第六章生物分析中的探针 6.1 离子探针与分子探针概述离子探针与分子探针概述 6.1.1 离子探针离子探针生命过程是一个非常复杂的过程,研究生物大分子结构与功能以及生物分子的转化是研究生命过程的一个重要步骤。生物体中的许多酶和蛋白质就是含金属离子的生物功能大分子。例如：羧肽酶含Zn、磷酸脂酶含Mg、Cu和Zn、氨肽酶含Mg和Zn、钙蛋白酶含Ca、铜蓝蛋白酶含Cu。研究表明,大多数酶都要靠金属离子表现其活性,而且所有生物功能也都与金属离子有关。这种金属离子称为“生命金属生命金属”。人们可以通过研究这些生物体中的金属离子来研究生物分子的结构、性能和功能。生物分析中的探针由于生物大分子中的生命金属离子如Ca()、Mg()、Zn()等,具有惰性气体的电子结构。且在生物体内处在溶液状态,不成晶体,没有适宜的光、磁信号,也不可以用X射线技术研究成键状况和结构变化。而过渡金属离子Cu()、Fe()等都有不成对d电子,有光或磁信号可供研究。如果将生物大分子中非过渡金属离子用具有光、磁信息的过渡金属离子置换,用它们与生物大分子的相互作用与行为来探察非过渡金属离子的功能,这种技术称为“离子探针技术离子探针技术”。所用的过渡金属离子就叫“离子探针离子探针”。生物分析中的探针 6.1.2 分子探针分子探针对于脱氧核糖核酸(DNA)片段检出、医学上的基因诊断疾病、DNA片段碱基对序列分析和蛋白质的分离检出等,由于碱基和蛋白质信号很弱,又无上述生命金属,则须用信号较强的分子以共价键或氢键与生物共价键或氢键与生物大分子连接并赋予生物大分子较强信号大分子连接并赋予生物大分子较强信号,以利于高灵敏度检测。这种技术称为“分子探针技术分子探针技术”。所用的有较强信号的分子称为“分子探针分子探针”。例如：四甲基罗丹明、德克萨斯红、1-硝基-4-二甲氨基苯并恶二唑、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、4,5-二氨基荧光素等有机物都是较好的分子荧光探针(即检测信号是分子荧光)。有机分子探针按结合方式可分为嵌入、衍生、交联和络合等。 生物分析中的探针 6.1.3 离子探针的生物与化学依据离子探针的生物与化学依据(1)化学依据化学依据从配位化学的概念出发,具有惰性气体的电子结构的离子如Ca()、Mg()、Zn()等,与大分子配体易形成配合物。因此探针离子应与它们有相同或相似的物理化学参数。如：离子电荷数、离子半径、化学配位性质、立体化学行为。Mg()和Mn()、Zn()和Co()、Ca()和Gd()、Eu()、Tb()各自的理化参数相似,后者可分别做前者的离子探针。参数如下：离子探针离子探针 K() Tl() Zn() Co() Mg() 离子半径离子半径(nm) 0.133 0.140 0.069 0.072 0.055 静电位静电位(Z2/r) 0.75 0.67 4.80 4.88 5.12 离子探针离子探针 Mn() Ca() Gd() Eu() Tb() 离子半径离子半径(nm) 0.088 0.099 0.0938 0.095 0.0923 静电位静电位(Z2/r) 4.40 3.78生物分析中的探针生命金属离子生命金属离子 易配位基团易配位基团K() O、中性氧配位体、中性氧配位体Mg() 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体Ca() 羧酸盐、磷酸盐、多齿状氧与氮配位体羧酸盐、磷酸盐、多齿状氧与氮配位体Mn() 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体Fe() 氮配位体氮配位体Fe() 羧酸基、酪氨酸、卟啉羧酸基、酪氨酸、卟啉Cu() 胺类、硫配体胺类、硫配体Cu() 氮配位体氮配位体Zn() 咪唑、半胱氨酸咪唑、半胱氨酸Cd() 半胱氨酸、巯基半胱氨酸、巯基生物分析中的探针(2)生物依据生物依据探针离子置换原金属离子后,生物分子的基本性质必须不产生变化,也就是说,置换后的生物大分子的基本活性能被保留,还必须具有特征信号以供检测,这就是生物依据。