1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1基因工程的概念n基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。需要的新的生物类型和生物产品。 基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物23抗虫害的玉米抗虫害的玉米转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄转基因转基因鲑鱼鲑鱼基因工程产品4转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激乳汁中含有人生长激素的转基因牛素的转基因牛( (阿根廷阿根廷) )5基础理论和技术的发展催生了基因工程 nDNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明nDNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立n遗传密码的破译遗传密码的破译n基因转移载体的发现基因转移载体的发现n工具酶的发明工具酶的发明nDNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明nDNA体外重组的实现体外重组的实现n重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功n第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世nPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明6DNA重组技术的基本工具 n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶准确切割准确切割DNA的工具，的工具， 即即“分子手术刀分子手术刀” ” nDNA连接酶连接酶DNA片段的连接工具片段的连接工具 即即“分子缝合针分子缝合针” n基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因转移工具基因转移工具 即即“分子运输车分子运输车” ” 7一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”分分 布：布： 主要从原核生物中分离纯化得到主要从原核生物中分离纯化得到作用特点：作用特点： 特异性，即识别特异性，即识别双链双链DNA分子的分子的 特定核苷酸序列，切割特定切点特定核苷酸序列，切割特定切点切切 点：点： 每一条链中每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键磷酸二酯键种种 类：类： 约约4000种种举举 例：例： EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，序列， 并在并在G和和A之间切开之间切开结结 果：果：形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端8限制酶所识别的序列有什么特点 n限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基个碱基还是还是4个碱基，都可以找到一条中心轴个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复排列的。反向对称重复排列的。9限制性内切酶限制限制酶酶101.什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线两侧从识别序列的中心轴线两侧切开时，切开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的两条单链的切口，带有几个切口，带有几个伸出的核苷酸，伸出的核苷酸，他们之间他们之间正好正好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端。黏性末端。11DNADNA被限制酶切断后有两个反向互补的被限制酶切断后有两个反向互补的“黏黏性末端性末端”。被同一种限制切断的几个。被同一种限制切断的几个DNADNA具有相具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。同的黏性末端，能够通过互补进行配对。122.什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处从识别序列的中心轴线处切开时，切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平整的，这样的切口叫平末端平末端。133.限制酶在原核生物中的作用 n原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利侵入时，会利用限制酶将外源用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。n含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。不能将其切开。 14二、DNA连接酶“分子缝合针”1.1.连接酶有两种：连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为EcoliEcoli连接酶。连接酶。另一种是从另一种是从T4T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T T4 4连接酶连接酶。2.2.这两种连接酶催化反应基本相同，这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链都是连接双链DNADNA的缺口，的缺口，而不能连接单链而不能连接单链DNADNA。3.Ecoli3.Ecoli连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端； T T4 4连接酶既可连接酶既可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平末端。平末端。15DNA连接酶“分子缝合针”nDNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？ 16答：答：不是一回事。（在相邻核苷酸的不是一回事。（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5位碳原位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成）子上所连磷酸基团的羟基之间形成）（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端末端 的羟基上，形成磷酸二酯键；的羟基上，形成磷酸二酯键； 而而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸链为模板，将单个核苷酸通过磷酸 二酯键形成一条与模板链互补的二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；链； 而而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。双链上的两个缺口同时连接起来。 因此因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。17三、基因的载体“分子运输车”2.载体必须具备的条件：载体必须具备的条件： 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 具有某些标记基因，便于进行筛选；具有某些标记基因，便于进行筛选； （如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 对受体细胞无害。对受体细胞无害。1.载体的作用：载体的作用： 将外源基因转移到受体细胞中去。将外源基因转移到受体细胞中去。 利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。3.常用的载体有：常用的载体有： 质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等18质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外中，是细菌染色体外能够自主复制的很小能够自主复制的很小的环状的环状DNA分子，分子，大小只有普通细菌拟大小只有普通细菌拟核核DNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造19能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。20练习练习1.在基因工程中，切割运载体和在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（ ）A.同种限制酶同种限制酶 B. 两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D. 两种连接酶两种连接酶212.不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习223.基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基互补配对的步骤是基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习练习23 大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)EcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，序列，并在并在G G和和A A之间切开形成黏性末之间切开形成黏性末端。端。 Sma Sma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，并序列，并在在C C和和G G之间切割形成平末端之间切割形成平末端 。24 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A25