第十三章第十三章 生化药物和基因工程生化药物和基因工程药物分析概念药物分析概念1 1、 了解生化药物、基因工程药物的定了解生化药物、基因工程药物的定义、种类。义、种类。2 2、熟悉质量检验的基本程序与方法。、熟悉质量检验的基本程序与方法。3 3、掌握生化药物、基因工程药物的特、掌握生化药物、基因工程药物的特点及常用的化学定量分析方法。点及常用的化学定量分析方法。本章学习要点本章学习要点人类用于预防、治疗和诊人类用于预防、治疗和诊断疾病的三大主要药物断疾病的三大主要药物第一节第一节 概概 述述化学药物化学药物生物药物生物药物中中 药药生物药物的定义：生物药物的定义： 利用利用生物体、生物组织或器官生物体、生物组织或器官等成等成分，综合运用生物学、生物化学、微生分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。与方法制得的一大类药物。生物药物的分类：生物药物的分类：生化药物生化药物生物技术药物生物技术药物生物制品生物制品从生物体分离纯化制得的生化基从生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的一物合成或现代生物技术制得的一类药物。类药物。利用生物体或其组成部分利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系即现发展产品的技术体系即现代生物技术研制的药物称代生物技术研制的药物称之。之。应用普通的或基因工程、应用普通的或基因工程、细胞工程、蛋白质工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的疾病预防、治疗和诊断的药品。药品。一、生化药物和基因工程药物的定义一、生化药物和基因工程药物的定义1 1、生化药物的定义、生化药物的定义 从动物、植物及微生物提取的，也从动物、植物及微生物提取的，也可用生物化学半合成或用现代生物技可用生物化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等。解物以及大分子的结构修饰物等。2 2、基因工程药物的定义、基因工程药物的定义 先先确确定定对对某某种种疾疾病病具具有有预预防防和和治治疗疗作作用用的的蛋蛋白白质质，然然后后将将控控制制该该蛋蛋白白质质合合成成过过程程的的基基因因进进行行分分离离、纯纯化化或或人人工工合合成成，利利用用重重组组DNADNA技技术术加加以以改改造造，最最后后将将该该基基因因导导入入可可以以大大量量生生产产的的受受体体细细胞胞中中不不断断繁繁殖殖或或表表达达，并并能能进进行行大大规规模模生生产产具具有有预预防防和和治治疗疗这这种种疾疾病病的的蛋蛋白白质质，通通过过这这种种方方法法生产的药物称之。生产的药物称之。1 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药物、氨基酸、多肽与蛋白质类药物二、生化药物和基因工程药物的种类二、生化药物和基因工程药物的种类（一）生化药物的种类（一）生化药物的种类（1 1）氨基酸及其衍生物：）氨基酸及其衍生物： 单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。 氨氨基基酸酸衍衍生生物物：N-N-乙乙酰酰-L-L-半半胱胱氨氨酸酸、S- S-氨氨基基甲甲酰酰半半胱胱氨氨酸酸、S- S-甲甲基基半半胱胱氨氨酸酸、谷胺酰胺、谷胺酰胺、S- S-羟色氨酸。羟色氨酸。 复复合合氨氨基基酸酸注注射射液液：3S3S、6S6S、9S9S、11S11S、13S13S、14S14S、15S15S、17S17S、18S18S复复合合氨氨基基酸注射液。（酸注射液。（S S代表氨基酸的种类）代表氨基酸的种类）（2 2）多肽类药物）多肽类药物 ： 垂垂体体多多肽肽：促促肾肾上上腺腺皮皮质质激激素素、促促胃液素、加压素。胃液素、加压素。 消消化化道道多多肽肽：促促胰胰液液素素（胰胰泌泌素素）、胃泌素、抑胃肽。胃泌素、抑胃肽。 下下丘丘脑脑多多肽肽：促促甲甲状状腺腺素素释释放放激激素素、促促性性腺腺激激素素释释放放激激素素、生生长长激激素素释释放放激激素。素。 脑脑多多肽肽：由由人人及及动动物物脑脑和和脑脑脊脊液液中中分分离离出出来来的的多多肽肽、蛋蛋氨氨酸酸脑脑啡啡肽肽和和亮亮氨氨酸酸脑啡肽等。脑啡肽等。 激激肽肽类类：血血管管紧紧张张肽肽I I、II II、IIIIII等等活活性性肽。肽。 其其它它肽肽类类：谷谷脱脱甘甘肽肽、降降钙钙素素、睡睡眠眠肽肽、松松果果肽肽、血血活活素素（分分子子量量为为30003000的肽为主成分的肽为主成分) )。