离子注入微生物诱变育种离子注入微生物诱变育种姜巍姜巍2013E80041610572013E8004161057过程所过程所2离子注入微生物诱变育种离子注入微生物诱变育种 背景背景特点特点工业应用工业应用具体方法具体方法展望展望背景背景3背景背景 离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明。已经证实离子注入诱变一种新发明。已经证实离子注入诱变, ,可以获得高可以获得高突变率突变率, ,扩大突变谱扩大突变谱, ,为筛选优良的突变型菌株提为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间供广阔的空间; ;同时同时, ,离子束也可以作为介质进行离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。外源目的基因转移和转导。 近十年来近十年来, ,人们大量研究了离子注入微生物诱人们大量研究了离子注入微生物诱变育种情况变育种情况, ,并已获得了酶、抗生素和菌体物质等并已获得了酶、抗生素和菌体物质等代谢产物的高产、优良菌株。探索了以离子束为代谢产物的高产、优良菌株。探索了以离子束为介导的微生物基因组介导的微生物基因组DNA DNA 的转基因研究的转基因研究, ,使微生物使微生物基因重组育种技术得以完善和补充基因重组育种技术得以完善和补充, ,拓宽了微生物拓宽了微生物育种的方法。育种的方法。4特点1.正突变菌体的高效性离子注入诱变育种的四大特点离子注入诱变育种的四大特点, ,表明表明了其是一种物理效应、化学效应了其是一种物理效应、化学效应, ,是集化是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。它能够引起染色体的畸变法。它能够引起染色体的畸变, ,导致导致DNA DNA 链碱基的损伤、断裂链碱基的损伤、断裂 , ,从而使遗传物质从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺在基因水平或分子水平上发生改变或缺失失, ,大幅提高变异的频率大幅提高变异的频率特点2.菌体细胞表面刻蚀性 离子注入生物体的动量传递离子注入生物体的动量传递, ,可以根据直观的可以根据直观的表面现象进行观察、研究表面现象进行观察、研究, ,注入的离子就像注入的离子就像“手术手术刀刀”对细胞表面进行刻蚀对细胞表面进行刻蚀, ,留下非常整齐的创面。留下非常整齐的创面。动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射, ,造成细胞形态的变异。具体表现到植物细胞为细造成细胞形态的变异。具体表现到植物细胞为细胞壁减薄、细胞膜损伤胞壁减薄、细胞膜损伤, ,甚至大剂量时细胞破裂、甚至大剂量时细胞破裂、死亡死亡67特点3菌体存活曲线呈“马鞍型” 存活率是微生物育种中常测指标存活率是微生物育种中常测指标, ,存活曲存活曲线是存活率的趋势直观表现。传统的物理、线是存活率的趋势直观表现。传统的物理、化学诱变方法化学诱变方法(UV(UV、- ray- ray、EMSEMS、DMS) DMS) 均均产生指数型或肩型的存活曲线产生指数型或肩型的存活曲线, ,而离子注入诱而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的变的存活曲线为先降后升再降的“马鞍型马鞍型”。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效物学效8特点具体方法1离子注入装置离子注入机 中科院等离子体物理研究的一台小型的中科院等离子体物理研究的一台小型的ECRECR离子源装离子源装置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室和束流积分仪七部分构成。具有壁溅射低、离化率高、和束流积分仪七部分构成。具有壁溅射低、离化率高、工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测定精确等特。