生化与分子生物学技术生化与分子生物学技术1实验室秩序实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日）（时间，物品保管，工作服，分组与值日）仪器与设备的使用仪器与设备的使用实验室安全环保实验室安全环保实验室管理与操作规程实验室管理与操作规程2实验二 apoB基因多态性分析-PCR产物电泳检测3 电泳的概念电泳的概念 带电粒子粒子（胶体（胶体颗粒、离子等）在粒、离子等）在电场的作用下在特定的的作用下在特定的介介质中向与其中向与其电荷性荷性质相反相反的的电极方向定向泳极方向定向泳动的的现象。象。 广泛广泛应用于生物大分子的分离和用于生物大分子的分离和鉴定定4 实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）（以介质分类） 纸电泳泳 醋酸醋酸纤维膜膜电泳泳 凝胶凝胶电泳泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 5 电泳的基本原理电泳的基本原理利用物利用物质的两个差异来分离物的两个差异来分离物质电电荷差异荷差异荷差异荷差异 电荷性质电荷性质电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量电荷数量电荷数量分子差异分子差异分子差异分子差异 分子大小分子大小分子大小分子大小 分子形状分子形状分子形状分子形状6琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中分子在碱性缓冲液中带负电荷带负电荷，在外加电场作用，在外加电场作用下向正极泳动下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带DNA显色剂多用显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在，它能和碱基间的氢键结合，在波长为波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。）的荧光。DNA琼脂糖电泳基本原理琼脂糖电泳基本原理71.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素DNA分子的大小构象凝胶浓度电压缓冲液81.2 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-29一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查10二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。11三、上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。12基因组基因组DNA电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），），6X加样缓加样缓冲液冲液 ： 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，30%甘油水溶液甘油水溶液实验材料实验材料13PCR-apoBPCR-apoB基因多态性产物的鉴定基因多态性产物的鉴定取取PCR产物全部产物全部上上样14325671.5%胶，电泳（胶，电泳（80mA, 120min）1：Marker2：待测样品：待测样品13：待测样品：待测样品24: 待测样品待测样品35: 待测样品待测样品46: 待测样品待测样品57：待测样品：待测样品6-DNA-DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果14琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%胶胶3mm、凝固后拔梳）、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样（倒缓冲液，加样（取基因组取基因组DNA样品液样品液8l+2l上样缓冲液（上样缓冲液（5），混匀），混匀, 上样上样 ）电泳（恒压电泳（恒压100V 1小时）小时）检测（紫外检测）检测（紫外检测）四四. .操作步骤操作步骤 （1 1人人1 1孔）孔）其余其余DNA样品交样品交给老师保存，以给老师保存，以后实验用。后实验用。15有关有关PCRPCR反应反应PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200mol/L引物 各10100pmolTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L模板DNA 0. .12g16有关有关PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理17PCRPCR技术的创建技术的创建一、最初的理论描述一、最初的理论描述KhoranaKhorana Khorana Khorana (1971)(1971)等等最最早早提提出出核核酸酸体体外外扩扩增增的的设设想想：“经经DNADNA变变性性，与与合合适适的的引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该该过过程程便便可可合合成成tRNAtRNA基因。基因。”但但由由于于当当时时基基因因序序列列分分析析方方法法尚尚未未成成熟熟，热热稳稳定定DNADNA聚聚合合酶酶尚尚未未报报道道以以及及引引物物合合成成的的困困难难，这这种种想想法法似似乎乎没没有有实实际际意意义义。加加上上7070年年代代初初分分子子克克隆隆技技术术的的出出现现提提供供了了一一种种克克隆隆和和扩扩增增基基因因的的途途径径，所所以以，KhoranaKhorana的的设设想想被被人人们们遗遗忘忘了了18二、二、PCRPCR技术的发明技术的发明Kary MullisKary Mullis19851985年年，Kary Kary MullisMullis在在CetusCetus公公司司工工作作期期间间，发明了发明了PCRPCRMullisMullis要要合合成成DNADNA引引物物来来进进行行测测序序工工作作，却却常常为没有足够多的模板为没有足够多的模板DNADNA而烦恼而烦恼19831983年年4 4月月的的一一个个星星期期五五晚晚上上，他他开开车车去去乡乡下下别墅的路上别墅的路上PCRPCR技术的创建技术的创建1920PCR从构想成为现实1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。PCRPCR技术的创建技术的创建212294949494变性变性变性变性5555退火退火退火退火Mullis的构思1983年PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理有关有关PCRPCR反应反应5533XX延伸延伸延伸延伸（DNADNADNADNA聚合酶）聚合酶）聚合酶）聚合酶）5523949455553737?24Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus) )酶酶酶酶活活活活性性性性( ( ( (% % % %) ) ) )温度温度温度温度() 40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20Saiki, 1988年年PCRPCR技术的发展技术的发展25727294945555PCRPCR循环循环循环循环普通普通PCRPCR仪、梯度仪、梯度PCRPCR仪仪全新全新4 4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCRPCR仪仪261988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。