（3 3）蛋白类药物）蛋白类药物 猪猪或或牛牛的的纤纤维维蛋蛋白白原原、纤纤维维蛋蛋白白、胃胃膜膜素素（糖糖蛋蛋白白）、水水蛭蛭素素、肝肝细细胞胞生生长长因因子子；属属蛋蛋白白质质类类激激素素尚尚有有生生长长素素、催催 乳乳 素素 、 促促 甲甲 状状 腺腺 素素 、 促促 泡泡 激激 素素（FSHFSH）、促促黄黄体体激激素素（LHLH）；植植物物来来源源的的蛋蛋白白类类药药物物有有植植物物凝凝集集素素、天天花花粉粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。2 2、酶类药物、酶类药物（1 1）助助消消化化酶酶类类：胃胃蛋蛋白白酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。（2 2）蛋蛋白白水水解解酶酶类类：溶溶菌菌酶酶、胰胰DNADNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。（3 3）凝凝血血酶酶及及抗抗栓栓酶酶：凝凝血血酶酶（猪猪、牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。（4 4）抗抗肿肿瘤瘤酶酶类类：L- L-天天门门冬冬酰酰胺胺酶酶、甲甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5 5）其其它它酶酶类类：细细胞胞色色素素C C、超超氧氧化化物物歧化酶（歧化酶（SODSOD）、）、RNARNA酶、青霉素酶。酶、青霉素酶。（ 6 6） 辅辅 酶酶 ： CoACoA、 黄黄 素素 单单 核核 苷苷 酸酸（ FMNFMN） 、 黄黄 素素 腺腺 嘌嘌 呤呤 二二 核核 苷苷 酸酸（FADFAD）。）。 3 3、多糖类药物、多糖类药物（1 1）肝素、硫酸软骨素）肝素、硫酸软骨素A A和和C C、硫酸皮、硫酸皮肤素（硫酸软骨素肤素（硫酸软骨素B B）、硫酸角质素、透）、硫酸角质素、透明质酸等。明质酸等。（2 2）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等。多糖、人参多糖、黄芪多糖等。4 4、脂质类药物、脂质类药物 卵卵磷磷脂脂、脑脑磷磷脂脂、胆胆固固醇醇、麦麦角角固固醇醇、B B谷谷固固醇醇、胆胆汁汁酸酸（胆胆酸酸与与甘甘氨氨酸酸或或牛牛黄黄酸酸的的结结合合物物）、鹅鹅脱脱氧氧胆胆酸酸、胆胆红红素素、原原叶叶琳琳、血血叶叶琳琳、亚亚油油酸酸、花花生生四四烯烯酸酸、五五- -六六烯烯酸酸、前前列列腺腺素素系系列列（PGE1PGE1、PGE2PGE2、PGE2aPGE2a和和PG12PG12）。）。5 5、核酸类药物、核酸类药物 RNARNA（包包括括iRNAiRNA- -免免疫疫核核糖糖核核酸酸）、DNADNA（脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸）、聚聚肌肌苷苷酸酸、巯巯基聚胞苷酸、基聚胞苷酸、cAMPcAMP、AMPAMP、肌苷。、肌苷。 此此外外，有有核核酪酪制制剂剂，6-6-巯巯基基嘌嘌呤呤、6-6-硫硫代代嘌嘌呤呤、5-5-氟氟尿尿嘧嘧啶啶、阿阿糖糖胞胞苷苷、5-5-碘苷和无环鸟苷等。碘苷和无环鸟苷等。二、基因工程工药物的种类二、基因工程工药物的种类1 1、激素类及神经递质类药物、激素类及神经递质类药物（1 1）人生长激素释放抑制因子）人生长激素释放抑制因子（2 2）人胰岛素）人胰岛素（3 3）人生长激素）人生长激素2 2、细胞因子类药物、细胞因子类药物（1 1）人干扰素）人干扰素（2 2）人白细胞介素）人白细胞介素（3 3）集落刺激因子）集落刺激因子（4 4）促红细胞生长素）促红细胞生长素3 3、酶类及凝血因子类药物、酶类及凝血因子类药物 单单克克隆隆抗抗体体、疫疫苗苗、基基因因治治疗疗药药物物、白白介介素素、生生长长因因子子、反反义义药药物物、肿肿瘤瘤坏坏死因子等。死因子等。1 1、共同特点：、共同特点： 具具有有一一定定的的生生物物活活性性或或生生理理功功能能，能能够够参参与与、影影响响和和调调控控人人体体代代谢谢和和生生理理功功能能，对对于于某某些些疾疾病病的的治治疗疗具具有有针针对对性性强强、毒毒副副作作用用小小、易易为为人人体体所所吸吸收等特点。收等特点。三、生化药物和基因工程药物的特点三、生化药物和基因工程药物的特点2 2、分子量不是定值、分子量不是定值 除除氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸、辅辅酶酶及及甾甾体体激激素素等等属属化化学学结结构构明明确确的的小小分分子子化化合合物物外外，大大部部分分为为大大分分子子物物质质，其其分分子子量量一一般般几几千千至至几几十十万万。