离子源的直流放电或高频放电产生的电子定精确等特。离子源的直流放电或高频放电产生的电子作为轰击粒子作为轰击粒子, ,当外来电子的能量高于原子的电离电位时当外来电子的能量高于原子的电离电位时, ,通过碰撞使元素发生电离通过碰撞使元素发生电离, ,碰撞后除原始电子外碰撞后除原始电子外, ,还出现还出现正离子和二次电子。正离子进入质量分析器选出需要的正离子和二次电子。正离子进入质量分析器选出需要的离子离子, ,再经加速器获得较高的能量再经加速器获得较高的能量 , ,由四极透镜聚焦后进由四极透镜聚焦后进入室入室, ,进行离子注入。作量范围因注入机的不同而有差异进行离子注入。作量范围因注入机的不同而有差异。9具体方法2离子注入微生物的方法微生物诱变育种微生物诱变育种, ,一般采用生理状态一致一般采用生理状态一致, ,处于处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理。这样才对数生长期菌体的单细胞进行理化处理。这样才能使菌体均匀接触诱变剂能使菌体均匀接触诱变剂, ,减少了分离现象的发生减少了分离现象的发生, ,获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体, ,则则利用孢子来诱变。同样利用孢子来诱变。同样, ,离子注入微生物育种也符离子注入微生物育种也符合该规律合该规律10具体方法 首先首先, ,取培养活化的菌体种子液或斜面活取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释化的菌苔进行稀释, ,一般是一般是10 - 2 10 - 2 10 - 3 10 - 3 的稀的稀释度释度, ,菌体浓度为菌体浓度为108108109 109 个个PmL PmL 为宜为宜; ;然后然后, ,吸吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片(2 3 (2 3 3cm) 3cm) 或无菌培养皿上或无菌培养皿上, ,显微镜检验保证无重叠细显微镜检验保证无重叠细胞胞, ,自然干燥自然干燥( (约约10min) 10min) 或用无菌风吹干形成菌膜或用无菌风吹干形成菌膜; ;放入离子注入机的靶室放入离子注入机的靶室( (具有一定的真空度具有一定的真空度) ) 进进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和空气对照。空气对照。11具体方法 还有涂孢还有涂孢( (胞胞) ) 法和培养法法和培养法, ,前者是将稀释的前者是将稀释的菌体或孢子悬液涂布于合适的琼脂平皿上菌体或孢子悬液涂布于合适的琼脂平皿上, ,尽量减尽量减少细胞重叠少细胞重叠, ,置于离子注入机靶室置于离子注入机靶室, ,抽真空进行离抽真空进行离子注入子注入; ;培养法是将菌悬液接种培养基平皿上培养法是将菌悬液接种培养基平皿上, ,待待长出菌落并产生大量孢子后长出菌落并产生大量孢子后, ,将平皿置于离子器靶将平皿置于离子器靶室室, ,抽真空后荷能离子注入诱变抽真空后荷能离子注入诱变, ,常使用于具有菌常使用于具有菌丝的微生物丝的微生物 , ,但是不能保证菌体的高活性。一般但是不能保证菌体的高活性。一般常用干孢法或菌膜法处理进行离子注入常用干孢法或菌膜法处理进行离子注入, ,且效果最且效果最佳佳12工业应用1 1、发酵工业上、发酵工业上, ,以高产菌株为出发菌株进行诱变以高产菌株为出发菌株进行诱变, ,提高发酵产物收率和品质提高发酵产物收率和品质, ,一直是工业单位的常用一直是工业单位的常用手段。但传统诱变方法的多次诱变往往导致负突手段。但传统诱变方法的多次诱变往往导致负突变和抗性饱和。而离子注入却能打破此瓶颈变和抗性饱和。而离子注入却能打破此瓶颈, ,获得获得以目标产物为目的的高产、优良菌株。以目标产物为目的的高产、优良菌株。2 2 、菌源性酶工程方面、菌源性酶工程方面, ,离子注入诱变成功的选育离子注入诱变成功的选育了多种酶的高产菌株。了多种酶的高产菌株。13工业应用3 3、生物工程研究领域、生物工程研究领域, ,离子束作为介导转导外源离子束作为介导转导外源目的目的DNA DNA ，在植物转基因方面已获得了表达。近，在植物转基因方面已获得了表达。近几年先后得到转几年先后得到转GUS GUS 基因的水稻、转绿色荧光蛋基因的水稻、转绿色荧光蛋白基因的小麦和转水稻几丁质酶的小麦植株。但白基因的小麦和转水稻几丁质酶的小麦植株。但离子注入介导转基因在微生物方面的研究甚少离子注入介导转基因在微生物方面的研究甚少, ,宋宋 道军等首次报道了以离子注入为介质将耐辐射异道军等首次报道了以离子注入为介质将耐辐射异球菌的基因组球菌的基因组DNA DNA 片段成功转到对片段成功转到对UV UV 敏感敏感E1coli E1coli 菌株中菌株中, ,耐辐射异耐辐射异球菌菌株的外源耐辐射基因在其球菌菌株的外源耐辐射基因在其体内得以表达。开创了离子束转基因在微生物中体内得以表达。开创了离子束转基因在微生物中的应用的应用, ,使基因重组技术在微生物育种中更加完善。使基因重组技术在微生物育种中更加完善。14展望15 离子注入微生物育种具有更多的优点和发离子注入微生物育种具有更多的优点和发展潜力。离子注入的种类需要拓宽应用的范围展潜力。离子注入的种类需要拓宽应用的范围, ,而而不能只局限于几种离子不能只局限于几种离子(H+ ,N+ ,Ar + ) (H+ ,N+ ,Ar + ) 。菌体。菌体细胞的前期处理细胞的前期处理, ,以菌膜法或干孢法为主进入真空以菌膜法或干孢法为主进入真空的靶室诱变的靶室诱变, ,此环境对孢子活性影响不大此环境对孢子活性影响不大, ,但对细但对细菌的菌体细胞活性就难以评价菌的菌体细胞活性就难以评价, ,何况无菌体保护剂何况无菌体保护剂, ,温度小于温度小于50 50 , ,脉冲注入次数多少不一脉冲注入次数多少不一, ,注入时注入时间长短因种而异。故很难保证菌体的高活性间长短因种而异。故很难保证菌体的高活性, ,所以所以注入方法需进一步探索。注入方法需进一步探索。展望展望 离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科, ,显现了巨大的优势。离子注入集化学诱变和物理显现了巨大的优势。离子注入集化学诱变和物理诱变于一身诱变于一身, ,突变率高、操作简单。加之离子束介突变率高、操作简单。加之离子束介导转基因的可能性导转基因的可能性, ,使其在微生物育种中更具有目使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的深入的性和针对性。随着研究程度的深入, ,研究范围的研究范围的拓宽拓宽, ,相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用的作用16参考文献： 1 1 余增亮余增亮, ,邱励俭邱励俭, ,霍裕平霍裕平1 1 离子注入生物效应及离子注入生物效应及育种研究进展育种研究进展J 1 J 1 安徽农学学报安徽农学学报,1991 ,18(4) ,1991 ,18(4) :2251 - 2571:2251 - 2571 2 2 许安许安, ,姚建铭姚建铭, ,余增亮余增亮1 1 离子注入维生素离子注入维生素C C 二步二步发酵混合菌研究发酵混合菌研究( I) 2- ( I) 2- 酮基酮基- L - - L - 古龙酸高产古龙酸高产菌系菌系IPPM - 1028 IPPM - 1028 的选育的选育J 1 J 1 工业微生物工业微生物1998 1998 ,28 (4) :21 - 231,28 (4) :21 - 231 3 3 宋道军宋道军, ,余汛余汛1 1 离子介导转基因提高离子介导转基因提高E1coli UV E1coli UV 敏感菌株敏感菌株DNA DNA 损伤损伤修复能力修复能力J 1 J 1 科学通报科学通报,1999 ,1999 ,44(18) :330 - 3341,44(18) :330 - 3341 4 4 宋道军宋道军, ,吴丽芳吴丽芳, ,陈若雷陈若雷, ,等等1N + 1N + 束和束和- - 射线射线对两种损伤效应的对两种损伤效应的J 1 J 1 激光生物学报激光生物学报,2000 ,2000 ,9(2) :89 -1931,9(2) :89 -193117谢谢！18