高等生物化学高等生物化学主讲：董主讲：董 发发 才才植物逆境生物学重点实验室生命科学学院生命科学学院生命科学学院生命科学学院提提 纲纲、蛋白质学专题、蛋白质学专题、酶学专题、酶学专题、细胞信号转导专题、细胞信号转导专题、代谢专题、代谢专题、核酸专题、核酸专题、基因表达调控专题、基因表达调控专题、蛋白质学专题、蛋白质学专题1. 蛋白质的性质及分离纯化技术蛋白质的性质及分离纯化技术2. 蛋白质高级结构形成的分子机理蛋白质高级结构形成的分子机理3. 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能1. 蛋白质的性质及相关分离纯化技术蛋白质的性质及相关分离纯化技术蛋白质为两性电解质。蛋白质为两性电解质。在等电点时在等电点时，静电荷为零静电荷为零在电场中不移动；在电场中不移动；生物学活性最小；生物学活性最小；蛋白质的溶解度最小。蛋白质的溶解度最小。mn 带负电荷带负电荷mn 带正电荷带正电荷m=n 净电荷为零净电荷为零1.1 蛋白质的性质蛋白质的性质1. 蛋白质的性质及相关分离纯化技术蛋白质的性质及相关分离纯化技术蛋白质为大分子，其溶液具有胶体溶液蛋白质为大分子，其溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。等。u蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜、电荷和布朗运动。因素：水化膜、电荷和布朗运动。u改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。从溶液中沉淀出来。+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质蛋白质聚集聚集沉淀沉淀碱碱+ + + + + + +水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）常用的蛋白质分离纯化技术常用的蛋白质分离纯化技术溶解度溶解度盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀分子大小分子大小透析、超过滤透析、超过滤密度梯度离心、凝密度梯度离心、凝胶过滤胶过滤带电特性带电特性电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析吸附特性吸附特性吸附层析吸附层析对配体分子对配体分子的亲和性的亲和性依据性质依据性质方方 法法用于粗分用于粗分用于细分用于细分亲和层析亲和层析、金属、金属螯合层析螯合层析分配层析分配层析1.2 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography) 许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。 1. 2 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)u亲和层析的原理：亲和层析的原理： 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的的目的 。1.2 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体1.3 亲和层析的发展亲和层析的发展 -亲和标签法分离纯化蛋白质亲和标签法分离纯化蛋白质Affinity Tag:Affinity tags consist of proteins or peptides with distinct amino acid sequences that are capable of a reversible, high affinity binding interaction with a spacific partner molecule.Partner Molecule（Ligand）:The binding partner molecules can be small molecules (biotin, GST, metal ions et al), peptides, chitin, oligonucleotides and so on.1.3 亲和层析的发展亲和层析的发展 -亲和标签法分离纯化蛋白质亲和标签法分离纯化蛋白质1.3.1 构建含构建含Affinity tag的载体；的载体；1.3.2 将目的基因与载体重组；将目的基因与载体重组；1.3.3 融合基因在寄主细胞中表达；融合基因在寄主细胞中表达；1.3.5 破碎细胞，提取蛋白质混合物，亲和破碎细胞，提取蛋白质混合物，亲和柱分离融合蛋白；柱分离融合蛋白；1.3.4 将配体（将配体（Ligand）与大分子载体连接，）与大分子载体连接，构成亲和柱；构成亲和柱；1.3.6 切除标签序列，获得目的蛋白质。切除标签序列，获得目的蛋白质。1.3 亲和层析的发展亲和层析的发展 -亲和标签法分离纯化蛋白质亲和标签法分离纯化蛋白质3. 亲和层析的发展亲和层析的发展 -亲和标签法分离纯化蛋白质亲和标签法分离纯化蛋白质