对对大大分分子子的的药药物物而而言言，即即使使组组分分相相同同，往往往往由由于于分分子子量量不不同同而而产产生不同的生理活性。生不同的生理活性。 3 3、结构确证难、结构确证难 在此类药物中，由于在此类药物中，由于有效结构或分有效结构或分子量不确定子量不确定，其结构的确证很难沿用元，其结构的确证很难沿用元素分析、素分析、IRIR、UVUV、NMRNMR、MSMS等方法等方法加以证实，往往还要用加以证实，往往还要用生化法生化法如氨基酸如氨基酸序列等法加以证实。序列等法加以证实。4 4、全过程的质量控制、全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以此类药物对热、酸、碱、重金属以及及pHpH较敏感，需对原材料、生产过程较敏感，需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制。和最终产品进行质量控制。5 5、生物活性检查、生物活性检查 在在制制备备多多肽肽或或蛋蛋白白质质类类药药物物时时，有有时时因因工工艺艺条条件件的的变变化化，导导致致蛋蛋白白质质失失活活。因因此此，除除了了用用通通常常采采用用的的理理化化法法检检验验外外：尚尚需需用用生生物物检检定定法法进进行行检检定定，以以证证实实药药物的生物活性。物的生物活性。 6 6、安全性检查、安全性检查 由于此类药物性质特殊，生产工艺由于此类药物性质特殊，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常需做安全性检查。需做安全性检查。7 7、效价测定、效价测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活力对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。测定，以表明其有效成分含量的高低。第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验一、鉴别试验（一）理化鉴别法（一）理化鉴别法 利利用用化化学学法法、物物理理法法及及生生物物学学方方法法来来确确证证生生化化药药物物的的真真伪伪。用用标标准准品品或或对对照照品在同一条件下进行对照试验。品在同一条件下进行对照试验。1 1、化学反应法化学反应法 通通常常利利用用药药物物与与某某试试剂剂在在一一定定条条件件下下反反应应，生生成成有有颜颜色色的的产产物物或或沉沉淀淀进进行行鉴鉴别别。例例如如，溶溶菌菌酶酶的的鉴鉴别别采采用用呈呈色色法法；胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。胃蛋白酶的鉴别采用沉淀法。 2 2、HPLCHPLC法法3 3、UVUV法法 三三磷磷酸酸腺腺苷苷二二钠钠的的分分子子中中具具有有共共轭轭系系统统，能能吸吸收收紫紫外外光光。本本品品的的0.01mol0.01molL L盐盐酸酸水水溶溶液液（20g20gmlml），在在（25712571）nmnm的的波波长长处处有有最最大大吸吸收收。A250nmA250nm A260nmA260nm的的 值值 应应 为为 0.170.170.270.27。（二）（二）生化鉴别法生化鉴别法 1 1、酶酶法法：尿尿激激酶酶是是专专属属性性较较强强的的蛋蛋白白水水解解酶酶，根根据据尿尿激激酶酶能能激激活活牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原，而而具具有有相相同同作作用用的的链链激激酶酶不不能能激激活活牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原而而加加以以区区别别，并并用用直直接接观观察察溶溶解解纤纤维维蛋蛋白白作作用用的的气气泡泡上上升法作为判断指标。升法作为判断指标。 2 2、电泳法、电泳法 肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由素是由D-D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相一致。准品对照，其移动位置应相一致。 3 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药物的等电点（为出现多条区测定药物的等电点（为出现多条区带多个等电点），同批次同一产品的等带多个等电点），同批次同一产品的等电点应相同，表明其工艺稳定。