例如：a)Mn()取代苹果酸酶中的Mg()后,该酶同样具有催化L苹果酸脱羧的反应活性。b)Co()取代碳酸酐酶、羧肽酶、乳酸脱氢酶中的Zn(),这些酶的活性分别为原来酶活性的50%、160%和有活性。c)Gd()、Eu()或Tb()取代伴刀豆球蛋白A中的Ca(),该蛋白仍然保持结合糖的的活性。生物分析中的探针 6.2 离子探针基本类型离子探针基本类型离子探针按其表达信息的特征可分为紫外可见光吸收光谱探针、磁共振探针、荧光光谱探针、穆兹堡尔谱探针。 6.2.1 紫外可见光吸收光谱探针紫外可见光吸收光谱探针利用探针离子的d-d或f-f电子跃迁以及荷移跃迁吸收光谱的变化和测定,判断生物分子与金属离子的配位立体结构。例如：Co()取代碳酸酐酶中的Zn()后,由吸收光谱的变化推断出该酶中的Zn()结合部位是一个变形的四面体。X射线分析也证实了这一点。三价稀土离子是优良的Ca()的吸收光谱探针,尤其是Nd(),摩尔吸光系数最大,很灵敏。可以用其光谱研究牛血清蛋白、谷氨酸合成酶、胰蛋白酶、铜蛋白超氧化酶。之所以有较大的吸收系数是因为配位体较大的不对称性造成的。生物分析中的探针 6.2.2磁共振探针磁共振探针磁共振探针又可分为核磁共振探针和顺磁共振探核磁共振探针和顺磁共振探针两种针两种。探针离子置换后,可进行NMR测定,根据化学位移、偶合常数及与傅里叶变换、二维谱、NMR成象技术的结合,着重研究1H、15N、31P的NMR谱,它是生物化学的重要工具之一。用Tl()取代生命金属K(),研究205Tl的NMR,是了解K()的生命功能的重要方法。兔肌肉丙酮酸激活酶的生命作用就是用此方法进行研究的。顺磁共振可测定金属离子中未成对电子形成的磁未成对电子形成的磁性质和磁参数性质和磁参数。从而可获得原金属离子的共价键、配体的性能、金属离子的氧化还原状态、立体化学结构的信息。生物分析中的探针 6.2.3荧光光谱探针荧光光谱探针荧光光谱探针又可分为有机荧光探针(即分子荧光探针)和离子荧光探针。探针离子具有荧光特征,与生物大分子结合后,其荧光特征,如：激发波长、发射波长、荧光强度、荧光寿命、荧光量子产率、各向异性等都会发生变化,从而获得生物大分子的信息。目前用得最多的是稀土离子深针。如Ru(Phen)3(邻菲罗啉)2+、Tb(EDTA)-。生物分析中的探针 6.2.4穆兹堡尔谱探针穆兹堡尔谱探针穆兹堡尔谱探针须采用穆兹堡尔谱仪测定。它有三个重要参数：化学位移、四极超精细分裂和兹曼(Zeeman)效应。(1)化学位移化学位移它反映最邻近原子的电负性和成键的离子特征。这和NMR、光电子能谱等的化学位移的特征有类似之处。(2)四极超精细分裂四极超精细分裂它主要反映了原子中电荷的分布,判断极性的大小和方向。生物分析中的探针 (3)兹曼兹曼(Zeeman)效应效应兹曼(Zeeman)效应可以分辨出潜在自旋状态间的电荷分布差异。可用穆兹堡尔谱仪测定的核不多,151Eu是可测核之一。其同位素天然丰度为47.8%,Eu()比Eu()的化学位移大,而且对配位环境较为敏感,是一个很好的穆兹堡尔探针。而57Fe可用于血红蛋白、肌红蛋白、氧化型菠菜铁氧化蛋白的研究。但由于57Fe同位素自然丰度低,需要进行富集。生物分析中的探针 6.3 稀土稀土(络合物络合物)离子荧光探针的应用离子荧光探针的应用在水溶液中,稀土离子仅有Tb()、Eu()是有荧光的。用488nm的激发光源使Tb()产生荧光,其最大发射波长为545nm,荧光寿命为荧光寿命为0.45ms；用575nm的激发光源使Eu()产生荧光,其最大发射波长为612nm,在水溶液中荧光寿命为0.11.0ms、非水溶液中为非水溶液中为22.5ms、在在氘代溶剂中为氘代溶剂中为44.5ms。且与温度无明显关系。生物分析中的探针 6.3.1稀土离子荧光探针研究蛋白质稀土离子荧光探针研究蛋白质用Eu()、Tb()为探针研究蛋白质中的球蛋白,其荧光特征可分为两类：(1)A类蛋白类蛋白A类蛋白的最大发射波长约为304nm。它表现了酪氨酸蛋白质酪氨酸蛋白质的荧光特性,表明其不含色氨酸残基,但含有苯丙氨酸和酪氨酸残基,这类蛋白包括胰岛素、卵类黏蛋白等。此类蛋白的荧光最大波长不受蛋白质分子空间构象变化的影响。