与吸收光的关系日光：日光：紫紫 蓝蓝 青青 绿绿 黄黄 橙橙 红红复合光复合光：由各种单色光组成的光。由各种单色光组成的光。如白光如白光( (太阳光太阳光) ) 单色单色光光：只具有一种波长的光。只具有一种波长的光。 要求：要求：= 2nm。互补色光互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。物物质质的的颜颜色色是是由由于于物物质质对对不不同同波波长长的的光光具具有有选选择择性性的的吸收作用而产生的吸收作用而产生的。如：如：CuSO4呈兰色呈兰色。 物质呈现的颜色和吸收的光物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是颜色之间是互补关系互补关系。 光的互补：蓝光的互补：蓝 黄黄日日光光650760nm580600nm450480nm480490nm600650nm500580nm400450nm490500nm互补光互补光2 2、物质的吸收曲线、物质的吸收曲线M + 热热M + 荧光或磷光荧光或磷光 E = E2 - E1 = h 各能级是量子化各能级是量子化 ；选择性吸收；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；度不同； M + h M *基态基态 激发态激发态E1 （E） E2 用不同波长的用不同波长的单色光单色光照射，测定吸光度，如果以照射，测定吸光度，如果以波长波长 为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为为吸收曲线吸收曲线（ A曲线曲线）。）。吸收曲线吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。清楚地描述了物质对光的吸收情况。 max=510 nm （1）不同物质不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。吸收曲线的形状和吸收波长不同。MnO4-531吸收曲线吸收曲线（2）同一物质同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物对不同波长光的吸光度不同；同一物质质不同浓度不同浓度，其吸收曲线形状相似。，其吸收曲线形状相似。 吸收曲线是吸收曲线是特征特征的，可以提供物质的结构信息，作为的，可以提供物质的结构信息，作为物质物质定性定性定性定性分析分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。择入射光波长的重要依据。3 3、光的吸收定律、光的吸收定律朗伯朗伯- -比耳定律比耳定律吸光度吸光度A ：物质对光的吸收程度。物质对光的吸收程度。定义：定义： Alg（I0/It)A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。 1760年朗伯年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：吸收层厚度的关系：Ab 1852年比耳年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：吸收物浓度之间也具有类似的关系：Ac 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，比耳定律， Abc 朗伯朗伯比耳定律数学表达式：比耳定律数学表达式： Alg（I0/It)= b c 式式中中：A，吸吸光光度度，无无量量刚刚； b，液液层层厚厚度度(光光程程长长度度)，cm； c，溶溶液液的的浓浓度度， mol L -1 ； 称称为为摩摩尔尔吸吸光光系系数数，Lmol-cm-1，仅仅与与入入射射光光波波长长、溶溶液液的的性性质及温度有关，与浓度无关。质及温度有关，与浓度无关。上上式式表表明明：当当一一束束单单色色光光通通过过溶溶液液时时，其其吸吸光光度度与与溶溶液浓度和宽度的乘积成正比液浓度和宽度的乘积成正比。 T T、A A、c c间的关系：间的关系： A lg（I0/It) = -lg T = b c 透光度透光度( (透光率透光率) )T T ：透过光和入射光强度之比：透过光和入射光强度之比，即即T= It /I0 100%T越大，表示对光的吸收越小。越大，表示对光的吸收越小。吸光度具有吸光度具有加和性：加和性： 在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：在多组分体系中，吸光度具有加和性，即： A（总）总） A1 + A2 + An = 1b c+ 2b c+ nb c 其方法和步骤是：其方法和步骤是：1）配制一组浓度不同的标准溶液）配制一组浓度不同的标准溶液(c1 、 c2 )；2）在一定波长下，分别测定其吸光度）在一定波长下，分别测定其吸光度(A1、A2)。3）以以A为为纵纵坐坐标标，浓浓度度c为为横横坐坐标标，绘绘制制曲曲线线，得得到到一一条通过原点的直线，称为条通过原点的直线，称为标准曲线标准曲线（A-c曲线）。曲线）。4）用用完完全全相相同同的的方方法法和和步步骤骤测测定定待待测测溶溶液液的的吸吸光光度度Ax，从标准曲线上找出对应的浓度从标准曲线上找出对应的浓度cx值（值（ Ax cx ）。）