电点应相同，表明其工艺稳定。（三）（三）生物鉴别法：利用生物体进行试生物鉴别法：利用生物体进行试验来鉴别药物。验来鉴别药物。二、杂质检查二、杂质检查（一）（一）一般杂质检查一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。失重、炽灼残渣等。（二）（二）特殊杂质检查特殊杂质检查 许多药物是从生物组织中提取或用许多药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。杂质或其他成分。1 1、原料药的纯度分析、原料药的纯度分析2 2、生产过程中杂质检查、生产过程中杂质检查三、安全性检查三、安全性检查（一）（一）热原热原检查法（家兔、检查法（家兔、鲎鲎试剂）试剂）（二）异常毒性试验（二）异常毒性试验 ：用一定剂量的药：用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。否为终点。 （三）过敏试验（检查（三）过敏试验（检查异性蛋白异性蛋白） 药药物物中中若若夹夹杂杂有有异异性性蛋蛋白白，在在临临床床使使用用时时易易引引起起病病人人多多种种过过敏敏反反应应，轻轻者者皮皮肤肤出出现现红红斑斑或或丘丘疹疹，严严重重者者可可出出现现窒窒息息、发发结结、血血管管神神经经性性水水肿肿、血血压压下下降降，甚至休克和死亡。甚至休克和死亡。（四）（四）降压物质降压物质检查法检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。其他导致血压降低的物质。来源来源：用动物脏器或组织为原料制备生化：用动物脏器或组织为原料制备生化药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质。酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质。（五）无菌检查法（五）无菌检查法 （检查（检查活菌活菌） 由于许多药物是在无菌条件下制备由于许多药物是在无菌条件下制备的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查就更有必要。中国药典中几乎所有的注就更有必要。中国药典中几乎所有的注射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检查。查。1 1、无菌检查的基本步骤：、无菌检查的基本步骤： 培养基的制备，为细菌生长、繁殖提供所培养基的制备，为细菌生长、繁殖提供所必需的营养物质必需的营养物质碳源、氮源、维生素、矿碳源、氮源、维生素、矿物质等。物质等。 选择对照用菌液，供对照试验用。选择对照用菌液，供对照试验用。 具体检查，如接种、培养等操作。具体检查，如接种、培养等操作。 结果判断，得出阴性或阳性的结论。结果判断，得出阴性或阳性的结论。2 2、注意事项：、注意事项： 无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作法，包括对操作环境、试验材料及用具酶灭法，包括对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等，防止微生物污染。菌等，防止微生物污染。 应避免在有抑菌条件下操作。应避免在有抑菌条件下操作。 从事无菌操作人员应具备微生物学的基础从事无菌操作人员应具备微生物学的基础知识及一定工作经验，否则要经过无菌技能知识及一定工作经验，否则要经过无菌技能的培训，方能从事此工作。的培训，方能从事此工作。（六）基因工程药物中可能杂质与污染（六）基因工程药物中可能杂质与污染物检查物检查可能杂质：残留可能杂质：残留DNADNA、宿主细胞蛋白质、宿主细胞蛋白质、内毒素等；内毒素等；主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要检查项目：外源性主要检查项目：外源性DNADNA、其他外源、其他外源性杂质测定性杂质测定（七）致突变试验（七）致突变试验包括：微生物回复突变试验、哺乳动物包括：微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等。核试验等。（八）生殖毒性试验（八）生殖毒性试验包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性包括：一般生殖毒性试验、围生期毒性试验。试验。四、含量（效价）测定四、含量（效价）测定含量含量表示表示方法方法百分含量，适用于结构明确的小百分含量，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子分子药物或经水解后变成小分子的药物。