第二节第二节 大肠杆菌的培养和分离实验大肠杆菌的培养和分离实验思考？思考？ 1.培养大肠杆菌需要配制培养基，培养基中应培养大肠杆菌需要配制培养基，培养基中应该添加哪些营养成分？培养基如何灭菌？该添加哪些营养成分？培养基如何灭菌？ 2.若大肠杆菌和其他微生物混杂在一起，如何若大肠杆菌和其他微生物混杂在一起，如何获得大肠杆菌纯种？获得纯种后如何保存？获得大肠杆菌纯种？获得纯种后如何保存？ 3.如何处理大肠杆菌便于在显微镜下观察？如何处理大肠杆菌便于在显微镜下观察？实验主要原理实验主要原理1.1.培养大肠杆菌的原理：培养大肠杆菌的原理： 大肠杆菌的代谢类型为异养、兼性厌氧型，培养基中大肠杆菌的代谢类型为异养、兼性厌氧型，培养基中应加入有机碳源、氮源、水和无机盐。培养时应提供应加入有机碳源、氮源、水和无机盐。培养时应提供有氧环境。有氧环境。 牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏蛋白胨培养基配方： 牛肉膏牛肉膏5g5g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，氯化钠，氯化钠5g5g，（，（20g20g琼脂）加水琼脂）加水定容至定容至1000mL1000mL2.2.平板划线法分离大肠杆菌的原理平板划线法分离大肠杆菌的原理用接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐渐稀释用接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐渐稀释分散到培养基的表面。经多次划线后，可以分离由一个细胞繁分散到培养基的表面。经多次划线后，可以分离由一个细胞繁殖而来的单菌落殖而来的单菌落此法可将细菌分为两大类：此法可将细菌分为两大类： 不被脱色而保持不被脱色而保持蓝紫色者为蓝紫色者为 革兰氏阳性菌（革兰氏阳性菌（G G+ +）；）； 被脱色后又被染上被脱色后又被染上红色者为红色者为 革兰氏阴性菌（革兰氏阴性菌（G G- -）。大肠杆菌大肠杆菌( (革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌) )金黄葡萄球菌金黄葡萄球菌( (革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌) )细细菌菌先先经经碱碱性性染染料料结结晶晶紫紫染染色色，再再经经碘碘液液媒媒染染（以以增增加加染染料料与与细细胞胞的的亲亲和和力力）后后，用用酒酒精精或或丙丙酮酮脱色脱色，再用，再用番红复染番红复染。3.3.革兰氏染色，使大肠杆菌便于观察的原理革兰氏染色，使大肠杆菌便于观察的原理实验目的实验目的 1.配制配制牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基，进行高固体、液体培养基，进行高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌 2.掌握倒平板技术。掌握倒平板技术。 3.利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增。利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增。4.用平板划线法在固体培养基上进行接种用平板划线法在固体培养基上进行接种 5.培养微生物并观察大肠杆菌的单菌落培养微生物并观察大肠杆菌的单菌落 6.显微镜下观察大肠杆菌的形态显微镜下观察大肠杆菌的形态 7.利用斜面培养基和划线获得的单菌落进行纯培利用斜面培养基和划线获得的单菌落进行纯培养。养。 实验流程实验流程 LBLB液体液体LBLB固体固体50ml50ml培养基配培养基配 制和灭菌制和灭菌用于大肠杆菌扩增用于大肠杆菌扩增扩大培养（代替斜面菌种）扩大培养（代替斜面菌种）倒平板，大肠杆菌划线培养倒平板，大肠杆菌划线培养获得单菌落（纯种分离）获得单菌落（纯种分离）100mL100mL 5mL5mL 挑取单菌落或液体培养基，制挑取单菌落或液体培养基，制片，显微镜下观察大肠杆菌片，显微镜下观察大肠杆菌 1.1.培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌 称量称量溶化溶化称量称量溶化溶化调调pH pH 分装分装高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌搁斜面搁斜面分装分装加棉塞加棉塞包扎包扎高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌搁置斜面搁置斜面2.2.无菌操作倒平板无菌操作倒平板3.3.平板划线法接种平板划线法接种4.374.37恒温箱中恒温箱中倒置倒置培养培养1224h1224h倒置培养的原因：倒置培养的原因： 培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并凝结成培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并凝结成水滴留在培养皿的盖上；水蒸气形成的水滴会落入水滴留在培养皿的盖上；水蒸气形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。再分成单菌落，达不到分离的目的。5.5.利用液体培养基扩大利用液体培养基扩大 培养大肠杆菌培养大肠杆菌摇床上震荡培养摇床上震荡培养 目的：目的： 6.6.显微镜下观察染色后显微镜下观察染色后 的大肠杆菌的大肠杆菌增加溶氧增加溶氧 使菌体和培养液充分接触使菌体和培养液充分接触实验结果观察和分析实验结果观察和分析 1.1.观察平板划线法获得的单菌落观察平板划线法获得的单菌落请分析没有出现单菌落的可能原因？请分析没有出现单菌落的可能原因？菌液浓度大菌液浓度大 划线次数少划线次数少 培养时间长培养时间长2.2.观察液体培养基的浑浊度观察液体培养基的浑浊度空白培养基空白培养基生长细菌的培养基生长细菌的培养基3.3.显微镜下观察经革兰氏染色的大肠杆菌显微镜下观察经革兰氏染色的大肠杆菌1.1.平板划线法平板划线法分离微生物纯种的方法分离微生物纯种的方法2.2.液体稀释涂布法液体稀释涂布法1.1.实验结束后，用过的细菌培养基等如何处理？实验结束后，用过的细菌培养基等如何处理？ 思考与讨论思考与讨论 加热灭菌后废弃，不能直接倾倒到无机环境中，防止加热灭菌后废弃，不能直接倾倒到无机环境中，防止细菌细菌 污染污染 2.如何保存菌种？如何保存菌种？在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再划线接种在在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再划线接种在空白空白 斜面上，斜面上，37培养培养24h后，后，4冰箱保存。冰箱保存。3.未接种的培养基表面有菌落出现，说明什么问题？未接种的培养基表面有菌落出现，说明什么问题？培养基灭菌不彻底培养基灭菌不彻底4.在培养后如何判断是否有杂菌污染？在培养后如何判断是否有杂菌污染？ 如出现不同形态、颜色、粘稠度的菌落可能被污染如出现不同形态、颜色、粘稠度的菌落可能被污染