。4 4、定量测定方法、定量测定方法标准曲线法标准曲线法Axcx 空白空白 标准溶液标准溶液 待测溶液待测溶液Blank Standard Sample Samplec1c2c3c4cxc0标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线a a、目视比色法目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。法称为目视比色法。特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。高。b b、分光光度计分光光度计5 5、 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计仪器基本组成仪器基本组成a. a. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：可见光区：钨灯钨灯作为光作为光源，其辐射波长范围在源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：紫外区：氢、氘灯氢、氘灯。发。发射射185400 nm的连续光谱。的连续光谱。 b.b.单色器单色器又称又称波长控制器波长控制器，其作用是，其作用是将光源发射的复合光分解将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出一任波长单色光的光学系统。成单色光，并可从中选出一任波长单色光的光学系统。包括包括狭缝、色散元件和准光装置狭缝、色散元件和准光装置。色散元件的作用是色散元件的作用是将复合光分解成单色光将复合光分解成单色光，有，有棱镜或光栅棱镜或光栅两种。两种。c. c. 样品室样品室样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿比色皿）和相应的池架附件。）和相应的池架附件。吸收池主要有吸收池主要有石英池石英池和和玻璃池玻璃池两两种。种。e. e. 结果显示记录系统结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理器自动控制和结果处理d. 检测器检测器利用利用光电效应光电效应将透过吸收池的光信将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。电池、光电管或光电倍增管。1 1、显色反应、显色反应2 2、显色反应条件的选择、显色反应条件的选择3 3、测量条件的选择、测量条件的选择6、 显色与测量条件的选择显色与测量条件的选择1 1）、显色反应）、显色反应显色反应显色反应使无色或浅色的待测组分转变为有色使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的反应。化合物的反应。显色剂显色剂与待测组分反应形成有色化合物的试剂与待测组分反应形成有色化合物的试剂成为。成为。 Fe2+3RFe(3R)2+（红橙色，红橙色， max=510 nm） R为邻二氮菲为邻二氮菲2 2） 显色反应条件的选择显色反应条件的选择a.a.显色剂用量显色剂用量选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）的显色剂用量。平坦处）的显色剂用量。b.b.反应体系的酸度反应体系的酸度 选择吸光度最大且基本恒定（曲选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）所线变化平坦处）所对应的对应的pHpH范围。范围。c.c.显色时间与温度显色时间与温度d.d.溶剂溶剂 一般尽量采用一般尽量采用水相水相测定。测定。3 3）测定条件的选择）测定条件的选择a.a.选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般选一般选 max为入射光波长。如果为入射光波长。如果 max处有共存处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。扰的入射光波长。 b.b.选择合适的参比溶液选择合适的参比溶液 为什么需要使用参比溶液？为什么需要使用参比溶液？使使测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。 A=A1+A2+A(x)， A1+A2+ =0, =0, A=A(x) 。 参比溶液的选择一般遵循以下原则：参比溶液的选择一般遵循以下原则： 若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，用若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，用纯溶剂（水纯溶剂（水) )作作参比溶液；参比溶液； 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用本身无吸收，用“试剂空白试剂空白”( (不加试样溶液不加试样溶液) )作参比溶液；作参比溶液； 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用可用“试样空白试样空白”( (不加显色剂不加显色剂) )作参比溶液；作参比溶液；c.c.