1血清清蛋白的分离与电泳鉴定血清清蛋白的分离与电泳鉴定2临床意义临床意义1.1.血清清蛋白增高血清清蛋白增高 严重失水，血浆浓缩所致。严重失水，血浆浓缩所致。尚未发现单纯清蛋白浓尚未发现单纯清蛋白浓度升高的疾病。度升高的疾病。2.2.血清清蛋白降低血清清蛋白降低 急性清蛋白浓度降低主要急性清蛋白浓度降低主要见于大量出血和严重灼见于大量出血和严重灼伤。伤。 慢性清蛋白浓度降低主要慢性清蛋白浓度降低主要见于肝、肾疾病见于肝、肾疾病 3一、实验目的一、实验目的1.1.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实 验原理及操作技术。验原理及操作技术。2.2.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的方法和应熟悉醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的方法和应用。用。 4二、实验原理二、实验原理实验流程实验流程盐析盐析脱盐脱盐电泳电泳5常用的蛋白质分离纯化技术常用的蛋白质分离纯化技术溶解度溶解度盐析盐析、等电点沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀分子大小分子大小透析、超过滤透析、超过滤密度梯度离心、凝密度梯度离心、凝胶过滤胶过滤带电特性带电特性电泳、电泳、离子交换层析离子交换层析吸附特性吸附特性吸附层析吸附层析对配体分子对配体分子的亲和性的亲和性依据性质依据性质方方 法法用于粗分用于粗分用于细分用于细分亲和层析亲和层析、金属、金属螯合层析螯合层析6二、实验原理（二、实验原理（盐析盐析）在溶液中加入在溶液中加入在溶液中加入在溶液中加入中性盐中性盐中性盐中性盐使生物大分子沉淀析出的过程使生物大分子沉淀析出的过程使生物大分子沉淀析出的过程使生物大分子沉淀析出的过程称为称为称为称为“ “盐析盐析盐析盐析” ”。蛋白质水溶胶的稳定因素：蛋白质水溶胶的稳定因素：蛋白质水溶胶的稳定因素：蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜水化膜水化膜水化膜和和和和电荷电荷电荷电荷。中性盐的亲水性中性盐的亲水性中性盐的亲水性中性盐的亲水性大于大于大于大于蛋白质分子的亲水性。蛋白质分子的亲水性。蛋白质分子的亲水性。蛋白质分子的亲水性。1. 1. 破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，2. 2. 中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶中和电荷，破坏亲水溶胶7二、实验原理（二、实验原理（盐析盐析）溶溶解解度度盐浓度盐浓度Salting-outSalting-in+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱水化膜水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）分段盐析分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团极性基团的种类、数目的种类、数目以及排布的不同，其以及排布的不同，其水化层厚度水化层厚度不同，故盐析所需要的不同，故盐析所需要的盐浓度盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。分别沉淀。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱饱和度和度饱饱和和析出析出析出析出10二、实验原理（二、实验原理（脱盐脱盐凝胶层析凝胶层析）原理：原理： 1 1、分子量大的物质不能进入、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，胶粒子之间的空隙挤落下来，所以所以大分子物质迁移速度快大分子物质迁移速度快； 2 2、小分子物质要通过凝胶网、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以孔进入凝胶粒子内部，所以小小分子物质迁移速度慢分子物质迁移速度慢。二、实验原理（二、实验原理（电泳电泳） 以醋酸纤维薄膜为支持物，在以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6pH=8.6的巴比妥缓的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的冲液中，血清蛋白的PIPI均小于均小于8.68.6，带负电荷带负电荷，电泳，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。13三、实验步骤（三、实验步骤（盐析盐析） 取取2.5ml血清稀释液血清稀释液于于10ml刻度试管。刻度试管。 加入加入2.5ml饱和饱和(NH)SO溶液，溶液， 滴入后，立即摇匀，边加边摇滴入后，立即摇匀，边加边摇。 混匀后于室温中混匀后于室温中放置放置10min。 蒸馏水蒸馏水润湿润湿后的双层滤纸过滤，弃沉淀，后的双层滤纸过滤，弃沉淀，留滤液留滤液。14三、实验步骤（三、实验步骤（脱盐脱盐凝胶柱层析凝胶柱层析） G-25混匀后上柱混匀后上柱 一气呵成，无气泡，无断层。一气呵成，无气泡，无断层。 调流速调流速 20滴滴/min。 上液面与凝胶面齐平时，加样上液面与凝胶面齐平时，加样1ml滤液；再次齐平时，加蒸馏滤液；再次齐平时，加蒸馏水。收集洗脱液，每管水。收集洗脱液，每管15-20滴。滴。全程凝胶柱不能干！全程凝胶柱不能干！ 检测。检测。 一同学收集，另一检测。一同学收集，另一检测。 收集液收集液一半一半用用10%三氯醋酸检测，三氯醋酸检测，沉淀最多的电泳沉淀最多的电泳。 继续蒸馏水，用继续蒸馏水，用1%BaCl2检测无白色后封柱。检测无白色后封柱。三、实验步骤（三、实验步骤（电泳电泳） 画点样线画点样线无光泽面无光泽面，距一端，距一端2cm2cm铅笔画点样线。铅笔画点样线。 浸泡薄膜后，滤纸拭干。浸泡薄膜后，滤纸拭干。 点样点样蘸蘸层析液层析液于点样线于点样线上方上方（量多），血清下方（量多），血清下方（1-2mm1-2mm高度）高度）垂直点样，立刻提起垂直点样，立刻提起。2cm粗糙面粗糙面姓名姓名层析液层析液血清血清三、实验步骤（三、实验步骤（电泳电泳） 搭桥搭桥 点样端于负极点样端于负极，平衡，平衡5min 5min 后通电。后通电。电泳电泳100V100V，30min30min 氨基黑氨基黑10B10B染色，染色，5min5min。 漂洗漂洗2 2次，每次次，每次3min3min。除漂洗液外，其余溶液均回收。除漂洗液外，其余溶液均回收。影响电泳速度的因素（1）样品本身：带电量、分子大小、形状。）样品本身：带电量、分子大小、形状。 Q越多，越多，V越大；越大；r越小，越小，V越大；越大； 球形分子球形分子纤维状纤维状（2）电场强度：）电场强度：X越大，越大，V越大越大（3）缓冲液：）缓冲液： pH 决定决定Q，(pH-PI)越大，越大，Q越多，越多，V越大越大三、实验结果三、实验结果结果分析 2 1-+层析液层析液结果血清血清实验名称实验名称 摘要（目的、方法、结果、结论）摘要（目的、方法、结果、结论） 实验目的实验目的 实验原理实验原理 操作要点（主要步骤）操作要点（主要步骤） 实验结果实验结果 结论和讨论结论和讨论（结果分析、思考题等）（结果分析、思考题等）实验三实验三 过氧化氢酶过氧化氢酶KmKm的测定的测定预预 习习