的药物。生物效价或酶活力，适用于酶类、生物效价或酶活力，适用于酶类、蛋白质类等药物。蛋白质类等药物。 （一）含量测定（一）含量测定1 1、HPLCHPLC法法2 2、SDS-PAGESDS-PAGE法法（二）效价测定：采用国际或国家参考（二）效价测定：采用国际或国家参考品，或经国家检定机构认可的参考品，品，或经国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定其生物学活性，并以体内或体外法测定其生物学活性，并标明其活性单位。标明其活性单位。第三节第三节 常用定量分析方法及其应用常用定量分析方法及其应用一、理化法一、理化法（一）化学分析法（一）化学分析法1 1、重重量量法法：根根据据样样品品中中分分离离出出的的单单质质或化合物的重量测定所含成分的含量。或化合物的重量测定所含成分的含量。（1 1）提取法）提取法 （2 2）挥发法）挥发法 （3 3）沉淀法）沉淀法（二）电化学分析法（二）电化学分析法 离子选择性电极：离子选择性电极：测量离子活度的测量离子活度的指示电极。指示电极。 2 2、滴滴定定分分析析法法：根根据据样样品品中中某某些些成成分分与与标标准准溶溶液液能能定定量量地地发发生生酸酸碱碱中中和和、氧化还原或络合反应等进行测定。氧化还原或络合反应等进行测定。（三）光谱分析法（三）光谱分析法1 1、比比色色法法：样样品品与与显显色色剂剂可可发发生生颜颜色色反反应应，依依颜颜色色反反应应的的强强度度测测定定含含量量。如如蛋蛋白白质质的的含含量量测测定定，可可利利用用蛋蛋白白质质与与双双缩缩脲脲试试剂剂发发生生颜颜色色反反应应，而而进进行行定量测定。定量测定。2 2、UVUV法法：样样品品或或转转化化后后的的产产物物在在某某一一波波长长处处有有最最大大吸吸收收，在在一一定定的的浓浓度度范范围围内内，其其浓浓度度与与吸吸收收度度成成正正比比，则则可可进进行行定定量量测测定。如蛋白质在定。如蛋白质在280nm280nm左右有最大吸收左右有最大吸收 。3 3、荧荧光光分分光光光光度度法法：根根据据物物质质被被UVUV光光照照射后产生的荧光强度进行定量测定。射后产生的荧光强度进行定量测定。（四）色谱分析法（四）色谱分析法1 1、HPLCHPLC法法（1 1）RP-HPLCRP-HPLC法法：适适用用于于肽肽类类、氨氨基基酸酸、蛋白质和多糖的测定，如生白能。蛋白质和多糖的测定，如生白能。固定相：固定相：C8C8、C18C18烷基硅烷键合相烷基硅烷键合相流流动动相相：甲甲醇醇- -水水、乙乙腈腈- -水水（甲甲醇醇）、乙乙腈腈- -缓冲液缓冲液（2 2）高效离子交换色谱法（）高效离子交换色谱法（HPIECHPIEC） HPIEC HPIEC特点如下：特点如下： 蛋蛋白白质质、多多肽肽的的分分离离是是根根据据其其相相应应的的离子化程度而进行的。离子化程度而进行的。 分分离离过过程程是是以以盐盐浓浓度度增增大大的的梯梯度度洗洗脱脱法进行的法进行的 柱效中等并具较高质量的活性回收。柱效中等并具较高质量的活性回收。 （3 3）高效凝胶过滤色谱法（）高效凝胶过滤色谱法（HPGFCHPGFC） HPGFC HPGFC特点如下：特点如下： 活性蛋白质可得以回收。活性蛋白质可得以回收。 分离是在固定比例的水溶液中进行的。分离是在固定比例的水溶液中进行的。 分分离离是是根根据据蛋蛋白白质质或或多多肽肽在在溶溶液液中中相相应的有效粒径而进行的。应的有效粒径而进行的。2 2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE） HPCEHPCE是是根根据据带带电电组组分分在在管管中中由由于于其其所所带带电电荷荷和和分分子子量量的的大大小小，即即荷荷质质比比不同产生不同的迁移速度而分离。不同产生不同的迁移速度而分离。类类型型酶活力测定法酶活力测定法：以酶为分析对象，：以酶为分析对象，测定样品中某种酶的活力或活性，测定样品中某种酶的活力或活性，并用活力单位和比活性表示并用活力单位和比活性表示 。酶分析法酶分析法：以酶为分析工具或分析：以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外的其它物试剂，测定样品中酶以外的其它物质的含量。质的含量。二、酶法二、酶法（一）酶活力测定法（一）酶活力测定法 1 1、定义：、定义： 酶酶活活力力是是指指酶酶催催化化一一定定化化学学反反应应的的能能力力。酶酶活活力力的的测测定定实实际际上上是是测测定定一一个个被被酶酶所所催催化化的的化化学学反反应应的的速速度度可可以以用用单单位位时时间间反反应应底底物物的的减减少少或或产产物物的的增增加加来表示。