控制适宜的吸光度（读数范围）控制适宜的吸光度（读数范围）用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T =1565%，相应地吸光度相应地吸光度 A =0.800.20。当溶液的吸光度或透光率不在此范围时，可以通过当溶液的吸光度或透光率不在此范围时，可以通过改变改变溶液浓度溶液浓度及及选择不同厚度的比色皿选择不同厚度的比色皿来控制。来控制。分光光度法测定铁的含量分光光度法测定铁的含量一、实验目的一、实验目的1 1、了解分光光度法测铁的基本原理；、了解分光光度法测铁的基本原理；2 2、学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择；学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择；3 3、学习标准曲线的绘制以及试样测定方法；、学习标准曲线的绘制以及试样测定方法；4 4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法。、了解分光光度计的性能、结构及使用方法。二、实验原理二、实验原理 A= bc在一定实验条件下，在一定实验条件下，A=kc，Ax值值cx值。值。pH39，Fe2+与与Phen反应反应：Fe2+3RFe(3R)2+（红橙色，红橙色， max=510 nm）（注：（注： Fe3+3RFe(3R)3+ ，兰色，兰色， max=600 nm ） 用用盐盐酸酸羟羟胺胺还还原原，再再显显色色反反应应，则则可可以以测测得得溶溶液液中中总总铁含量：铁含量：2Fe3+2NH2OHHCl=2Fe2+N2+2H2O+2Cl-三、实验步骤三、实验步骤1、吸收曲线的制作、吸收曲线的制作试剂溶液：试剂溶液：不加铁标，其余同上配制。不加铁标，其余同上配制。以试剂溶液作参比，在以试剂溶液作参比，在440560nm间，每隔间，每隔10 nm测一次测一次吸光度，并且绘制吸光度，并且绘制A- 曲线，选择最佳测定波长。曲线，选择最佳测定波长。注注：每改变一个波长，就需用参比溶液重新调节仪器。每改变一个波长，就需用参比溶液重新调节仪器。稀至刻度稀至刻度1.00mL100mg/L 铁标铁标1.00mL10%盐酸羟胺盐酸羟胺50摇匀摇匀2.00mL 0.15%邻二氮菲邻二氮菲5.00mL 1mol/L NaACH2O试样溶液：试样溶液：3、稳定性实验、稳定性实验试样溶液同实验试样溶液同实验1。以试剂溶液作参比，在以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同显色时间处，测定不同显色时间下的吸光度，并且绘制下的吸光度，并且绘制A-t曲线，考察反应时间的影响曲线，考察反应时间的影响以及有色溶液的稳定性以及有色溶液的稳定性。2、显色剂浓度的影响、显色剂浓度的影响试样溶液中除了试样溶液中除了邻二氮菲的邻二氮菲的加入量不同外，其余配制加入量不同外，其余配制方法同实验方法同实验1。以试剂溶液作参比，在以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同显色浓度处，测定不同显色浓度下的吸光度，并且绘制下的吸光度，并且绘制A-V曲线，考察显色剂浓度的影曲线，考察显色剂浓度的影响响。4、溶液、溶液pH的影响的影响以试剂溶液作参比，在以试剂溶液作参比，在508 nm处，测定不同处，测定不同pH下的吸下的吸光度，光度，并且并且pH计测定相应溶液计测定相应溶液pH值，值，绘制绘制A-pH曲线，曲线，考察考察pH的影响的影响。稀至刻度稀至刻度10.00mL100mg/L 铁标铁标5.00mL 2mol/L盐酸盐酸100 2min10.00mL盐酸羟胺盐酸羟胺20.00mL邻二氮菲邻二氮菲H2O稀至刻度稀至刻度10.00mL上述溶液上述溶液不同量不同量0.4mol/LNaOH50 H2O5、标准溶液曲线的制作、标准溶液曲线的制作按照书中方法配制按照书中方法配制0#8#溶液，以溶液，以0#为参比溶液，测为参比溶液，测定定1#8#溶液的吸光度值，并且绘制溶液的吸光度值，并且绘制Ac标准曲线。标准曲线。6、未知样中总铁含量的测定、未知样中总铁含量的测定按照书中的方法配制按照书中的方法配制9#溶液，测定其吸光度值，从标溶液，测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应铁总含量。准曲线中查得相应铁总含量。7、未知样中、未知样中Fe2+含量的测定含量的测定按照书中的方法配制按照书中的方法配制10#溶液（即不加盐酸羟胺），溶液（即不加盐酸羟胺），测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应亚铁含量。测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应亚铁含量。四、实验注意事项四、实验注意事项1、移液管专用；、移液管专用；2、注意移液管的使用方法，要求每次从零刻度放、注意移液管的使用方法，要求每次从零刻度放至所需的体积；至所需的体积；3、注意溶液的填加顺序，不能随意颠倒，加入盐、注意溶液的填加顺序，不能随意颠倒，加入盐酸羟氨后反应酸羟氨后反应5min，再加再加NaAc和和邻二氮菲邻二氮菲