PCRPCR技术的发展技术的发展27Kary B. Mullis（1944）28PCRPCR仪的变迁仪的变迁三个水浴锅，用手移动 （Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却 （PE，1988）电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块 机械手 （Strategene，1994）半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf）空气加热 (Roche)梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR)全新4通道实时荧光定量PCR仪普通PCR仪、梯度PCR仪291 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过过过 程程程程变变变变 性性性性退退退退 火火火火延延延延 伸伸伸伸30经典循环参数（500bp以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5min30次72 7min72 7min4 forever4 forever31PCR技术的特点灵敏度高灵敏度高1.1.3030轮循环轮循环, ,扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）2.2.将模板从皮克将模板从皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平3.3.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞4.4.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个PFUPFU5.5.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌特异性强特异性强 引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性快速简便快速简便 一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4小时即可完成扩增小时即可完成扩增32生物学基础研究目的基因扩增和鉴定 、DNA测序、定点突变医学临床应用遗传疾病基因诊断、致病病原体检测 、组织配型人类基因组工程遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱法医学物证鉴定个体识别、亲子鉴定其他动植物检疫、系统进化研究、分子考古学PCRPCR的应用领域的应用领域33分子克隆分子克隆（目的基因的获取和鉴定目的基因的获取和鉴定）重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段PCRPCR技术应用于科学研究技术应用于科学研究3455Bam H IBam H IEcoR IEcoR IBam H IBam H IEcoREcoR I IPCR(5端引入限制酶识别位点端引入限制酶识别位点)35n n 围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的K5K5缺失突变体缺失突变体缺失突变体缺失突变体（PCRPCR缺失突变）缺失突变）缺失突变）缺失突变） Yang X（杨霞）（杨霞）, et al. J Cell Mol Med (IF:5.2), 2010. PCRPCR技术应用于科学研究技术应用于科学研究362、临床基因诊断、临床基因诊断A内源性病变基因正常人A病 人PCRPCR技术应用于临床诊断技术应用于临床诊断37遗传疾病的基因诊断 基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成不平衡38A正常人正常人病病 人人正正常常病病人人A39病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)40登革病毒的检测登革病毒的检测41DMD：人类肌营养不良基因：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失42PCR-RFLPPCR-RFLP法：法：(PCR(PCR产物限制性酶切片断多态性分析产物限制性酶切片断多态性分析) ) Ras癌基因限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶43突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶44正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳45个体识别；亲子鉴定方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体DNA测序PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定46性别鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性47n PCR-STR(short tandem repeat)多态性检测多态性检测PCR；电泳检测PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定48现场血迹现场血迹现场血迹现场血迹 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人1 1 1 1 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人2 2 2 2 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人3 3 3 3个体识别PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定49父父父父 父父父父 子子子子 母母母母亲子鉴定PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定501：Marker2：阳性模板：阳性模板3：待测样品：待测样品14：已确诊乙肝病人样品：已确诊乙肝病人样品5: 待测样品待测样品26: 待测样品待测样品37: 阳性模板阳性模板结果分析结果分析 阴性阴性阴性阴性乙肝病毒基乙肝病毒基因携带者因携带者51n PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多态性检测多态性检测PCR；电泳检测523VNTR位于该基因3端下游第2个PolyA信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种ApoB基因3VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在4001200bp之间.根据重复序列的内部结构分为两类：ATAATTAAATATTTT，称为X型；ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T），又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。apoB3VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成。有关有关3 VNTR多态性多态性53小小 结结p 掌握掌握PCR技术的原理及基本步骤技术的原理及基本步骤p 熟悉熟悉apoB基因多态性的基本原理和操作步骤基因多态性的基本原理和操作步骤p 了解了解PCR技术的广泛应用技术的广泛应用54思思 考考 题题 Taq DNA 聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶链式反应？链式反应？ 根据自己的实验观察，你认为哪些事项是根据自己的实验观察，你认为哪些事项是 PCR 操作成功的关键所在？操作成功的关键所在？