来表示。2 2、方法、方法（1 1）终终点点法法：在在适适当当的的条条件件下下，把把酶酶和和底底物物混混合合，测测定定生生成成一一定定量量产产物物所所需需的时间。的时间。 （2 2）将将酶酶和和底底物物混混合合后后隔隔一一定定时时间间，间断地或连续地测定反应的连续变化。间断地或连续地测定反应的连续变化。（3 3）将将酶酶与与底底物物混混合合后后，让让其其反反应应一一定定时时间间，然然后后停停止止反反应应，定定量量测测定定底底物减少或产物生成的量。物减少或产物生成的量。 （二）酶分析法（二）酶分析法 1 1、动力学分析法：、动力学分析法： 通通过过条条件件控控制制，分分别别使使底底物物、辅辅酶酶活活化化剂剂或或抑抑制制剂剂的的浓浓度度在在酶酶反反应应中中起起决决定定反反应应速速度度的的主主导导作作用用。则则酶酶的的反反应应速速度度和和上上述述相相应应因因素素的的浓浓度度间间将将具具有有确确定定的的比比例例关关系系，通通过过测测定定酶酶反反应应速速度度即即可可求出它们的浓度。求出它们的浓度。2 2、总变量分析法（平衡法或终点法）：、总变量分析法（平衡法或终点法）： 根根据据被被测测物物质质（底底物物）的的性性质质，选选择择适适宜宜的的分分析析工工具具酶酶对对该该物物质质进进行行作作用用，在在反反应应完完成成后后，借借助助理理化化方方法法测测出出其其总总变变化化量量，并并参参考考反反应应的的平平衡衡点点，计计算算出出被测物的实际含量或浓度。被测物的实际含量或浓度。三、电泳法三、电泳法 （一）基本原理（一）基本原理 电电泳泳法法是是指指带带电电微微粒粒如如蛋蛋白白质质、核核苷苷酸酸、其其他他微微粒粒分分子子或或离离子子在在电电场场的的作作用用下下，向向其其对对应应的的电电极极方方向向按按各各自自的的速速度度泳泳动动而而使使组组分分分分离离，再再进进行行检检测测或或计计算百分含量的方法。算百分含量的方法。（二）电泳法的分类（二）电泳法的分类1 1、自由界面电泳：、自由界面电泳：在一根在一根U U形管里的溶形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。明显的界面。2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE）3 3、区区带带电电泳泳：在在电电泳泳过过程程中中，应应用用各各种种不不同同的的惰惰性性支支持持介介质质，在在电电场场作作用用下下，使使具具有有不不同同泳泳动动速速度度的的组组分分形形成成各各自自区区带带的的电电泳泳。常常用用的的支支持持物物有有：滤滤纸纸、醋醋酸酸 纤纤 维维 素素 薄薄 膜膜 、 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 凝凝 胶胶（PAGEPAGE）、十十二二烷烷基基硫硫酸酸纳纳- -聚聚丙丙烯烯酰酰胺凝胶（胺凝胶（SDS - PAGE SDS - PAGE ）。）。四、生物检定法四、生物检定法（一）基本原理（一）基本原理 生生物物检检定定法法是是利利用用药药物物对对生生物物体体（整整体体动动物物、离离体体组组织织、微微生生物物等等）的的作作用用以以测测定定其其效效价价或或生生物物活活性性的的一一种方法。种方法。（二）应用范围（二）应用范围1 1、药药物物的的效效价价：测测定定对对一一些些采采用用理理化化方方法法不不能能测测定定含含量量或或理理化化测测定定不不能能反反映映临临床床生生物物活活性性的的药药物物可可用用生生物物检检定定法法来来控控制制药药物物质质量量。如如洋洋地地黄黄、胰胰岛岛素素、肝肝素及各种抗生素。素及各种抗生素。 2 2、大分子结构的测定、大分子结构的测定 某某些些生生物物制制品品因因结结构构复复杂杂、分分子子量量大大，而而且且由由结结构构类类似似、比比例例不不定定的的多多种种成成分分组组成成，很很难难用用理理化化方方法法反反映映其其生生物物活活性性；某某些些药药物物虽虽可可用用理理化化方方法法测测定定含含量量，但但不不能能完完全全反反映映效效价价。以以上上药药物物均均采用生物检定。采用生物检定。3 3、微量生理活性物质的测定、微量生理活性物质的测定 一一些些神神经经介介质质，激激素素等等微微量量生生理理活活性性物物质质，由由于于其其很很强强的的生生理理活活性性，在在体体内内浓浓度度很很低低，加加上上体体液液中中各各种种物物质质的的干干扰扰，很很难难用用理理化化方方法法测测定定。而而不不少少活活性性物物质质的的生生物物测测定定法法因因灵灵敏敏度度高高、专专一一性性强，对供试品稍作处理即可直接测定。强，对供试品稍作处理即可直接测定。