生物分析中的探针(2)B类蛋白类蛋白含有色氨酸同时含有苯丙氨酸和酪氨酸残基苯丙氨酸和酪氨酸残基的蛋白,称之为“B类蛋白”,如人的血清白蛋白、酪蛋白、卵黄高磷蛋白、淀粉酶、凝血酶、牛脑S100蛋白等。这类蛋白质表现色氨酸残基色氨酸残基的荧光光谱特征。主要特征是荧光光谱对环境的极性非常敏感荧光光谱对环境的极性非常敏感,在极性和在极性和非极性环境中非极性环境中,光谱差异很大光谱差异很大。这表明,其光谱与蛋白质的三维空间结构关系密切。稀土探针离子的引入蛋白值的部位不同,其周围环境也不同,所以会引起蛋白质分子许多构象形式的变化构象形式的变化,荧光光谱也就多样化荧光光谱也就多样化。在常温下,虽然结合部位不同,但因为晶体场的时间平均效应,探针荧光寿命只有一个值。在液氮低温下,生物大分子结构因冻结使不同部位的探针离子各处于不同的晶体场中,此时构象的弛豫时间大于探针寿命,因此,各部位寿命的差异就会显现,寿命不是一个固定值寿命不是一个固定值,而呈概率分布。其至会产生荧光猝灭现象。这些现象必和生物大分子的构象有关。生物分析中的探针测定钙调蛋白(CaL)的酪氨酸残基敏化的Tb()在545nm荧光的强度有增敏作用,根据光谱曲线,其强度随Tb()/CaL比值而变化。有4个峰值,表明CaL可结合4个Tb(),结合部位可分为2个强结合部位(弱的荧光敏化作用)和2个弱结合部位(强的荧光敏化作用)。Tb()探针离子在545nm的荧光强度随比值Tb()/牛脑S100蛋白的改变而变化。在1:2之前,是增函数；到达2之后,荧光强度基本不变。可见牛脑S100蛋白具有两个结构类型相同的结合部位。此点与用光度法测配合物组成原理相似。生物分析中的探针 6.3.2 稀土离子荧光探针研究核酸稀土离子荧光探针研究核酸核酸可用分子荧光探针碘丙锭、溴乙锭、吖啶、YOTO菁近红外染料和其它探针二乙三胺五乙酸、N(2-羟乙基)乙二胺三乙酸、联吡啶等进行研究。Tb()也可作离子荧光探针用于核酸的研究。Tb()与核苷、核苷酸、聚核苷酸形成的络合物可使Tb()的545nm荧光强度增强。一般讲增强的次序为：鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶腺嘌呤。具体增幅如下：聚脱氧肌苷酸(13%)、聚脱氧腺苷酸(18%)、寡聚肌苷酸(18%)、聚腺苷酸(24%)、聚脱氧胞苷酸(53%)、聚脱氧鸟苷酸(103%)、聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(113%)、聚胞苷酸(210%)、聚鸟苷酸(224%)。 生物分析中的探针6.3.3 稀土离子荧光探针在药物分析中的应用稀土离子荧光探针在药物分析中的应用用Eu()为探针,它可以与抗菌素四环素系列药物等含氧和氮配位原子的芳香有机配体药物形成配合物,四环素等药物的宽谱峰消失,出现了很强的窄峰,则荧光强度提高了10倍,可用于生物样品中四环素药物的含量测定。可用于测定血清和生物体液中的四环素类药物,检出限可达0.110gmL-1。用Tb()为探针,可测量生物样品(血样)中的氟喹诺酮类药物氟诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、葡萄糖酸依诺沙星,检出限可达0.017gmL-1。还可测定尿中的乳清酸,检出限为1.010-8molL-1；测定血浆中的水杨酸；测定生物混合样品中的L多巴胺,检出限为5.010-95.010-6molL-1；测定尿中的促蛋白甾类化合物,检出限为0.011.0ngg-1。还可以用Eu()、Tb()为探针测定茶碱。生物分析中的探针 6.3.4 稀土络合物离子荧光探针稀土络合物离子荧光探针络合物离子荧光探针是指络合物离子荧光探针是指Eu()、Tb()等稀土金属离子与小分子螯合剂等稀土金属离子与小分子螯合剂形成配合物作为探针形成配合物作为探针。络合物的激发态寿命较长,可达数ms,而且强度很强。(1)稀土金属络合物离子荧光探针中螯稀土金属络合物离子荧光探针中螯合剂的分类合剂的分类根据稀土金属离子的络合性能,稀土络合物离子荧光探针中螯合剂可分为四类。