551 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR2) 2) 2) 2) 反向反向反向反向PCRPCRPCRPCR3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR4 4 4 4）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR5 5 5 5）逆转录）逆转录）逆转录）逆转录PCRPCRPCRPCR6 6 6 6）原位）原位）原位）原位PCRPCRPCRPCR7) 7) 7) 7) 荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR PCR的类型56 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物制性引物, ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制关键是限制 性引物的绝对量。性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 不对称不对称PCR57 高浓度引物低浓度引物58反向反向PCR (reverse PCR) PCR (reverse PCR) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段对某个已片段对某个已知知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。 可可对对未未知知序序列列扩扩增增后后进进行行分分析析, ,如如探探索索邻邻接接已已知知DNADNA片片段段的的序序列列；用用于于仅仅知知部部分分序序列列的的全全长长cDNAcDNA的的克克隆隆, ,扩扩增增基基因因文文库库的的插入插入DNADNA；建立基因组步移文库。；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列59已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶60多重多重PCRPCR（复合（复合PCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。61电电电电泳泳泳泳引物引物1234123462DMD：人类肌营养不良基因：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失63LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记, ,用以直观地检用以直观地检测目的基因。测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 464标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物65锚定锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）PCRPCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列的局限：需了解靶基因片段两侧的序列 对于未知序列怎么办？对于未知序列怎么办？66cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增67PCRPCR固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作68原位原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来来扩增细胞内的目的片段扩增细胞内的目的片段, ,在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下, ,利用一些特定的利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列69既既往往鉴鉴定定细细胞胞内内特特异异序序列列一一般般采采用用原原位位杂杂交交（ISHISH）, ,但但在在每每个个细细胞胞中中目目的的片片段段的的拷拷贝贝数数少少于于1010的的情情况况下下, ,该该方方法法的的敏敏感感度度就就明明显显下下降降。而而标标准准的的PCRPCR则则可可扩扩增增出出细细胞胞内内单单拷拷贝贝的的序序列列, ,敏敏感感度度很高很高, ,但却未能与细胞形态学研究相结合。但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCRISPCR则可把这两者结合起来则可把这两者结合起来, ,成为细胞学诊断中一种崭新的成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内以及分析细胞内RNARNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。胞的潜在感染方面也具有重要意义。 原位原位PCR的作用的作用70操作步骤1. 1. 细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后后便便适适于于一一般般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2. PCR2. PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3. 3. 原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达71逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增72基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链73琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳74荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, ,对对PCRPCR产物进产物进行标记跟踪行标记跟踪, ,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程, ,结合相应的软件可以结合相应的软件可以对结果进行分析对结果进行分析, ,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR仪仪仪仪 荧光定量荧光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的统的PCRPCR仪仪, ,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。75荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET) 引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) Amplifluor (Intergen)765353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 775353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 78RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationTaqman Probe79RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）80荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控, ,能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加, ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合, ,提高了提高了PCRPCR反应反应的特异性的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性全程监控全程监控, ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便, ,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶81