Membrane Biophysics 021Membrane Topology 膜蛋白的拓扑学2为什么要了解膜蛋白的拓扑学？为什么要了解膜蛋白的拓扑学？n蛋白质的结构决定功能蛋白质的结构决定功能n膜蛋白的功能具有跨膜方向性膜蛋白的功能具有跨膜方向性了解膜蛋白的功能必须了解其膜拓扑学了解膜蛋白的功能必须了解其膜拓扑学3 什么是膜蛋白拓扑学？什么是膜蛋白拓扑学？ (membrane protein topology)1. 蛋白质序列中的跨膜片断蛋白质序列中的跨膜片断那些部位插膜那些部位插膜2. 蛋白质在膜上的取向蛋白质在膜上的取向那些部分位于细胞膜的内侧，那些部分那些部分位于细胞膜的内侧，那些部分位于细胞膜的外侧位于细胞膜的外侧4膜蛋白拓扑取向的基本原理膜蛋白拓扑取向的基本原理疏水性原则疏水性原则n脂双层的碳氢链区是高度疏水的区域脂双层的碳氢链区是高度疏水的区域n蛋白质的跨膜区域必定是高度疏水区域蛋白质的跨膜区域必定是高度疏水区域n蛋白质一般以蛋白质一般以 -螺旋形式跨膜螺旋形式跨膜n跨膜跨膜 -螺旋的长度一般为螺旋的长度一般为20个氨基酸个氨基酸以以20个氨基酸为单位，计算蛋白质序列的疏水性个氨基酸为单位，计算蛋白质序列的疏水性蛋白质中疏水性大的序列，即为可能的跨膜区域蛋白质中疏水性大的序列，即为可能的跨膜区域53.1 膜蛋白拓扑取向的基本原理膜蛋白拓扑取向的基本原理3.1.2 正电荷氨基酸向内原则正电荷氨基酸向内原则n对大量已知结构的膜蛋白统计分析表明，对大量已知结构的膜蛋白统计分析表明，荷正电的氨基酸倾向于位于膜的内侧荷正电的氨基酸倾向于位于膜的内侧n此规则只适用于长度小于此规则只适用于长度小于60个氨基酸的个氨基酸的片断片断n随片断长度的增加，正电荷氨基酸位于随片断长度的增加，正电荷氨基酸位于内侧的几率降低内侧的几率降低62.2.1.2 化学势和溶质浓度的关系化学势和溶质浓度的关系n假设溶液为理想溶液假设溶液为理想溶液混合焓变混合焓变 H=0混合熵变由简单统计规则给出混合熵变由简单统计规则给出自由能变化为自由能变化为n另一方面另一方面所以所以式中式中 为纯物质的化学势，为纯物质的化学势，Xi为该物质在溶液中的摩尔分数为该物质在溶液中的摩尔分数7转移自由能与溶解度的关系转移自由能与溶解度的关系考虑烃类分子形成的相与水相两相共存考虑烃类分子形成的相与水相两相共存系统系统n烃类在有机相的化学势为烃类在有机相的化学势为n烃类在水相的化学势为烃类在水相的化学势为8疏水性的定量计算疏水性的定量计算n Go0，表示氨基酸难从有机相转移至水相，表示氨基酸难从有机相转移至水相，即疏水即疏水n Go0，表示氨基酸易从有机相转移至水相，表示氨基酸易从有机相转移至水相，即亲水即亲水 Go用来代表氨基酸的疏水性用来代表氨基酸的疏水性Xi为该物质在溶液中的摩尔分数为该物质在溶液中的摩尔分数9氨基酸的疏水性n疏水性氨基酸：Phe, Met, Ile, Leu, Val, Cys, Alan亲水性氨基酸：Arg, Asp, Lys, Glu, Asn, Gln, His10膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法蛋白质疏水性分析蛋白质疏水性分析1. 以以10-20个连续的氨基酸为计算单位，计算该个连续的氨基酸为计算单位，计算该肽段疏水指标之和（肽段疏水指标之和（eg. 1-10, 2-11, 3-12, etc.）作为该肽段的作为该肽段的疏水指数（疏水指数（hydropathy index）2. 以疏水指数对氨基酸序号作图以疏水指数对氨基酸序号作图3. 具有高的疏水指数的一个具有高的疏水指数的一个 20个氨基酸的肽段个氨基酸的肽段即为可能的跨膜螺旋片断即为可能的跨膜螺旋片断11 细菌视紫红质的结构细菌视紫红质的结构预测预测实测实测12作业:水通道蛋白，AQP1, 哪段是跨膜区域？AA: 212-231 ？AA: 120-139 ？13膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法酶解法酶解法n蛋白质包埋在脂双层中可抵抗水解酶的作用蛋白质包埋在脂双层中可抵抗水解酶的作用利用水解法可判断蛋白质暴露于膜外的部分利用水解法可判断蛋白质暴露于膜外的部分n选择水解酶的作用方式可判断蛋白的取向选择水解酶的作用方式可判断蛋白的取向n外侧加水解酶：蛋白向外部分发生水解外侧加水解酶：蛋白向外部分发生水解n内侧加水解酶：蛋白向内部分发生水解内侧加水解酶：蛋白向内部分发生水解14膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法酶解法酶解法制备蛋白取向一致的膜囊泡制备蛋白取向一致的膜囊泡 加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶）加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶） 加入酶抑制剂终止反应加入酶抑制剂终止反应 SDS-PAGE 分析分析15酶解法酶解法16膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法酶解法酶解法n蛋白酶抑制剂必须有效蛋白酶抑制剂必须有效保证有限酶解，不是完全酶解保证有限酶解，不是完全酶解n应用多种水解酶，互相印证结果应用多种水解酶，互相印证结果n阴性结果说明阴性结果说明n蛋白质没有膜外部分蛋白质没有膜外部分 或或n膜外部分无水解酶切位点膜外部分无水解酶切位点n检测方法：检测方法：n如所研究蛋白占大部分，可直接分析如所研究蛋白占大部分，可直接分析n如所研究蛋白占少部分，须应用抗体或其它标记方如所研究蛋白占少部分，须应用抗体或其它标记方法分析法分析17膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法同位素标记法同位素标记法制备蛋白取向一致的膜囊泡制备蛋白取向一致的膜囊泡 125I标记标记 SDS-PAGE 放射自显影分析放射自显影分析n选择标记方式可判断蛋白的取向选择标记方式可判断蛋白的取向n外侧标记：蛋白向外部分被标记外侧标记：蛋白向外部分被标记n内侧标记：蛋白向内部分被标记内侧标记：蛋白向内部分被标记18膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法免疫学方法免疫学方法制备蛋白取向一致的膜囊泡制备蛋白取向一致的膜囊泡 加入胶体金标记的针对特定肽段的单克隆抗体加入胶体金标记的针对特定肽段的单克隆抗体 电子显微镜观察电子显微镜观察 分析分析19膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法化学标识法化学标识法n极性试剂极性试剂n不能插膜：标记蛋白质膜外部分不能插膜：标记蛋白质膜外部分n非极性试剂非极性试剂n可以插膜：标记蛋白质膜内部分可以插膜：标记蛋白质膜内部分将化学标识物事先用放射性同位素标记，将化学标识物事先用放射性同位素标记，反应后用放射自显影检测反应后用放射自显影检测20膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法特殊部位定位法特殊部位定位法n糖基化位点：位于细胞膜的外侧糖基化位点：位于细胞膜的外侧n磷酸化位点：位于细胞质一侧磷酸化位点：位于细胞质一侧通过分析蛋白质上的这些位点即可推知通过分析蛋白质上的这些位点即可推知相应修饰位点的拓扑取向相应修饰位点的拓扑取向21膜蛋白拓扑学的研究方法膜蛋白拓扑学的研究方法融合蛋白法融合蛋白法原理：原理：n特定蛋白质在特定的细胞器内方有活性特定蛋白质在特定的细胞器内方有活性n将待定蛋白基因与报告蛋白基因融合将待定蛋白基因与报告蛋白基因融合n将融合基因在适当宿主细胞中表达将融合基因在适当宿主细胞中表达n测定报告蛋白的定位测定报告蛋白的定位n优点：原位细胞器定位优点：原位细胞器定位n缺点：缺点：n融合蛋白可能破坏原蛋白的拓扑取向融合蛋白可能破坏原蛋白的拓扑取向n融合蛋白可能破坏原蛋白的构象及生化活性融合蛋白可能破坏原蛋白的构象及生化活性22