生物分析中的探针 a)氨羧螯合剂氨羧螯合剂这类螯合剂主要有EDTA、N,N-二(2-羟乙基)乙二胺-N,N-二乙酸(HEDDA)、N-2羟乙基乙二胺-N、N-三乙酸(HEDTA)、二乙三胺-N,N,N-五乙酸(DTPA)。探针分别为Tb(EDTA)-、Tb(HEDDA)+、Tb(HEDTA)、Tb(DTPA)2-。在荧光免疫分析中要用到的具有双功能的EDTA类衍生螯合剂：异硫氰酸-苯基-乙二胺四乙酸(ITEDTA)、N-对异硫氰酸-苯基-二乙三胺四乙酸(ITDTTA,1)、二乙三胺五乙酸酐(CDTPAA,2)等,它们除含有能络合Eu()、Tb()等稀土离子的氨羧基团外,还含有与蛋白质、肽的氨基反应的异硫氰酸或酸酐活性基团,它们能将稀土离子牢固地结合在蛋白质的氨其上,在荧光增强液如-二酮溶液作用下,检测蛋白质。生物分析中的探针b)芳香羧酸螯合剂芳香羧酸螯合剂这类螯合剂主要是水杨酸、苯甲酸及其衍生物：2,6-吡啶二羧酸、2,2-联吡啶、2,2,2”-三吡啶和邻菲罗啉类的羧酸衍生物。它们与Eu()、Tb()等稀土离子的络离子可作分荧光探针和时时间分辨荧光免疫分析的标记试剂间分辨荧光免疫分析的标记试剂。其中4,7-双(氯磺酸基苯)-1,10-邻菲罗啉-2,9-二羧酸(BCPTA,3)、4-2-(4-异硫氰酸苯基)乙基-2,6-双N,N-双(羧甲基)乙氨基吡啶等衍生物都是双功能基团的螯合剂。芳香羧酸稀土离子络合物有很强的荧光,不需加荧光增强液或协同试剂,可直接测量荧光强度。生物分析中的探针c)-二酮类螯合剂二酮类螯合剂 如：乙酰丙酮等。d)袋状、笼状或穴状及杯芳烃大环配袋状、笼状或穴状及杯芳烃大环配位体位体穴醚2.2.1、联吡啶笼形化合物、含邻菲罗啉的冠烯类大环化合物、杯4芳烃等、袋状化合物二胺三联吡啶(TBD)可以作为核酸探针。Eu()-TBD络合物很稳定。因为TBD分子的穴孔与Eu()的半径大小成最佳匹配。体系中的其它离子半径不匹配,不干扰。生物分析中的探针(2)稀土络合物离子荧光探针的应用稀土络合物离子荧光探针的应用博莱霉素是一种抗生素类抗癌药。其抗癌机理是：博莱霉素的连二噻唑基团插入DNA的碱基对之间以及糖肽基团与金属离子络合物的结合部位,从而使DNA链发生断裂。应用稀土络离子荧光探针Tb(HEDTA),采用迅速扩散能量转移方法研究了博莱霉素A2与钴()形成的橙色橙色和绿色绿色的钴()-博莱霉素A2络合物,发现它们与DNA的亲和力、在癌肿瘤中的聚集及促进光诱导切刻DNA等方面都存在明显的差异。钴()-博莱霉素A2络合物与DNA的亲和力的研究：首先用溴化乙锭为接受体,能量转移速率常数为0.27。表明溴化乙锭嵌入DNA后的外露部分很小,荧光探针Tb(HEDTA)与它接触受到空间位阻影响。生物分析中的探针接受体改为橙色钴橙色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合物络合物时,能量转移速率常数为0.71,比溴化乙锭的速率常数大得多。表明橙色钴橙色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合物络合物嵌入DNA后,荧光探针Tb(HEDTA)与络合物中心接触受到的空间位阻影空间位阻影响不大响不大。相互间可以有较高程度地接触。因而,橙色钴橙色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合物络合物与DNA接触程度比溴化乙锭差。接受体为绿色钴绿色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合物络合物时,能量转移速率常数为0.48。比橙色钴橙色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合络合物物的速率常数小。表明绿色钴绿色钴()-博莱霉素博莱霉素A2络合物络合物嵌入DNA后,荧光探针Tb(HEDTA)与络合物中心接触受到空间位阻影响增大。即绿色绿色钴()-博莱霉素A2络合物比橙色橙色钴()-博莱霉素A2络合物更接近DNA。绿色钴()-博莱霉素A2络合物对DNA有更强的促进光诱导切刻能力。效果更好。生物分析中的探针